中のタンパク質 - タンパク質相互作用を特定する<em&gt;ショウジョウバエ</emタンデムアフィニティー精製（TAP）による&gt;アダルトヘッド

要約

ショウジョウバエは、その強力な遺伝子操作のためではなく、詳細な生化学的解析のその適合性のために有名である。ここでは、ハエの脳から、目的の任意のタンパク質の相互作用パートナーを識別するために、TAPベースの手順を提示する。この手順では、潜在的な研究の新たな道につながることができます。

要約

キイロショウジョウバエ （ショウジョウバエ）を用いて行っ遺伝子スクリーニングは、生物科学の前に数々のマイルストーンの発見をした。しかし、遺伝学的解析から得られた知識を広げることを目的とし、生化学的スクリーンの使用は、ごく最近になって調査した。ここでは、成体ハエ頭部から目的の任意のタンパク質と会合したタンパク質複合体を精製する方法を記載している。この方法は、 インビボでのフライニューロンにおけるタンデムアフィニティー精製（TAP）タグと融合ベイトタンパク質を発現するために、ショウジョウバエ GAL4/UASシステムを活用し、その後、本来において確立ものと類似のTAP手順を用いた精製を2回を実装相互作用するタンパク質複合体を精製する酵母^1。この手順の最後に、複数のタンパク質複合体の混合物は、その分子のアイデンティティ質量分析によって決定することができるが得られる。候補タンパク質の検証は、Rの恩恵を受けるesourceやハエにおける機能喪失研究を行うのしやすさ。同様のアプローチは他のハエ組織に適用することができる。我々はフライモデル系における遺伝子操作の組み合わせと、このプロテオミクスアプローチは、神経生物学とそれ以降の分野で根本的な問題に取り組むための途方もない可能性を秘めていると信じています。

概要

特定の生物学的プロセスを仲介する分子経路やネットワークを定義することは、生物医学研究の究極の目標の一つである。フライ遺伝学者は、特にと並行して、一緒に作業したり、上流または関心のある遺伝子の下流因子を同定するために、遺伝子スクリーニング（エンハンサーとサプレッサー画面の両方を）修飾子、フォワード遺伝学に大きく依存してきた。しかし、フォワード遺伝学の画面はしばしば、その損失関数の唯一の得点にくい微妙な異常を引き起こす機能的冗長性と補償で不可欠な変異した場合に、初期の発達段階で致死性の原因となる遺伝子、または遺伝子を同定することができない。この困難を克服する1つの方法は、直接的なタンパク質 - タンパク質相互作用をスクリーニングするためのものである。 10年以上のため、 などの酵母ツーハイブリッド、ファージディスプレイ、化学的架橋、共同IP、タンデムアフィニティー精製（TAP）を含む生化学的方法、の成長のリスト。タンパク質を調査するために使用されている- タンパク質相互作用。これらのアプローチはそれぞれ長所と感度と特異性に関しての弱点の独自のセットを持っています。中でも、TAP法は、近生理学的条件下で物理的相互作用の検出を可能にする特異性および整合性^を維持し^{、2 3,4を}解析し、高スループットを拡張する能力を含む。

TAP法は、もともとRigautand同僚¹によって、酵母で開発されました。この方法では、対象のタンパク質は、TAPタグで表現される。 TAPタグは、2つの独立した親和性結合ドメインを保有する：タンパク質IgGおよびカルモジュリン結合ドメインに結合するドメイン。 2つのドメインはTEV（タバコエッチウイルス）切断部位によって分離されている。アフィニティ精製の ​​二つの独立したラウンドが十分に非特異的結合を減少させ、特定のバインディング^1を豊かにするためのこのような組み合わせが可能です。この例では、TAP法は非常に強力であるメト外因性タンパク質を過剰発現すると、通常、その内因性の相手との複雑なないタンパク質と結合することをより受けやすいことがありますが、与えられたタンパク質の生体内相互作用に識別するためのD。その開発以来、TAP法は、in vivoモデル系^6-9 の細胞培養ベースのシステム^5,6およびその他を含む多くの他のシステムに適用されている。ここでは、 ショウジョウバエのTAP法の適応を説明します。まず、目的の遺伝子のN末端またはC末端のいずれかに、TAPタグのクローニングとの融合を容易にするためのpUAST-NTAPとのpUAST-CTAPベクトルを生成する。 UAS-TAP-タグ化導入遺伝子は、次いで、ニューロンGAL4ドライバ¹⁰の制御下で、神経系で発現される。次に、成体ハエの頭部に多数の神経細胞の高い含有量を有​​し、サイズの違いに基づいて、凍結後に体の他の部分から分離することが容易である、収集することができる。大人のヘッドは、均質化され、BをクリアYシーケンシャル遠心分離し、上澄み液は、後述のTAPの手順に従うものとします。

プロトコル

1。 UAS-TAPタグトランスジェニックハエを生成

1. のpUAST-TAPタグDNA構築物を生成します。
   1. TAPタグはタンパク質の構造/機能に基づいて、に融合されるべきベイトタンパク質のどちら側（N-またはC-末端）を決める。詳細についての説明を参照してください。
   2. それぞれ、N-またはC-末端タグ付加UAS-TAPトランスジーンを生成するためのpUAST-又はNTAPのpUAST-CTAPベクターのマルチクローニング部位（MCS）への目的の遺伝子のcDNAコード領域をサブクローニングする。詳細な地図と使用可能な制限部位とリーディングフレームについては、図1を参照してください。
2. UAS-TAPタグトランスジェニックハエを生成します。
   1. Pエレメント媒介挿入^11を使用して、標準的なプロトコルに従ってトランスジェニックハエを生成します。注射サービスの数が市販されている。
   2. それぞれの個々のトランスジェニック系統に神経GAL4ドライバー（ すなわち、BG380-GAL4）を渡り、タンパク質の発現レベルを決定する（ペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ抗体を用いた）ウエスタンブロットによる各ラインのおよび/または（抗TAP抗体で）免疫染色。一般的には、内因性タンパク質に近いタンパク質発現レベルを有するトランスジェニックラインは、TAPの手続きをお勧めします。詳細についての説明を参照してください。
   3. 目的の遺伝子の機能喪失変異体が利用可能な場合は、TAPタグ化導入遺伝子の機能性を確認するためのレスキュー実験をPerformGAL4/UAS-based。ほぼ次のTAP実験に変異体の表現型を救出することができ、導入遺伝子を選択してください。

2。 TAP手順のためのサンプルを調製

1. フライサンプルの拡大を容易にするために、神経Gal4ドライバー（ 例：BG380-GAL4）と選択したTAPタグ導入遺伝子の両方を運ぶハエの株式を生成します。 GAL4ドライバと上記の組み合わせは生存と成長の欠点の原因となるまれにUAS-導入遺伝子のクロスのF1子孫を収集します。
2. 小規模のサンプルを収集して、TAPタグ化タンパク質を可溶化するための溶解条件を最適化します。
   1. 非イオン性界面活性剤NP-40（0.1％）、NaDOC（0.1％）およびTriton X-100（0.05から0.5パーセント）の組み合わせを用いて溶解緩衝液のシリーズを作る。詳細については、表1および説明を参照してください。
   2. CO2のパッドの上に、ハエを表現TAPトランスジーンから20大人の頭を解剖し、各溶解バッファー条件をテストするために1.5ミリリットルチューブでそれらを収集するために＃5鉗子を使用しています。
   3. チューブに100μlの試験溶解バッファーを追加し、プラ​​スチック乳棒で上下になでるとで頭を均質化し、他の100のULテストバッファを追加します。
   4. 10分（4℃）のために21,500×gで頭溶解物を回転し、遠心分離後の上清とペレットを分離する。それぞれの上清の30 ULにペレットを10μlの4X SDSローディングバッファに25 ulの2X SDSローディングバッファーを追加します。
   5. 5分間の2サンプルを沸騰して並べ、それらを分析側PAP抗体でSDS-PAGEおよびその後のウエスタンブロットを用いて。ペレットVS上清中のTAP-タンパク質レベルの比で溶解度を決定する。
3. 大規模なサンプルを作成
   1. 大人のハエを展開し、収集します。
      1. ボトルにneuronal-GAL4/UAS-TAP-transgeneの株式を展開し、累積250ボトル収集に使用されるまで、3日ごとにボトルを反転させます。
      2. 収集1-3日齢の成人が50ミリリットルコニカルチューブに飛んで、すぐにDeep Freezeのハエに液体窒素中にチューブを入れる。 -80℃の冷凍庫にハエを格納します。ハエの量は50ミリリットルチューブの2/3を超えてはならないことに注意してください。
   2. （粉末ドライアイスの上に、この手順を実行する）フライヘッドを収集します。
      1. 予冷キュラーシーブおよび-80℃の冷凍庫から、乳鉢と乳棒を取り出して、理想的には大規模な氷のバケツの中に、ドライアイス上に置く。日に第25号2米国標準試験ふるいを積み重ねEの上下に40番。
      2. 凍結したハエを取り出し、液体窒素にドロップし、約10分間そこにハエを保つ。ボルテックスまたは体から頭、脚、翼を破るために積極的にチューブを横に振る。
      3. トップふるいに混合を注ぎ、その後、一緒に両方のモレキュラーシーブを押しながら積極的にモレキュラーシーブを振る。篩い分けした後、遺体は、トップふるいに滞在ヘッドが下ふるい上に保持されます飛ぶ、と脚、翼、および他の残骸は、ドライアイスに落ちるでしょう。 2モレキュラーシーブを分離し、慎重に冷たい乳鉢にハエの頭を転送します。
   3. フライヘッドを均質化する
      1. ドライアイスの上に、氷の上にあらかじめ冷却した15ミリリットルのガラスダウンス組織グラインダーに粉を転送した後、粉末状の粒子に乳鉢と乳棒で頭を挽く。
      2. ヘッドサンプルがそれに注いだの前後グラインダーの重量を測定してから、どのくらいのヘッドSAMP計算LEは重さがあります。ハエ頭部6-15グラムの総タンパク質の発現レベルに応じて調整する各TAP実験のために十分であろう。乳棒を上下に行くとすることが容易であるまで、粉末に氷冷した均質化緩衝液の15ミリリットル（ステップ2.2に最適化された溶解バッファー）を追加してから、大きなクリアランス乳棒でストローク。すべての回で、氷上でガラス粉砕機を保管してください。
   4. TAPのために上清を準備
      1. 〜5万×gで（4℃）で20分間の高速遠心分離管とスピンにホモジネートを転送する。新しい高速遠心チューブに上清を移し、遠心分離をもう一度繰り返します。
      2. 超遠心チューブに上清を移し、さらに上清をクリアするには40分〜25万XGスピンを行う。上清を超遠心分離後のタンデムアフィニティー精製法の準備ができています。

3。 TAP精製

以下のセクションでは、セラフィンラボタップから導出されたprotocol ¹² (http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf ）

1. ビーズのIgGアフィニティー精製を行う
   1. サンプルは遠心分離されている間のIgGセファロースビーズを準備します。 10ミリリットル冷たいのIgG洗浄緩衝液15ミリリットルファルコンチューブに400μLのIgGビーズ3回洗浄します。各洗浄のために、2分間穏やかチューブを揺するし、別の2分間千×gでビーズをスピンダウン。 3回目の洗浄の最後に、緩衝液を除去し、チューブ内のビーズのみを残す。
   2. 注意深くのIgGビーズを含有する15mlチューブに透明な上清（〜15ml）に移す。 2時間旋回装置上で4℃でビーズや脳溶解ミックスをインキュベートする。
   3. 低温室で約15ミリリットルの総容量で、清潔で、空のミクロカラムを設定します。着実に塔にミックスを注ぐことにより、のIgGビーズ混合物をロードし、あらゆるトラップしないようにしよう空気が列の中に泡。ビーズはゆっくりと重力流によって排出する列バッファに定住することができます。
   4. 脳溶解物のすべてが決着IgGカラムを流れた後に冷えたIgGの洗浄緩衝液10mlで十分にカラムを洗浄。洗浄2Xを繰り返します。注意：空気中のビーズ乾燥させることはありません。
2. TEV切断を行う
   1. 3回目の洗浄後、10ミリリットルTEV切断緩衝液で再びカラムを洗浄。このステップは、TEV切断用の餌複合体をsequestratesのIgGビーズを準備します。
   2. TEVバッファの最後の一滴が、出ドリップ流れを遮断する列の一番下にキャップを入れて、列にTEV酵素の130単位を含有する1.3ミリリットルTEVバッファーを追加して、安全に上部のキャップをしようとしている直前にコラム。列は両端でよく密封されていることを確認してください。
   3. TEV酵素はTEV部位でペプチドを切断およびタンパク質複合体WHIのを放出できるようにするために2時間18度Cでカラムを回転させるルタンパク質の背後のIgGセファロースビーズに結合ドメインペプチドを残す。
3. カルモジュリンビーズアフィニティー精製を行う
   1. IgGのビーズをTEV酵素とインキュベートしている間にカルモジュリンビーズを準備します。冷たいカルモジュリン結合バッファー10mlで毎回、15ミリリットルファルコンチューブ3Xに200μlのカルモジュリンビーズを洗浄します。各洗浄のために、ゆっくりと旋回装置上で2分間、チューブを揺らし、その後、2分間千×gでビーズをスピンダウン。 3回目の洗浄の最後に、すべてのバッファーを取り出して試験管内のビーズのみを残す。
   2. TEVのインキュベーション（ステップ3.2.3）の終了時に、戻って寒い部屋にIgGカラムを返し、まっすぐ上に設定します。ビーズは、10分のために解決しましょう​​。
   3. トップキャップを外し、ボトムキャップした後、15ミリリットルファルコンチューブ内の1.3ミリリットルのTEV切断産物を収集します。バッファが完全に排水してみましょう。列のデッドボリュームを押し出す列に追加の200μlのTEVバッファーを追加し、Fを収集同一チューブ内の低アウト。
   4. 上記の収集された1.5ミリリットルTEV切断製品にバッファし、4.5μlの1 M _塩化カルシウムカルモジュリン_結合の4.5ミリリットルを追加します。 _塩化カルシウム_は、TEVバッファー中のEDTAを滴定するのに役立つ。カルモジュリンビーズを含むチューブに6ミリリットルの混合物を移し、1時間旋回装置上で4℃でチューブを回転させます。
   5. 低温室で約10ミリリットルの総容量を持つ別の清潔で、空のミクロカラムを設定します。列にカルモジュリンビーズ混合物をロードし、それが重力によって排出させる。
   6. すべてのソリューションが確定カルモジュリンカラムに流れた場合には、列に冷たいカルモジュリン結合緩衝液10mlでそれぞれ2回洗浄する。注意：カルモジュリンビーズを乱さないよう、洗浄の際に、可能な限りフラットなビーズの表面を維持しようとします。
4. カルモジュリン列から餌複合体を溶出させる。
   右洗濯後、200μlの冷たいCalmoduの5画分とカルモジュリンカラムを溶出LINの溶出バッファー。各分画のために、ゆっくりとカラムに溶出緩衝液200μlを追加し、マークされた1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに溶出液を収集します。この4倍を繰り返します。
5. SDS-PAGEによるタンパク質複合体の分析
   1. 5分（約30μL）のそれぞれから少量をとり、SDSローディングバッファーを追加します。 5分間のサンプルを沸騰させ、勾配（4から15パーセント）のSDS-PAGEゲル中のタンパク質の分子マーカーを有するサンプルを並べてロードします。
   2. サンプルは完全にゲルで解決した後、電気泳動を停止し、そのような^13の染色「ブルーシルバー」などの任意のG-250をベースに敏感コロイド状クマシー染色手順でゲルを染色。それは、その後の質量分析と完全に互換性がないため、銀染色はオプションですが、好ましくない。このような精製されたタンパク質複合体の分子のアイデンティティを発見するための質量分析などのさらなる分析のために-80℃の冷凍庫に溶出液の残りの部分を格納します。 SEEディスカッション。

結果

ここでは、ハエの脳内のHighwire相互作用タンパク質を同定することに我々の努力を示しています。 Highwire（HIW）とその脊椎動物と無脊椎動物の同族体は、神経系¹⁴の開発と修復を規制する巨大なユビキチンリガーゼである。彼らは高度に保存された機能的なドメインの数を共有しています。しかし、それらの分子の行動は完全には明らかではありません。ワームで行われた作業、飛ぶ?...

ディスカッション

タンデムアフィニティー精製（TAP）法2の独立したアフィニティー精製工程を経てタンパク質複合体の単離及び濃縮を可能にするデュアル精製プロトコルを提供しています。 TAPタグの設計は、このプロトコルで提示されるものに限定されない緩衝液条件に応じて調整される場合、他のタンパク質の結合ドメインおよびモチーフも適用可能である。他のTAPタグの良い例は、哺乳類の培養細胞株

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
U.S.A. standard test sieve No. 25	Fisher Scientific	04-881-18
U.S.A. standard test sieve No. 40	Fisher Scientific	04-881-21
Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml	Kimble Chase	885300-0015
IgG sepharose beads	Pharmacia	17-0969-01
Econo-column 0.7 cm x 20 cm	Bio-Rad	737-4721
Econo-column 0.5 cm x 15 cm	Bio-Rad	737-4716
Calmodulin beads	Stratagene	214303
Coors Mortar and Pestle	CoorsTek	60311
AcTEV Protease	Invitrogen	12575-015
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
Protease Inhibitor Mix	Sigma	P8340