Identificare proteina-proteina interazione in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult capi di Tandem Affinity Purification (TAP)

Riepilogo

Drosophila è famosa per la sua manipolazione genetica potente, ma non per la sua idoneità di analisi biochimica in profondità. Qui vi presentiamo una procedura basata TAP-per identificare interagiscono partner di qualsiasi proteina di interesse da parte del cervello della mosca. Questa procedura può potenzialmente portare a nuove vie di ricerca.

Abstract

Schermi genetici condotti utilizzando Drosophila melanogaster (moscerino della frutta) hanno fatto numerose scoperte pietra miliare nel progresso delle scienze biologiche. Tuttavia, l'uso di schermi biochimiche finalizzate ad estendere le conoscenze acquisite da analisi genetica è stata esplorata solo di recente. Qui si descrive un metodo per purificare il complesso proteico che si associa con qualsiasi proteina di interesse da teste di mosca adulta. Questo metodo sfrutta il sistema Drosophila GAL4/UAS per esprimere una proteina esca fuso con un Tandem Affinity Purification (TAP) tag in neuroni di topo in vivo e quindi implementa due cicli di purificazione utilizzando una procedura TAP simile a quello inizialmente stabilito in lievito ¹ per purificare il complesso proteina interagente. Al termine di questa procedura, una miscela di diversi complessi proteici si ottiene la cui identità molecolare può essere determinato mediante spettrometria di massa. Validazione delle proteine ​​candidati beneficeranno del reSource e facilità di esecuzione di perdita-di-funzione studi di mosche. Approcci simili possono essere applicati ad altri tessuti mosca. Crediamo che la combinazione di manipolazioni genetiche e questo approccio proteomico nel sistema modello fly detiene un enorme potenziale per affrontare i problemi fondamentali nel campo della neurobiologia e oltre.

Introduzione

Definizione dei meccanismi molecolari o reti che mediano un particolare processo biologico è uno degli obiettivi finali della ricerca biomedica. Fly genetisti hanno dipendeva pesantemente sulla genetica in avanti, soprattutto modificatore schermi genetici (sia enhancer e schermi soppressori), per identificare i fattori che lavorano insieme, in parallelo, o monte oa valle di un gene di interesse. Tuttavia, gli schermi genetica in avanti spesso non riescono a identificare i geni essenziali che, se mutato, causa letalità nelle fasi precoci dello sviluppo, oi geni con ridondanza funzionale e compensazione la cui perdita di funzione solo causare difetti sottili che sono difficili da segnare. Un modo per superare questa difficoltà è quello di schermo per interazioni dirette proteina-proteina. Per più di un decennio, un crescente elenco di metodi biochimici, tra cui due ibridi di lievito, esposizione su fago, reticolazione chimica, Co-IP, Tandem Affinity Purification (TAP), etc. sono stati utilizzati per studiare proteine-proteina interazioni. Ognuno di questi approcci ha una propria serie di punti di forza e di debolezza in materia di sensibilità e specificità. Tra questi, il metodo TAP consente il rilevamento di interazione fisica in condizioni quasi fisiologiche, conserva specificità e consistenza ² e include la possibilità di estendere a high-throughput analisi ^3,4.

Il metodo TAP è stato originariamente sviluppato nel lievito da colleghi Rigautand ^1. In questo metodo, una proteina di interesse è espressa con un tag TAP. Il tag TAP ospita due affinità di legame domini indipendenti: una proteina Un dominio che si lega a IgG e un dominio-calmodulina vincolante. I due domini sono separati da una TEV (Tobacco Etch Virus) sito di clivaggio. Tale combinazione permette per due turni indipendenti di purificazioni affinità per ridurre sufficientemente le associazioni aspecifici e arricchiscono le associazioni specifiche ^1. Per questo esempio, il metodo TAP è un potente metodologiad identificare interazioni in vivo di una data proteina, sebbene sovraesprimono la proteina esogena può rendere più inclini ad associare proteine ​​che normalmente non complesso con la sua controparte endogena. Dal suo sviluppo, il metodo TAP è stato applicato in molti altri sistemi, inclusi-coltura a base di cellule sistemi ^5,6 e altri sistemi modello in vivo ^6-9. Qui si descrive l'adattamento del metodo TAP in Drosophila. Per prima cosa generiamo pUAST-NTAP e pUAST-CTAP vettori per facilitare la clonazione e la fusione del tag TAP sia alla N-o C-terminale del gene di interesse. Il UAS-TAP-tag transgene viene poi espressa nel sistema nervoso sotto il controllo di un driver GAL4 neuronale ^10. Successivamente, verrà raccolto un gran numero di teste mosca adulta, che hanno un alto contenuto di cellule neurali e sono facili da separare da altre parti del corpo dopo il congelamento sulla base delle differenze di dimensioni. Le teste adulti sono omogeneizzati e liquidati bcentrifugazioni sequenziali y, e il surnatante è soggetto a una procedura di TAP descritta di seguito.

Protocollo

1. Generare UAS-TAP-tag mosche transgeniche

1. Generare pUAST-TAP-tagged costrutti di DNA.
   1. Decidere quale lato (N-o C-terminale) della proteina esca il tag TAP deve essere fuso a, sulla base della struttura / funzione della proteina. Si veda la discussione per ulteriori dettagli.
   2. Subclone la regione codificante del cDNA del gene di interesse nei siti di clonazione multipla (MCS) dei vettori pUAST-NTAP o pUAST-CTAP per generare N-o C-terminale con targhetta transgeni UAS-TAP, rispettivamente. Vedere la Figura 1 per le mappe dettagliate e siti di restrizione utilizzabili e cornici di lettura.
2. Generare UAS-TAP-tagged mosche transgeniche.
   1. Generare mosche transgeniche seguenti protocolli standard utilizzando P-elemento-mediata di inserimento ^11. Un certo numero di servizi di iniezione sono disponibili in commercio.
   2. Attraversare neuronale autista GAL4 (cioè BG380-GAL4) per ogni singola linea transgenica e determinare i livelli di espressione della proteinadi ogni riga mediante western blot (con anticorpi perossidasi anti-perossidasi) e / o immunostaining (con anticorpo anti-TAP). In generale, una linea transgenica con un livello di espressione della proteina che si trova vicino alla proteina endogena è raccomandato per procedure TAP. Si veda la discussione per ulteriori dettagli.
   3. PerformGAL4/UAS-based esperimenti di salvataggio per confermare la funzionalità dei transgeni TAP-tag se sono disponibili la perdita di funzione mutanti dei geni di interesse. Scegliere un transgene che può salvare la sostanza dei fenotipi mutanti per i seguenti esperimenti TAP.

2. Preparare i campioni per TAP procedura

1. Generare un titolo mosca che porta sia un driver neuronale GAL4 (es. BG380-Gal4) e il transgene TAP-tag scelti in modo da facilitare l'espansione dei campioni mosca. Raccogliere le progenie F1 del conducente GAL4 e la croce UAS-transgene nei rari casi in cui la combinazione di cui sopra determina la sopravvivenza e la crescita di svantaggio.
2. Raccogliere campioni di piccole dimensioni e ottimizzare le condizioni di lisi per solubilizzare la proteina TAP-tag.
   1. Effettuare una serie di buffer di lisi utilizzando una combinazione dei detergenti non ionici NP-40 (0,1-1%), NaDOC (0,1-1%) e Triton X-100 (0,05-0,5%). Vedi Tabella 1 e di discussione per maggiori informazioni.
   2. Sulla cima di un pad CO2, utilizzare # 5 pinze per sezionare 20 capi adulti dal transgene TAP esprimere mosche e raccoglierli in una provetta da 1,5 ml a testare ogni condizione di buffer di lisi.
   3. Aggiungere 100 ul di buffer test di lisi al tubo e omogeneizzare le testine segnando su e giù con un pestello in plastica, poi aggiungere un altro buffer test 100 ul.
   4. Centrifugare il lisato testa a 21.500 xg per 10 min (4 ° C), e separare il surnatante e pellet dopo centrifugazione. Aggiungere 25 ul 2x SDS tampone di caricamento per il pellet e tampone di caricamento 10 ul 4x SDS a 30 ul di surnatante, rispettivamente.
   5. Bollire i due campioni per 5 min e analizzarli side-byLato usando SDS-PAGE e successivo Western Blot con l'anticorpo PAP. Determinare la solubilità dal rapporto tra livelli TAP-proteina nelle supernatante vs il pellet.
3. Preparare campione in larga scala
   1. Espandere e raccogliere mosche adulte.
      1. Espandere lo stock neuronal-GAL4/UAS-TAP-transgene in bottiglie e capovolgere le bottiglie ogni 3 giorni fino cumulative di 250 bottiglie vengono utilizzati per la raccolta.
      2. Raccogliere 1-3 giorni di età adulta vola in 50 ml provette coniche, mettere il tubo in azoto liquido immediatamente Deep Freeze linea. Conservare le mosche in una -80 ° C freezer. Si noti che il volume di linea non deve superare i 2/3 del tubo da 50 ml.
   2. Raccogliere teste fly (eseguire questo passaggio sulla cima di ghiaccio secco in polvere).
      1. Estrarre i setacci prechilled e il mortaio e pestello da -80 ° C freezer e metterli su ghiaccio secco, idealmente all'interno di un grande secchio di ghiaccio. Stack due setacci di prova standard USA con un No. 25 su °e superiore e No. 40 in basso.
      2. Prendere le mosche congelati fuori e farli cadere in azoto liquido e conservare in linea in là per circa 10 min. Vortex o agitare le provette energicamente per rompere le teste, le gambe e le ali dai corpi.
      3. Versare il composto al setaccio superiore, e quindi scuotere i setacci energicamente tenendo setacci insieme. Dopo la setacciatura, i corpi rimarranno sul setaccio superiore, volare teste saranno conservati sul setaccio di fondo, e le gambe, ali, e altri detriti cadranno al ghiaccio secco. Separare i due setacci e con attenzione trasferire i capi mosca al mortaio freddo.
   3. Omogeneizzare le teste fly
      1. In cima a ghiaccio secco, macinare i capi con il mortaio e il pestello di particelle in polvere, poi trasferire la polvere a 15 ml di vetro Dounce Tissue Grinder che è stato prechilled sul ghiaccio.
      2. Misurare i pesi della smerigliatrice prima e dopo il campione testa è stata versata in esso, e quindi calcolare qual è il samp testale pesa. Un totale di 6-15 grammi di teste fly sarà sufficiente per ciascun esperimento TAP regolando di conseguenza per i livelli di espressione della proteina. Aggiungere 15 ml di tampone di omogeneizzazione ghiacciato (tampone di lisi ottimizzata nel passaggio 2.2) per la polvere e poi corsa con il grande pestello pallone fino a che è facile per il pestello per andare su e giù. Mantenere la smerigliatrice vetro su ghiaccio in ogni momento.
   4. Preparare il surnatante per TAP
      1. Trasferire l'omogeneizzato in una provetta da centrifuga ad alta velocità e centrifuga per 20 minuti a 50.000 xg ~ (4 ° C). Trasferire il surnatante in una nuova provetta da centrifuga ad alta velocità e ripetere la centrifugazione ancora una volta.
      2. Trasferire il supernatante in un tubo ultracentrifuga ed eseguire un 40 min ~ 250.000 xg centrifuga per eliminare ulteriormente il surnatante. Il supernatante è pronto per le procedure di purificazione per affinità tandem dopo ultracentrifugazione.

3. TAP Purificazione

Le sezioni che seguono sono stati ricavati dal laboratorio TAP Séraphin protocol ¹² (http://web.as.uky.edu/Biology/faculty/rymond/BIO%20510/Bertran%20Seraphin%27s%20TAP%20page.pdf )

1. Eseguire IgG tallone purificazione per affinità
   1. Preparare IgG Sepharose tallone mentre i campioni vengono centrifugati. Lavare 400 microlitri 3x perline IgG in un tubo Falcon da 15 ml con 10 ml di freddo tampone di lavaggio IgG. Per ogni lavaggio, scuotere delicatamente il tubo per 2 minuti, e poi girare le perle a 1.000 xg per altri 2 min. Alla fine del terzo lavaggio, rimuovere il tampone e lasciare solo le perline nel tubo.
   2. Trasferire con cautela il surnatante eliminato (~ 15 ml) nel tubo da 15 ml contenente le perline IgG. Incubare le perline e mix lisato cervello a 4 º C su una nutator per 2 ore.
   3. Impostare un micro colonna pulito e vuoto con circa 15 ml di volume totale nella stanza fredda. Caricare la miscela sferette IgG dalla costante versare la miscela nella colonna, non cercare di intrappolare qualsiasibolle d'aria all'interno della colonna. Lasciare le perle di stabilirsi nella colonna e il buffer per drenare lentamente flusso di gravità.
   4. Lavare la colonna a fondo con 10 ml di freddo tampone di lavaggio IgG dopo tutto il lisato cervello ha fluito attraverso la colonna IgG risolta. Ripetere il lavaggio 2x. Nota: non lasciare mai che il tallone asciugare all'aria.
2. Eseguire TEV scissione
   1. Dopo il terzo lavaggio, lavare nuovamente la colonna con 10 ml di tampone TEV scissione. Questo passaggio prepara il tallone IgG che sequestranti il ​​complesso esca per TEV scissione.
   2. Destra prima dell'ultima goccia di tampone TEV sta per gocciolare, mettere un tappo nella parte inferiore della colonna di bloccare il flusso, aggiungere 1,3 ml di tampone TEV contenente 130 unità di enzima TEV alla colonna, e quindi tappare saldamente cima colonna. Assicurarsi che la colonna è sigillato bene ad entrambe le estremità.
   3. Ruotare la colonna a 18 ° C per 2 ore per consentire l'enzima TEV per fendere il peptide al sito TEV e rilasciare il complesso proteico WHIle lasciandosi alle spalle la proteina A peptide dominio legata alle perle del IgG Sepharose.
3. Eseguire Calmodulina tallone purificazione per affinità
   1. Preparare le perline calmodulina mentre le perle IgG vengono incubate con l'enzima TEV. Lavare 200 microlitri calmodulina perline in 15 ml di 3x tubo Falcon, ogni volta con 10 ml di freddo Calmodulin binding buffer. Per ogni lavaggio, scuotere delicatamente il tubo per 2 minuti su un nutator, e poi girare le perle a 1.000 xg per 2 minuti. Alla fine del terzo lavaggio, estrarre tutto il buffer e lasciare solo le perline nel tubo.
   2. Al termine dell'incubazione TEV (fase 3.2.3), riportare la colonna IgG torna alla camera fredda e impostare verso l'alto. Lasciate le perline accontentarsi di 10 min.
   3. Togliere il tappo superiore e poi il tappo inferiore, e poi raccogliere il 1.3 ml TEV prodotto di scissione in un tubo Falcon 15 ml. Lasciate che il buffer di scarico completamente. Aggiungere un ulteriore buffer di 200 microlitri TEV alla colonna per spingere fuori il volume morto della colonna, raccogliere la fbasso nello stesso tubo.
   4. Aggiungere 4,5 ml di tampone di legame Calmodulin e 4,5 ml 1 M CaCl ₂ per il prodotto di scissione 1,5 ml TEV raccolti sopra. Il CaCl ₂ serve per titolare l'EDTA nel buffer TEV. Trasferire la miscela 6 ml nella provetta contenente le perline calmodulina e ruotare il tubo a 4 ° C su una nutator per 1 ora.
   5. Impostare un altro micro colonna pulito e vuoto con circa 10 ml di volume totale nella stanza fredda. Caricare la miscela sferette Calmodulina alla colonna e lasciarlo scolare per gravità.
   6. Quando tutta la soluzione è fluito attraverso la colonna Calmodulina costante, lavare la colonna due volte, ciascuna con 10 ml di freddo Calmodulin binding buffer. Nota: evitare di disturbare le perline calmodulina e cercare di mantenere la superficie delle perle più piatta possibile durante il lavaggio.
4. Eluire il complesso esca dalla colonna Calmodulin.
   Subito dopo il lavaggio, eluire la colonna Calmodulina con cinque frazioni di 200 microlitri freddo Calmodulin tampone di eluizione. Per ciascuna frazione, aggiungere lentamente 200 ml di tampone di eluizione alla colonna e raccogliere l'eluato con una marcata 1,5 ml provetta Eppendorf. Ripetere questa 4x.
5. Analizzare il complesso proteico mediante SDS-PAGE
   1. Prendere una piccola aliquota da ciascuna delle cinque frazioni (circa 30 mL) e aggiungere tampone di caricamento SDS. Bollire i campioni per 5 min e caricare i campioni side-by-side con marcatori molecolari di proteine ​​in un gradiente (4-15%) SDS-PAGE gel.
   2. Dopo che i campioni sono completamente risolti nel gel, fermare la elettroforesi e macchiare il gel con qualsiasi sensibili colloidali procedure di colorazione Coomassie basate G-250 come 'argento blu' colorazione ^13. Argento colorazione è opzionale ma non preferibile perché non è completamente compatibile con la successiva analisi di spettrometria di massa. Conservare il resto l'eluato in un congelatore -80 ° C per ulteriori analisi quali spettrometria di massa per scoprire le identità molecolare del complesso proteina purificata. See discussione.

Risultati

Qui mostriamo il nostro sforzo per identificare le proteine ​​Highwire interagenti nel cervello della mosca. Highwire (HIW) e le sue vertebrati e invertebrati omologhi sono enormi ubiquitina ligasi che regolano lo sviluppo e la riparazione del sistema nervoso ^14. Essi condividono un certo numero di domini funzionali altamente conservate. Tuttavia, le loro azioni molecolari non sono del tutto chiare. Lavoro fatto in verme, vola e mouse hanno portato a modello di lavoro corrente che funzioni hiw come ligasi...

Discussione

Metodo Tandem purificazione per affinità (TAP) offre un protocollo dual purificazione che permette l'isolamento e l'arricchimento di complessi proteici attraverso due passaggi di purificazione di affinità indipendenti. Il design del tag TAP non è limitata a ciò che viene presentato in questo protocollo, le altre proteine ​​domini di legame e motivi sono applicabili anche se le condizioni del buffer vengono adeguati di conseguenza. Un buon esempio di altri tag TAP è il tag GS-TAP, una combinazione di una...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
U.S.A. standard test sieve No. 25	Fisher Scientific	04-881-18
U.S.A. standard test sieve No. 40	Fisher Scientific	04-881-21
Kontes Dounce Tissue Grinders 15 ml	Kimble Chase	885300-0015
IgG sepharose beads	Pharmacia	17-0969-01
Econo-column 0.7 cm x 20 cm	Bio-Rad	737-4721
Econo-column 0.5 cm x 15 cm	Bio-Rad	737-4716
Calmodulin beads	Stratagene	214303
Coors Mortar and Pestle	CoorsTek	60311
AcTEV Protease	Invitrogen	12575-015
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
Protease Inhibitor Mix	Sigma	P8340