Plegable y caracterización de un Robot Bio-sensible de ADN Origami

Resumen

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

Resumen

El nanorobot de ADN es un dispositivo nanométrico hexagonal hueco, diseñado para abrirse en respuesta a estímulos específicos y presente de carga secuestradas en el interior. Ambos estímulos y carga se pueden adaptar según las necesidades específicas. Aquí se describe el protocolo de fabricación nanorobot de ADN, con el uso de la técnica de origami de ADN. El procedimiento se inicia mediante la mezcla de alimentos básicos de ADN de una sola hebra cortos en una mezcla de valores que se añade a una larga y circular, andamio ADN de una sola hebra en presencia de un tampón de plegado. Un ciclador térmico estándar de está programado para disminuir gradualmente la temperatura de reacción de mezcla para facilitar el recocido-grapas a andamio, que es la fuerza de guía detrás el plegado de la nanorobot. Una vez que la reacción de plegado 60 hr es completa, el exceso de grapas se descartan usando un filtro de centrífuga, seguido por visualización a través de electroforesis en gel de agarosa (AGE). Por último, la fabricación con éxito de la nanorobot es verificado por microscopía electrónica de transmisión (TEM),con el uso de uranilo-formiato como tinción negativa.

Introducción

Los usos de los ácidos nucleicos de la nanotecnología son asombrosos. La maleabilidad de la base de emparejamiento Watson-Crick, así como la facilidad y bajo costo relativo de la síntesis a gran escala de oligonucleótidos medida ² ha generado una explosión de aplicaciones ³ y la investigación en el campo de la nanotecnología de ADN. Nanotecnología de ADN estructural, basado en el ^4,5 unión Seeman inmóvil como un bloque de construcción fundamental hace uso de ADN como una unidad elemental auto-montaje para la construcción de formas arbitrarias ^6-8.

El reciente desarrollo de la DNA andamiaje origami ⁹ técnica permite la construcción de complejos 2D / 3D nano-arquitecturas de ^10-12 con una precisión sub-nanométrica y es una vía eficaz para la construcción de nuevos objetos funcionales con el aumento de la complejidad y la diversidad asombrosa. El proceso de construcción se basa en un ADN monocatenario largo andamio, por lo general deriva de una genom virale, que se puede plegar a través de la hibridación de cientos de oligos cortos cadena de ADN individuales denomina grapas. La alta resolución estructural obtenida por esta técnica es el resultado directo de las dimensiones naturales de la doble hélice del ADN, mientras que la reproducibilidad de la fabricación es el resultado de la adaptación de las secuencias cortas de grapas de una sola hebra para facilitar la complementariedad máxima de enlaces de hidrógeno alcanzable. Con el uso de una temperatura de recocido rampa lenta la más baja energía diseñado, termodinámicamente preferido nanoestructura se alcanza en altos rendimientos y fidelidad. La fácil aplicación de las reglas de diseño de unión en un código informático permitió el desarrollo de herramientas CAD, como caDNAno ^13, que muy a simplificar la tarea de diseñar estructuras grandes y complejas que contienen cientos de uniones conectadas.

Anteriormente hemos descrito el diseño de un nanorobot de ADN con la ayuda de la herramienta de ^14,15 caDNAno. Aquí representan la fabricación yvisualización, a través de microscopía electrónica de transmisión (TEM), de la nanorobot, un nanodispositivo hexagonal hueca 3D, con unas dimensiones de 35 x 35 x 50 nm ^3, diseñado para sufrir un cambio conformacional importante en respuesta a un estímulo predeterminados y presente de carga específica, tales como proteínas o ácidos nucleicos oligos, secuestrado en el interior. Mientras que 12 estaciones de carga están disponibles dentro del chasis hueco, el número real de carga con destino diferente con el tamaño de la carga. Moléculas de carga van desde pequeñas moléculas de ADN a las enzimas, anticuerpos y 5-10 nanopartículas de oro nm. Cargocan o bien ser uniforme o heterogénea, de manera que cada nanorobot contiene una mezcla de diferentes moléculas. Sensing se logra a través de dos puertas de bloqueo doble diseño helicoidal para detectar proteínas, ácidos nucleicos u otros productos químicos, basado ya sea en aptasensor ^16,17 o cadena de ADN desplazamiento ¹⁸ tecnologías. Los recientes desarrollos en protocolos de selección de aptámeros ^19-21 permiten el diseño de nanorobots respondera una gama cada vez mayor de las moléculas y los tipos de células.

Un trabajo anterior mostró una nanorobot que lleva un anticuerpo específico, que tras la unión a su antígeno puede transmitir o bien un inhibidor o una señal prolífico en el interior de tipos específicos de células en una población de células mixtas ^15. Una característica interesante de estos nanodispositivos es su capacidad para realizar aún más tareas complejas y el control de la lógica con la introducción de diferentes subtipos nanorobot en una sola población. Recientemente hemos demostrado subtipos específicos de nanorobots que realizan, ya sea como reguladores positivos o negativos, controlando una población efectora que contiene una molécula de carga activa ^22.

El protocolo que se presenta aquí describe la fabricación, purificación y obtención de imágenes de un nanorobot cerrada con secuencias de sensores aptámero que se unen selectivamente a PDGF para facilitar la apertura de la nanorobot ^15,22. El proceso de fabricación descrito es similar a la nproceso de fabricación anorobot representado inicialmente por Douglas et al. ¹⁵ con los cambios destinados a reducir la duración total del proceso, al tiempo que aumenta las tasas de rendimiento y purificación.

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Protocolo

1. Preparación de Grapas piscina Mezcla

1. Solicitar liofilizado ADN grapas nanorobot en placas de 96 pocillos que se enumeran en la Tabla 1 (ver Materiales) y normalizar a 10 nmol. Para obtener una descripción detallada del diseño y la arquitectura del nanorobot de ADN ver Ben-Ishay et. Al ¹⁴ y Douglas et al. ^15).
2. Reconstituir cada grapa bien con DNasa / ultrapura RNasa libre a una concentración de 100 mM. Para grapas normalizaron a 10 nmol, reconstituir con 100 l de agua ultrapura.
3. Piscina juntos 20 l de cada grapa utilizando una pipeta multicanal y 55 ml cuenca solución estéril.
   Nota: Dado que la forma nanorobot se compone de 254 capítulos básicos (incluyendo Core, Bordes, manijas y las secuencias de Guías, Tabla 1), la concentración de cada uno de los alimentos básicos en la piscina grapas es 394 nM. Extracción de grapas de la piscina de primera necesidad, o la adición de algunos en diferentes volumes, puede reducir considerablemente el rendimiento, o de otra manera dar lugar a agregados desplegadas.

2. Preparación de la Mezcla de Reacción Fabrication

1. Para una mezcla de reacción estándar de utilizar 40 l de M13mp18 genoma viral circular sola cadena de ADN, correspondientes a 4 pmol de ADN andamio (solución 100 nM de valores, ver Materiales). La concentración final de andamio en la mezcla de fabricación es de 20 nm, un volumen final de 200 l.
   1. Ajuste la cantidad de ADN de andamio de acuerdo a las necesidades específicas; sin embargo, mantener la concentración final de ADN de andamio en la mezcla de reacción a una constante 20 nM.
2. Añadir grapas para llegar a un andamio a la proporción de grapas de 1 a 10, respectivamente. Para una nM concentración de ADN andamio 20, cada uno de concentración final los 254 grapas 'es 200 nM. Para un volumen final de reacción l 200 añadir 102 l de la mezcla de alimentos básicos de la piscina (sección 1.2).
   1. Añadir secuencias específicas Gate separado a the mezcla de reacción de plegado en este momento. Estos oligonucleótidos se piden por separado y requieren purificación por HPLC. Asegúrese de que los oligos Gate están presentes en un uno y diez minutos andamio para Puerta relación de secuencia, es decir, 200 nM de cada oligo para una nM concentración andamio 20. Para un volumen de reacción de plegado 200 l, añadir 0,4 l para cada uno de los oligo de cuatro Gate en un stock de concentración 100 mM.
3. Añadir 10x tampón TAE de stock para llegar a una concentración final de 1x TAE (40 mM Tris-Acetato, EDTA 1 mM). Para un volumen de reacción de plegado 200 l, añadir 20 l de 10x TAE.
4. Añadir 1 M de MgCl ₂ a una concentración final de 10 mM. Para un volumen de reacción plegable 200 l, añadir 2 l de 1 M _de MgCl2.
5. Añadir 36 l de DNasa / RNasa libre de agua ultrapura a un alcanzar un volumen final de 200 l.
6. Muestras Vortex y alícuota de 100 l en viales de PCR.
   Nota: Consulte la especificación termociclador con respecto a los volúmenes de reacción máximos que se utilizarán.Reducir el volumen para cumplir con estos límites no reducirá los rendimientos obtenidos. Los volúmenes de reacción por encima del máximo especificado pongan en peligro los rendimientos.

3. Temperatura de recocido Rampa de Reacción Fabrication

1. Termociclador Programa como sigue:
   1. Rampa 85 ° C a 60 ° C a una velocidad de 5 min / ° C.
   2. Rampa de 60 ° C a 4 ° C a una velocidad de 75 min / ° C.
   3. Mantenga a 4 ° C indefinidamente.
2. Después de la fabricación ha terminado almacenar las muestras a -20 ° C.

4. La eliminación de exceso de grapas

1. Añadir 100 l de mezcla de reacción de plegado a un filtro de centrífuga de 0,5 ml con un MWCO de 100 kDa. Guardar una muestra de 10 l de nanorobots pre-purificación para su posterior análisis.
2. Centrifugar durante 10 min a 9600 x g.
3. Añadir 400 l de tampón de plegamiento (1X TAE, 10 mM de MgCl _2).
4. Repita los pasos 4,2 y 4,3 veces más.
5. Centrifugar durante 5 min a 9600 x g.
6. Recuperar el concentrado colocando el filtro al revés en un tubo de microcentrífuga limpio y centrifugado durante 1 min a 9600 x g. Volúmenes finales pueden variar dependiendo del volumen inicial de mezcla de reacción de fabricación que se puso en el filtro. Típicamente se obtiene un volumen final de 25-60 l de muestra nanorobot concentrado.
7. Medir la concentración de ADN en las muestras a través de espectrofotómetro a 260 nm. Utilice el peso molecular de 5,3 mg / pmol en el cálculo de las concentraciones molares de muestras nanorobot.
   Nota: El coeficiente de extinción molar para dsDNA, 50 g / OD _260, es suficiente para la mayoría de las aplicaciones. 48 mg / OD ₂₆₀ tiene en cuenta la timina poli ssDNA se extiende a las grapas bordes.

5. agarosa electroforesis en gel de Análisis de plegado Nanorobots

1. Preparación de TBE 0,5x (45 mM Tris-borato, EDTA 1 mM), 2% en gel de agarosa suplementado con 10 mM de MgCl ₂ (adaptado de Ernesto Castro et al ^21.):
   1. Preparar tampón TBE 0,5x diluyendo 6,25 ml de 10x TBE reserva de estabilización en 118,75 ml de ddH ₂ O.
   2. Disolver 2,5 g de agarosa en 125 ml de tampón TBE 0,5x.
   3. Hervir en el microondas hasta que la agarosa se disuelva completamente.
   4. Añadir 1,25 ml de 1 M de MgCl ₂ a la concentración final de 10 mM.
   5. Añadir 7 l de 10 mg / ml de bromuro de etidio.
   6. Espere a que la solución a ligeramente fresco y llenar la bandeja de gel antes de que se solidifique el gel de agarosa. Instale peine deseado inmediatamente.
   7. Preparar 1 L TBE 0,5x tampón mediante la adición de 50 ml de 10x tampón TBE Stock y 10 ml de 1 M de MgCl _{2 a 940} ml de ddH ₂ O.
   8. Una vez gel es complemento sólido tampón al dispositivo de electroforesis y el dispositivo puesto en un baño de hielo.
2. Cargar 1 g de ADN total de la nanorobots pre-depuración (paso 3.2), y la purificación posterior (paso 4.7), junto a un andamioMuestra de ADN y un marcador de ADN 1 kb, sobre el gel. Un ejemplo se da en la Figura 2. Volúmenes reales de muestras dependen de las concentraciones obtenidas después de la purificación. Cada muestras se carga con tampón de carga en una proporción de 1: volumen final 6.
3. Ajuste la fuente de poder de 80 V y ejecutar gel durante 3 horas. Ejecutar el gel en un baño lleno de hielo y agua. Nanorobots se desarrollarán y aparecer como una mancha si el gel de agarosa se calienta durante la electroforesis. Durante la electroforesis agregue hielo adicional para mantener el dispositivo de calefacción.
4. Ver gel sobre una mesa de UV (Figura 2).

6. tinción negativa de nanorobot con uranilo-formiato

1. Preparación de solución madre-uranilo formiato 2% (adaptado de Castro et al ^23.):
   1. Pesar 100 mg de polvo de formiato de uranilo en un tubo de 15 ml.
   2. Hervir DNasa / RNasa agua ultrapura gratuita por 3 minutos para des-oxigenado.
   3. Añadir 5 ml de agua caliente desoxigenada (~ 60 ° C)en el tubo de 15 ml que contiene el polvo de uranilo-formiato (del paso anterior). Cierre bien la tapa, envoltura en papel de aluminio y agitar rigurosamente durante 10 minutos (tubo sujetar a un vórtice). Solución debería aparecer turbia con un color amarillo.
   4. Filtrar la solución a través de una jeringa de 0,2 micras fi ltro. Solución debe quedado claro.
   5. Alícuota de 200 l de la solución en tubos de microcentrífuga.
   6. Centrifugar a máxima velocidad durante 5 minutos en una centrífuga de mesa a las muestras de la piscina en la parte inferior del tubo.
2. La carga de la muestra a la red y tinción negativa:
   1. Descongelar una alícuota de 200 l de solución de uranilo-formiato 2% (preparado en la sección 6.1). Añadir 10 l de solución 0,5 M de NaOH y agitar rigurosamente durante 3 min. Centrifugar a máxima velocidad durante 5 minutos usando una centrífuga de mesa.
   2. Mientras tanto, la rejilla de descarga luminiscente usando aire de la habitación a 0,2 mbar y 25 mA durante 30 segundos.
   3. Añadir 15 l de 2 nM muestra nanorobot después de la purificación (SECTIen 4.7) en parte superior de la rejilla (celebrada con pinzas) y dejar absorber durante 1 min. Utilice papel de filtro para drenar el exceso de líquido mediante la colocación de la rejilla en la parte superior del papel de filtro. No toque la superficie de la rejilla.
   4. Añadir 10 l de la uranilo-formiato 2% (del paso 6.2.1) en la parte superior de la rejilla (celebrada con pinzas).
   5. Utilizar rápidamente papel de filtro para drenar el exceso de líquido mediante la colocación de la rejilla en la parte superior del papel de filtro. No toque la superficie de la rejilla.
   6. Repita los pasos 6.2.4 y 6.2.5.
   7. Añadir 10 l de la uranilo-formiato 2% (del paso 6.2.1) en la parte superior de la rejilla (celebrada con pinzas). Deje solución de tinción absorber durante 30 s.
   8. Utilice papel de filtro para drenar el exceso de líquido mediante la colocación de la rejilla en la parte superior del papel de filtro. No toque la superficie de la rejilla.
   9. Deje que la parrilla se seque por completo durante al menos 30 min, boca arriba sobre un papel de filtro, antes de la inyección en el TEM.

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Resultados

Los resultados representativos se muestran en la Figura 2A. Todos los carriles contienen 1 g de ADN total, medida a través de espectrofotómetro (OD _260). En comparación con el andamio de ADN de una sola hebra circular (carril 2), nanorobots se ven obstaculizados en el gel debido a su peso molecular más alto, el resultado de grapas hibridación con el ADN de andamio (Carril 3. Red flecha). La banda de bajo peso molecular en el carril 3 representa el exceso de alimentos bá...

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Discusión

Hemos descrito la fabricación, la purificación, y la visualización del nanorobot ADN. Después de la fabricación del chasis hexagonal del dispositivo, la función de la nanorobot está programado con la simple introducción de la carga específica y hebras de detección para el robot que encontrar fácilmente su posición designada debido a la complementariedad de enlaces de hidrógeno con los sitios de conexión disponibles sola ^hebra 14 ^{, 15,22.}

El protocolo de fa...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNase/RNase free distilled water	Gibco	10977
M13mp18 ssDNA scaffold	NEB	N4040S
10x TAE	Gibco	15558-042
1 M MgCl2	Ambion	AM9530G
Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filter 100K MWCO	Amicon	UFC510024
Agarose	Promega	V3125
TBE buffer	Promega	V4251
Ethidium bromide 10 mg/ml solution	Sigma Aldrich	E1510
1 kb DNA marker	NEB	N3232S
Loading Dye	NEB	B7021S
uranyl formate	polysciences	24762
carbon-coated TEM grids	Science services	EFCF400-Cu-50
Thermal Cycler c1000 Touch	Bio-Rad
Glow Discharge K100X	Emitech
UV table Gel Doc EZ Imager	Bio-Rad
NanoDrop 2000c	Thermo Scientific
TEM FEI-G12	Tecnai