Identificando interacção proteína-proteína em<em&gt; Drosophila</em&gt; Chefes Adulto por Tandem Affinity Purification (TAP)

Resumo

Drosophila é famoso por sua poderosa manipulação genética, mas não para a sua adequação de análises bioquímicas em profundidade. Aqui apresentamos um procedimento baseado em TAP para identificar interagindo parceiros de qualquer proteína de interesse a partir do cérebro da mosca. Este procedimento pode potencialmente levar a novos caminhos de pesquisa.

Resumo

Telas genéticas realizadas utilizando Drosophila melanogaster (mosca da fruta) fizeram numerosas descobertas marco no avanço das ciências biológicas. No entanto, o uso de telas bioquímicas destinadas a estender o conhecimento adquirido a partir da análise genética foi explorada apenas recentemente. Aqui nós descrevemos um método para purificar o complexo de proteínas que se associa com qualquer proteína de interesse a partir de cabeças de moscas adultas. Este método tira vantagem do sistema de Drosophila GAL4/UAS para expressar uma proteína isco fundido com um tag de afinidade em tandem de Purificação (TAP) em neurónios mosca in vivo, e, em seguida, executa duas rondas de purificação utilizando um procedimento de TAP semelhante à originalmente estabelecido em levedura ¹ para purificar o complexo de proteína que interage. No final deste procedimento, uma mistura de vários complexos de proteína é obtido cujas identidades molecular pode ser determinada por espectrometria de massa. Validação das proteínas candidatos serão beneficiados com a resource e facilidade de realizar estudos de perda de função em moscas. Abordagens semelhantes podem ser aplicados a outros tecidos de moscas. Acreditamos que a combinação de manipulações genéticas e esta abordagem proteômica no sistema modelo mosca tem um tremendo potencial para a resolução dos problemas fundamentais no campo da neurobiologia e além.

Introdução

Definindo as vias moleculares ou redes que mediam um processo biológico em particular é um dos objetivos finais da pesquisa biomédica. Fly geneticistas têm dependido fortemente de genética para a frente, especialmente modificador telas genéticos (tanto Enhancer e telas supressores), para identificar os fatores que trabalham em conjunto, em paralelo com, ou a montante ou a jusante de um gene de interesse. No entanto, as telas de genética para a frente muitas vezes não conseguem identificar genes essenciais que, quando mutado, causar letalidade em estágios iniciais de desenvolvimento, ou genes com redundância funcional e compensação cuja perda de função só causar defeitos subtis que são difíceis de marcar. Uma maneira de superar essa dificuldade é para triagem de interações proteína-proteína diretos. Por mais de uma década, uma lista crescente de métodos bioquímicos, incluindo levedura de dois híbridos, display de fagos, cross-linking química, Co-IP, Tandem Affinity Purification (TAP), etc. têm sido utilizados para investigar proteína-proteína interações. Cada uma dessas abordagens tem seu próprio conjunto de pontos fortes e fracos em relação à sensibilidade e especificidade. Entre eles, o método permite que a TAP para detecção da interacção física sob condições quase fisiológicas, preserva a especificidade e consistência ² e inclui a capacidade de estender a análise de alto rendimento ^{de 3,4.}

O método TAP foi originalmente desenvolvido na levedura por colegas Rigautand ^1. Neste método, uma proteína de interesse é expressa com uma etiqueta TAP. A etiqueta TAP abriga dois domínios de ligação de afinidade independentes: uma proteína de um domínio que se liga a IgG e um domínio de ligação à calmodulina. Os dois domínios estão separados por um local de clivagem de TEV (Tobacco Etch Vírus). Essa combinação permite a duas rodadas independentes de purificações de afinidade para reduzir suficientemente ligações inespecíficas e enriquecer vinculações específicas ^1. Para este exemplo, o método TAP é um poderoso metodod para identificar interacções in vivo de uma determinada proteína, embora o sobre-expressam a proteína exógena pode torná-lo mais propenso a associar-se com proteínas que normalmente não fazem complexo com o seu homólogo endógeno. Uma vez que o seu desenvolvimento, o método da TAP foi aplicado em muitos outros sistemas, incluindo--base de cultura de células e outros sistemas de ^5,6 in vivo, os sistemas modelo ^{de 6-9.} Aqui nós descrevemos a adaptação do método TAP em Drosophila. O primeiro gerar pUAST-NTAP e pUAST-CTAP vectores para facilitar a clonagem e a fusão da etiqueta TAP ou o N-ou C-terminal do gene de interesse. A-marcado com TAP UAS transgene é, então, expresso no sistema nervoso sob o controlo de um controlador ¹⁰ de GAL4 neuronal. Em seguida, um grande número de cabeças de moscas adultas serão recolhidos, que tem elevado teor de células neuronais e são fáceis de separar a partir de outras partes do corpo, após a congelação com base em diferenças de tamanho. As cabeças adultas são homogeneizados e limpou bcentrifugações sequenciais y, e o sobrenadante é sujeito a um procedimento de TAP descrito abaixo.

Protocolo

1. Gerar UAS-marcado pela TAP Moscas transgênicas

1. Gerar pUAST marcadas pela TAP construções de DNA.
   1. Decidir qual o lado (N-ou C-terminal) da proteína isco a etiqueta TAP deverá ser fundido a, com base na estrutura / função da proteína. Veja a discussão para mais detalhes.
   2. Subclonar a região de cDNA codificadora do gene de interesse para os múltiplos locais de clonagem (MCS) dos vectores de pUAST-NTAP ou pUAST-CTAP para gerar N-ou C-terminal marcadas transgenes UAS-TAP, respectivamente. Veja na Figura 1 mapas detalhados e sítios de restrição utilizáveis ​​e quadros de leitura.
2. Gerar UAS-marcado-TAP voa transgênicos.
   1. Gerar moscas transgênicas seguindo protocolos padrão, utilizando P-mediada pelo elemento de inserção ^11. Um certo número de serviços de injecção estão disponíveis comercialmente.
   2. Atravessar neuronal condutor de GAL4 (ou seja BG380-GAL4) para cada linha transgénica individual e determinar os níveis de expressão de proteínasde cada linha por Western blot (com anticorpo anti-peroxidase Peroxidase) e / ou a imunomarcação (com anticorpo anti-TAP). Em geral, recomenda-se uma linha transgénica com um nível de expressão de proteína que é próximo da proteína endógena para procedimentos TAP. Veja a discussão para mais detalhes.
   3. PerformGAL4/UAS-based experiências de socorro para confirmar a funcionalidade dos transgenes marcadas com TAP, se a perda de função dos genes mutantes de interesse estão disponíveis. Escolha um transgene que pode salvar substancialmente os fenótipos mutantes para os seguintes experimentos TAP.

2. Preparar amostras para a TAP Procedimento

1. Criar um stock de mosca que transporta um controlador neuronal GAL4 (por exemplo BG380-Gal4) e o transgene marcado com TAP escolhido, a fim de facilitar a ampliação de amostras de moscas. Recolha as progênies F1 do piloto GAL4 ea cruz UAS-transgene em casos raros, quando a combinação acima faz com que a sobrevivência eo crescimento desvantagem.
2. Coletar amostras de pequena escala e otimizar a condição de lise para solubilizar a proteína marcadas-TAP.
   1. Fazer uma série de tampões de lise usando uma combinação de detergentes não iónicos de NP-40 (0,1-1%), NaDOC (0,1-1%) e Triton X-100 (0,05-0,5%). Ver Tabela 1 e discussão para mais informações.
   2. Em cima de um bloco de CO2, use # 5 fórceps para dissecar 20 cabeças adultas do transgene TAP expressar moscas e recolher em um tubo de 1,5 ml para testar cada condição de tampão de lise.
   3. Adicionar tampão teste de lise 100 ul para o tubo e homogeneizar as cabeças acariciando cima e para baixo com um pilão de plástico, em seguida, adicione um outro tampão teste 100 ul.
   4. Girar o lisado cabeça em 21.500 xg durante 10 minutos (4 ° C), e separar do sobrenadante e sedimento, após a centrifugação. Adicionar 25 ul de tampão de carregamento 2 x SDS ao precipitado e tampão de carregamento de 10 ul 4x SDS a 30 ul de sobrenadante, respectivamente.
   5. Ferver as duas amostras durante 5 minutos e analisam-los lado-Lado utilizando SDS-PAGE e subsequente Western Blot com anticorpo PAP. Determinar a solubilidade pela relação dos níveis de proteína-TAP em sobrenadante contra o sedimento.
3. Prepare amostra em grande escala
   1. Expandir e recolher moscas adultas.
      1. Expandir as ações neuronal-GAL4/UAS-TAP-transgene em garrafas e virar as garrafas a cada 3 dias até acumulativas 250 garrafas são usados ​​para a coleção.
      2. Colete de 1-3 dias de idade adulta voa para 50 ml tubos cônicos, coloque o tubo em nitrogênio líquido imediatamente para congelador as moscas. Armazenar as moscas em um congelador a -80 ° C. Note-se que o volume das moscas não deve ser superior a 2/3 do tubo de 50 ml.
   2. Colete cabeças mosca (executar este passo em cima de gelo seco em pó).
      1. Retire as peneiras prechilled eo almofariz e pilão do freezer -80 ° C e colocá-los em gelo seco, de preferência dentro de um grande balde de gelo. Empilhe duas peneiras de teste padrão dos EUA com um No. 25 no the superior e n ° 40, na parte inferior.
      2. Pegue as moscas congelados para fora e deixá-los em nitrogênio líquido e manter as moscas lá por cerca de 10 min. Vortex ou agitar os tubos vigorosamente para quebrar as cabeças, pernas e asas dos corpos.
      3. Despeje a mistura para o peneiro superior e, em seguida, agitar as peneiras vigorosamente, mantendo ambas as peneiras juntos. Depois de peneirado, os corpos vão ficar no topo peneira, voar cabeças serão retidos na peneira de fundo, e as pernas, asas e outros detritos vão cair para o gelo seco. Separe as duas peneiras e transferir cuidadosamente as cabeças de voar para a argamassa frio.
   3. Homogeneizar as cabeças de mosca
      1. Em cima do gelo seco, moer a cabeça com a argamassa eo pilão para partículas de pó, em seguida, transferir o pó a 15 ml de vidro Dounce Grinder tecido que foi previamente resfriada em gelo.
      2. Meça os pesos do moedor de antes e depois da amostra cabeça foi derramado nele, e em seguida, calcular o quanto o samp cabeçale pesa. Um total de 6-15 gramas de cabeças mosca será suficiente para cada experimento TAP ajuste de acordo com os níveis de expressão da proteína. Adicionar 15 ml de tampão de homogeneização gelada (lise otimizado no passo 2.2) para o pó e, em seguida, derrame com o grande pilão folga até que seja fácil para os pilão para ir para cima e para baixo. Manter o moinho de vidro em gelo em todos os momentos.
   4. Prepare o sobrenadante para a TAP
      1. Transferir o homogeneizado para um tubo de centrifugação de alta velocidade de rotação e durante 20 min a ~ 50.000 xg (4 ° C). Transferir o sobrenadante para um novo tubo de centrifugação de alta velocidade e repetir a centrifugação mais uma vez.
      2. Transferir o sobrenadante para um tubo de ultracentrifugação e executar um 40 min ~ 250.000 xg rotação para limpar ainda mais o sobrenadante. O sobrenadante está pronto para os procedimentos de purificação por afinidade em tandem após ultracentrifugação.

3. TAP Purificação

As secções que se seguem foram obtidos a partir do laboratório de TAP Séraphin protocol ¹² (http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf )

1. Realize IgG talão purificação por afinidade
   1. Prepare IgG Sepharose talão enquanto as amostras são centrifugadas. Lavar 3x 400 ul de contas de IgG num tubo Falcon de 15 ml com 10 ml de tampão de lavagem frio IgG. Para cada lavagem, balançar suavemente o tubo para 2 min, e depois girar as contas a 1.000 xg por mais 2 min. No final da terceira lavagem, remover o tampão e deixar apenas as esferas no tubo.
   2. Transferir cuidadosamente o sobrenadante clarificado (~ 15 ml) para o tubo de 15 ml contendo as contas de IgG. Incubar os grânulos e mistura lisado cérebro, a 4 º C em um nutator durante 2 horas.
   3. Configurar uma coluna micro limpo e vazio com cerca de 15 ml de volume total na câmara fria. Coloque a mistura do grânulo IgG por constantemente despejando a mistura para a coluna, não tentar prender qualqueras bolhas de ar no interior da coluna. Permitir que as contas para se instalar na coluna e no tampão para drenar lentamente por fluxo de gravidade.
   4. Lavar cuidadosamente a coluna com 10 ml de tampão de lavagem frio IgG depois de todo o lisado cérebro fluiu através da coluna de IgG resolvido. Repita o 2x lavagem. Nota: nunca deixar secar o talão no ar.
2. Realize TEV clivagem
   1. Após a terceira lavagem, lava-se a coluna outra vez com 10 ml de tampão de clivagem de TEV. Esta etapa prepara o talão IgG que seqüestra a complexa isca para TEV clivagem.
   2. Imediatamente antes da última gota de tampão de TEV é sobre a escorrer para fora, colocar uma tampa na parte inferior da coluna para bloquear o fluxo, adicionar 1,3 ml de tampão de TEV contendo 130 unidades da enzima de TEV para a coluna, e em seguida tampão de forma segura a parte superior do a coluna. Certifique-se de que a coluna é bem fechadas em ambas as extremidades.
   3. Rodar a coluna a 18 º C durante 2 horas para permitir que a enzima de TEV para clivar o péptido no local da TEV e libertar a proteína whi complexole deixando para trás a proteína de um péptido de domínio ligado a esferas de sefarose da IgG.
3. Realize Calmodulina talão purificação por afinidade
   1. Prepare os grânulos de calmodulina, enquanto os grânulos de IgG foram incubadas com a enzima de TEV. Lavar 200 ul grânulos calmodulina em um Falcon de 15 ml de tubos de 3x, de cada vez com 10 ml de tampão de ligação frio calmodulina. Para cada lavagem, agitar suavemente o tubo durante 2 min num nutator, e depois girar as esferas a 1000 xg durante 2 min. No final da terceira lavagem, retirar todo o tampão e deixar apenas as esferas no tubo.
   2. No final da incubação TEV (passo 3.2.3), o retorno da coluna IgG de volta para a sala fria e coloque-o em linha reta. Vamos as contas se contentar com 10 min.
   3. Retire a tampa superior e, em seguida, a tampa inferior e, em seguida, recolher o produto de clivagem 1,3 ml TEV em um tubo Falcon de 15 ml. Deixe o tampão drenar completamente. Adicionar um buffer de 200 mL TEV adicional para a coluna para empurrar para fora o volume morto da coluna, recolher o fbaixa no mesmo tubo.
   4. Adicionar 4,5 ml de tampão de calmodulina e 4,5 mL de 1 M de CaCl ₂ de ligação para o produto de clivagem de 1,5 ml de TEV recolhidos acima. O CaCl ₂ serve para dosear o EDTA no buffer de TEV. Transferir a mistura de 6 ml para o tubo contendo as esferas de calmodulina e rodar o tubo a 4 ° C num nutator durante 1 hora.
   5. Configure outra coluna micro limpo e vazio com cerca de 10 ml de volume total na câmara fria. Coloque a mistura de pérolas para calmodulina para a coluna e permitir que a drenar pela força da gravidade.
   6. Quando toda a solução fluiu através da coluna de calmodulina resolvido, lava-se a coluna duas vezes, cada uma com 10 ml de tampão de ligação frio calmodulina. Nota: evitar perturbar as contas calmodulina e tentar manter a superfície dos grânulos de tão plana quanto possível, durante a lavagem.
4. Eluir o complexo de isca de coluna calmodulina.
   Logo após a lavagem, eluição da coluna de calmodulina com cinco frações de 200 mL frio Calmodutampão de eluição lin. Para cada fracção, adiciona cuidadosamente 200 ul de tampão de eluição à coluna e recolher o eluato com um marcado tubo Eppendorf de 1,5 ml. Repita este 4x.
5. Analisar o complexo de proteína por SDS-PAGE
   1. Tomar uma pequena alíquota de cada um dos cinco fracções (aproximadamente 30 ul) e adicionar tampão de carga de SDS. Ferver as amostras durante 5 minutos e carregar as amostras de lado-a-lado com os marcadores moleculares de proteínas em um gradiente (4-15%) em gel de SDS-PAGE.
   2. Após as amostras terem totalmente resolvidas no gel, parar a eletroforese e manchar o gel com todos os procedimentos de coloração à base de L-250 sensíveis Coomassie coloidal como "prata azul 'manchando ^13. Coloração prata é opcional, mas não preferível, porque não é totalmente compatível com a análise de espectrometria de massa subseqüente. Armazenar o resto do eluato num congelador a -80 ° C para posterior análise, tal como a espectrometria de massa para descobrir as identidades moleculares do complexo de proteína purificada. See discussão.

Resultados

Aqui demonstramos o nosso esforço na identificação de proteínas Highwire-que interagem no cérebro da mosca. Highwire (Hiw) e seus homólogos de vertebrados e invertebrados são enormes ligases de ubiquitina que regulam o desenvolvimento e reparação do sistema nervoso ^14. Eles compartilham um número de domínios funcionais altamente conservadas. No entanto, suas ações moleculares não são totalmente claras. Trabalho feito em verme, mosca e do rato levou à do modelo de trabalho actual que funciona c...

Discussão

Método de purificação por afinidade em tandem (TAP) oferece um protocolo de purificação dupla que permite o isolamento e enriquecimento de complexos de proteínas por meio de duas etapas independentes de purificação de afinidade. O design da marca TAP não se restringe ao que é apresentado neste protocolo, outros domínios de ligação de proteínas e motivos também são aplicáveis ​​se as condições do tampão são ajustados em conformidade. Um bom exemplo de outras tags TAP é a marca GS-TAP, uma combin...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
U.S.A. standard test sieve No. 25	Fisher Scientific	04-881-18
U.S.A. standard test sieve No. 40	Fisher Scientific	04-881-21
Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml	Kimble Chase	885300-0015
IgG sepharose beads	Pharmacia	17-0969-01
Econo-column 0.7 cm x 20 cm	Bio-Rad	737-4721
Econo-column 0.5 cm x 15 cm	Bio-Rad	737-4716
Calmodulin beads	Stratagene	214303
Coors Mortar and Pestle	CoorsTek	60311
AcTEV Protease	Invitrogen	12575-015
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
Protease Inhibitor Mix	Sigma	P8340