Falten und Charakterisierung eines Bio-responsive Robot von DNA-Origami

Zusammenfassung

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

Zusammenfassung

Die DNA-Nanoroboter ist eine hohle hexagonale Nanometereinrichtung, entworfen, um als Reaktion auf bestimmte Reize und Gegenwart Fracht innerhalb abgesondert zu öffnen. Beide Reize und Ladung kann nach spezifischen Bedürfnisse zugeschnitten werden. Hier beschreiben wir die DNA Nanoroboters Herstellungsprotokoll, wobei die Verwendung des DNA-Origamitechnik. Das Verfahren startet, indem man kurze einsträngige DNA von Klammern in einer Stammischung, der dann in Gegenwart eines Faltungspuffer zu einem langen, kreisförmigen, einsträngigen DNA-Gerüst aufgenommen. Ein Standard-Thermocycler so programmiert ist, allmählich gesenkt werden das Mischen der Reaktionstemperatur, um die Klammern zu Gerüstglühen, die die treibende Kraft hinter der Faltung des Nanoroboters ist erleichtern. Sobald die 60 h Faltungsreaktion vollständig ist, werden die überzähligen Klammern unter Verwendung einer Filterzentrifuge, gefolgt von Visualisierung über Agarose-Gelelektrophorese (AGE) verworfen. Schließlich wird erfolgreiche Herstellung des Nanoroboters durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) überprüft wird,mit der Verwendung von Uranyl-Formiat als negative Färbung.

Einleitung

Die Einsatzmöglichkeiten für Nukleinsäuren Nanotechnologie sind erstaunlich. Die Lenkbarkeit des Watson-Crick-Basenpaarung sowie die einfache und relativ kostengünstige großtechnische Synthese von maßgeschneiderten Oligos ² hat eine Explosion von Anwendungen ^{3 und} Forschung auf dem Gebiet der DNA-Nanotechnologie erzeugt. Strukturelle DNA Nanotechnologie, bezogen auf das immobile Seeman Kreuzung ^4,5 als grundlegender Baustein macht Verwendung von DNA als eine selbstorganisierende Elementareinheit für die Konstruktion von beliebigen Formen ^6-8.

Die jüngste Entwicklung der rüstet ^{DNA-Origami-9-Technik} ermöglicht die Konstruktion von komplexen 2D- / 3D-Nanoarchitekturen ^10-12 mit Sub-Nanometer Präzision und ist ein effizienter Weg für den Bau neuer funktionale Objekte mit zunehmender Komplexität und erstaunliche Vielfalt. Der Bauprozess wird auf eine lange Gerüsteinzelstrang-DNA basiert, in der Regel von einem viralen Genom abgeleitete, der durch die Hybridisierung von Hunderten von kurzen Einzelstrang-DNA-Oligos gefaltet werden kann bezeichnet Heftklammern. Die hohe Strukturauflösung durch diese Technik erhalten ist das direkte Ergebnis der natürlichen Dimensionen der DNA-Doppelhelix, während die Reproduzierbarkeit der Herstellung ist das Ergebnis der Anpassung der kurzen Einzelstrang-Stapelsequenzen, um die maximale Wasserstoffbrücken Komplementarität erreichbar zu erleichtern. Mit dem Einsatz von einem langsamen Temperaturglühen Rampe die entworfen niedrigsten Energie, in hohen Ausbeuten und Treue thermodynamisch bevorzugte Nanostruktur erreicht wird. Die einfache Umsetzung der Kreuzung Design-Regeln in einem Computercode aktiviert die Entwicklung von CAD-Tools, wie caDNAno ^13, die extrem vereinfachen die Aufgabe der Gestaltung großer, komplexer Strukturen, die Hunderte von Übergängen verbunden.

Zuvor beschrieben wir die Konstruktion eines DNA-Nanoroboter mit Hilfe des caDNAno Werkzeug ^14,15. Die Herstellung Hier zeigen wir, undVisualisierung, über Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), der Nanoroboter, einem 3D hohlen sechseckigen Nanovorrichtung, mit den Abmessungen von 35 x 35 x 50 nm ^3, entworfen, um eine große Konformationsänderung in Reaktion auf eine vorbestimmte Stimuli und Gegenwart spezifische Ladung, unterzogen werden wie wie Proteine ​​oder Nukleinsäure-Oligos, abgesondert innen. Während 12 Verladestationen stehen innerhalb der hohlen Gehäuse, die tatsächliche Anzahl der gebundenen Ladung unterscheidet mit Ladung groß. Cargomoleküle reichen von kleinen DNA-Moleküle, Enzyme, Antikörper und 5-10 nm Goldnanopartikel. Cargocan entweder einheitlich oder heterogen, so dass jedes Nanoroboters enthält ein Gemisch aus verschiedenen Molekülen. Sensor ist über zwei Doppelschräg Sperriegel Design entweder aptasensor ^16,17 oder ^{DNA-Strang-Verdrängungs-18-Technologien} erreicht werden, um Proteine, Nukleinsäuren oder andere Chemikalien zu erfassen, beruht. Jüngste Entwicklungen in der Aptamer Selektionsprotokolle ^19-21 ermöglichen die Gestaltung von Nanoroboter reagiertzu einer ständig wachsenden Palette von Molekülen und Zelltypen.

Frühere Arbeiten zeigten eine Nanoroboter, der einen spezifischen Antikörper, der nach der Bindung an sein Antigen kann entweder eine hemmende oder ein produktiver Signal an der Innenseite von spezifischen Zelltypen in einer gemischten Zellpopulation ¹⁵ weiterzuleiten. Eine spannende Merkmal dieser Nanomaschinen ist ihre Fähigkeit, auch komplexere Aufgaben und Logic-Control mit der Einführung von verschiedenen Nanorobotik-Subtypen in einer einzigen Population durchzuführen. Kurzem zeigten wir bestimmte Subtypen von Nanoroboter Führen entweder positive oder negative Regulatoren, Steuern eines Effektorpopulation enthaltend einen aktiven Frachtmoleküls ^22.

Die hier vorgestellte Protokoll beschreibt die Herstellung, Reinigung und Bildgebung eines Nanoroboter mit Aptamer-Sensor-Sequenzen, die selektiv an PDGF binden, um die Öffnung der Nanorobotik ^15,22 erleichtern gated. Das beschriebene Herstellungsverfahren ist ähnlich dem nanorobot Herstellungsverfahren zunächst von Douglas et al. ¹⁵ mit Änderungen zur Verringerung der Gesamtprozessdauer ausgerichtet dargestellt, während die Erhöhung der Ausbeute und Reinigungsraten.

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Protokoll

1. Herstellung von Staples Pool Mixture

1. Sortieren lyophilisiert DNA Nanorobotik Heftklammern auf 96-Well-Platten, wie in Tabelle 1 aufgeführt (siehe Materialien) und zu normalisieren, um 10 nmol. Für eine detaillierte Beschreibung der Konstruktion und Architektur des DNA Nanoroboters siehe Ben-Ishay et al. ^{14 und} Douglas et al. ^15).
2. Rekonstituieren Stapel gut mit DNase / RNase-freies Reinstwasser auf eine Konzentration von 100 uM. Für Heftklammern bis 10 nmol normalisiert, auflösen mit 100 ul von ultrareinem Wasser.
3. Pool zusammen 20 ul jeder Klammer mit einer Mehrkanalpipette und ein steriles 55 ml-Lösung Becken.
   Hinweis: Da der Nanorobotik Form von 254 Heftstränge (einschließlich Kern, Kanten, Griffe und Guides Sequenzen, Tabelle 1), die Konzentration von jedem der Heftklammern in der Heftklammern Pool umfasste ist 394 nM. Entfernen von Heftklammern aus der Heftklammer-Pool oder das Hinzufügen einige an verschiedenen volUMEs, kann die Ausbeute deutlich zu reduzieren, oder auf andere Weise in ungefalteten Aggregate führen.

2. Herstellung von Fabrication Reaktionsgemisch

1. Für ein Standard-Reaktionsgemisch zu verwenden 40 ul M13mp18 viralen Genoms kreisförmigen Einzelstrang-DNA, entsprechend 4 pmol Gerüst DNA (100 nM Stammlösung, siehe Materialien). Endkonzentration von Gerüst bei der Herstellung Gemisch 20 nM, Endvolumen 200 ul.
   1. Stellen Sie die Höhe der Gerüst DNA nach deren spezifischen Bedürfnissen; Jedoch halten die Endkonzentration von Gerüst-DNA in der Reaktionsmischung auf einem konstanten 20 nM.
2. Hinzufügen Klammern an ein Gerüst, Klammern Verhältnis von 1 zu 10 zu erreichen sind. Für ein 20 nM Gerüst-DNA-Konzentration ist jede Endkonzentration 254 Staples 200 nM. Für eine 200 ul Endreaktionsvolumen fügen 102 ul der Heftklammern Pool Mischung (Abschnitt 1.2).
   1. In bestimmten Gate-Sequenzen getrennt zu the Klappreaktionsgemisch zu diesem Zeitpunkt. Diese Oligos sind separat zu bestellen und erfordern HPLC-Reinigung. Stellen Sie sicher, dass Tor Oligos in einer 1.10 Gerüst Tor Sequenz Verhältnis vorliegen, dh 200 nM jedes Oligos für eine 20 nM Gerüst Konzentration. Für ein 200 & mgr; l Reaktionsvolumen Falten, je 0,4 & mgr; l für jede der vier Gatter Oligo bei 100 uM Stammkonzentration.
3. Hinzufügen 10x TAE Lager Puffer zu einer endgültigen Konzentration von 1x TAE (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA) zu erreichen. Für eine 200 ul Klappreaktionsvolumen, fügen Sie 20 ul 10x TAE.
4. 1 M MgCl _{2 zu einer} Endkonzentration von 10 mM. Für eine 200 ul Klappreaktionsvolumen, fügen Sie 2 ul 1 M MgCl _2.
5. Hinzuzufügen 36 ul DNase / RNase frei Reinstwasser ein Erreichbarkeits ein Endvolumen von 200 ul.
6. Vortex und aliquoten 100 ul Proben in PCR-Röhrchen.
   Hinweis: Wenden Thermocycler-Spezifikation in Bezug auf die zu verwendenden maximalen Reaktionsvolumina.Verringerung des Volumens, um diese Grenzen erfüllen nicht die erzielten Ausbeuten reduzieren. Reaktionsvolumina über dem angegebenen werden die Erträge beeinträchtigen Maximum.

3. Temperaturglühen Ramp von Fabrication Reaction

1. Programm Thermocycler wie folgt:
   1. Rampe 85 ° C bis 60 ° C mit einer Geschwindigkeit von 5 min / ºC.
   2. Rampe 60 ° C bis 4 ° C bei einer Geschwindigkeit von 75 min / ºC.
   3. Halten bei 4 ° C auf unbestimmte Zeit.
2. Nach der Herstellung hat Proben bei -20 ° C beendet.

4. Entfernung von überschüssigem Staples

1. 100 ul Klappreaktionsgemisch auf ein 0,5 ml Zentrifugalfilter mit einem MWCO von 100 kDa. Speichern Sie eine 10 ul Probe der Nanoroboter Vorreinigung für eine spätere Analyse.
2. Zentrifuge für 10 min bei 9.600 x g.
3. Fügen Sie 400 ul Faltungspuffer (1x TAE, 10 mM _MgCl 2).
4. Wiederholen Sie die Schritte 4.2 und 4.3 zwei weitere Male.
5. Zentrifuge für 5 min bei 9.600 x g.
6. Wiederherstellen des Konzentrats, indem Sie den Filter auf den Kopf in einem sauberen Mikrozentrifugenröhrchen und Spin für 1 min bei 9600 x g. Endvolumina je nach Ausgangsvolumen der Fertigung Reaktionsmischung, die in den Filter gesetzt wurde, variieren. Typischerweise ein 25-60 ul Endvolumen konzentrierte Nanoroboters Probe erhalten.
7. Messung der DNA-Konzentration in den Proben mittels Spektrophotometer bei 260 nm. Verwenden Molekulargewicht von 5,3 g / pmol bei der Berechnung der molaren Konzentrationen von Nanorobotik Proben.
   Anmerkung: Der molare Extinktionskoeffizient für dsDNA, 50 ug / OD _260, reicht für die meisten Anwendungen. 48 & mgr; g / OD ₂₆₀ berücksichtigt die Poly Thymin ssDNA erstreckt sich an den Rändern Klammern.

5. Agarose-Gel-Elektrophorese Die Analyse der Folded Nanoroboter

1. Herstellung von 0,5x TBE (45 mM Tris-Borat, 1 mM EDTA), 2% Agarosegel mit 10 mM MgCl ₂ supplementiert (von Ernesto Castro et al ^{angepasst. 21):}
   1. Bereiten 0,5x TBE-Puffer durch Verdünnen von 6,25 ml 10x TBE stock Puffer in 118,75 ml _ddH 2 O.
   2. Aufzulösen 2,5 g Agarose in 125 ml 0,5 x TBE-Puffer.
   3. Sieden Mikrowelle, bis die Agarose vollständig gelöst ist.
   4. Hinzufügen 1,25 ml 1 M MgCl ₂ zu einer Endkonzentration von 10 mM.
   5. Hinzufügen 7 ul 10 mg / ml Ethidiumbromid.
   6. Warten Sie, bis Lösung etwas abkühlen lassen und füllen Sie den Gelträger, bevor die Agarose-Gel verfestigt. Installieren Sie die gewünschten Kamm sofort.
   7. Vorbereitung 1 L 0,5x TBE Laufpuffer durch Zugabe von 50 ml 10x TBE Stammpuffer und 10 ml 1 M MgCl _{2 bis 940} ml _ddH 2 O.
   8. Sobald Gel ist solide Add Laufpuffer in die Elektrophoresevorrichtung und legte Gerät in einem Eisbad.
2. Last 1 & mgr; g Gesamt-DNA des Nanoroboter Vorreinigung (Schritt 3.2), und nach der Reinigung (Schritt 4.7), neben einem GerüstDNA-Probe und eine 1 kb DNA-Marker, auf das Gel. Ein Beispiel ist in Abbildung 2 wiedergegeben. Die tatsächliche Probenvolumina hängen von den nach der Reinigung erhalten Konzentrationen. 6 Endvolumen Verhältnis: jeweils Proben mit Beladungspuffer bei einer 1 geladen.
3. Set Stromquelle auf 80 V und führen Gel für 3 Stunden. Führen Sie das Gel in einem Bad mit Eis und Wasser gefüllt. Nanoroboter wird sich entfalten und erscheinen als ein Abstrich, wenn das Agarose-Gel erwärmt sich während der Elektrophorese. Während der Elektrophorese fügen Sie zusätzliche Eis zum Gerät von Heizung zu halten.
4. Anzeigen Gel auf einem UV-Tabelle (Figur 2).

6. Negative Stain von Nanoroboter mit Uranyl Formiat-

1. Herstellung von 2% Uranyl Formiat-Stammlösung (Castro et al ^{angepasst. 23):}
   1. Wiegen Sie 100 mg Uranyl Formiat-Pulver in einen 15-ml-Tube.
   2. Boil DNase / RNase frei von ultrareinem Wasser für 3 min zu de-Sauerstoffverbindung.
   3. 5 ml desoxygeniertem heißem Wasser (~ 60 ° C)in die 15 ml Röhrchen mit dem Uranyl Formiat-Pulver (aus dem vorherigen Schritt). Dicht schließende Deckel, in Alufolie wickeln und Wirbel konsequent für 10 min (fasten Rohr zu einem Vortex). Lösung sollte trüb mit gelber Farbe angezeigt.
   4. Filter-Lösung durch einen 0,2 um Spritzenfilter. Lösung sollte klar sein.
   5. 200 ul Aliquot der Lösung in Mikrozentrifugenröhrchen.
   6. Zentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit für 5 min in einer Tischzentrifuge zur Poolproben an der Unterseite des Rohres.
2. Laden der Probe auf Raster und negative Färbung:
   1. Tauen Sie eine 200-ul-Aliquot von 2% Uranylacetat-Formiatlösung (in Abschnitt 6.1) hergestellt. In 10 ul 0,5 M NaOH-Lösung und Wirbel konsequent für 3 min. Zentrifuge bei Höchstgeschwindigkeit für 5 Minuten unter Verwendung einer Tischzentrifuge.
   2. Inzwischen Glimmentladung Gitter mit Raumluft bei 0,2 mbar und 25 mA für 30 Sekunden.
   3. In 15 ul 2 nM Nanorobotik Probe nach der Reinigung (Abschnitauf 4.7) auf Oberseite des Gitters (mit einer Pinzette gehalten) und lassen Sie absorbieren für 1 min. Verwenden Filterpapier, um die überschüssige Flüssigkeit, indem das Gitter über dem Filterpapier abtropfen. Die Gitteroberfläche nicht berühren.
   4. Zugabe von 10 ul 2% Uranylacetat-Formiat (aus Schritt 6.2.1) auf der Oberseite des Gitters (mit einer Pinzette gehalten werden).
   5. Benutzen schnell Filterpapier, um die überschüssige Flüssigkeit, indem das Gitter auf der Oberseite des Filterpapier abtropfen lassen. Die Gitteroberfläche nicht berühren.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 6.2.4 und 6.2.5.
   7. Zugabe von 10 ul 2% Uranylacetat-Formiat (aus Schritt 6.2.1) auf der Oberseite des Gitters (mit einer Pinzette gehalten werden). Lassen Färbelösung absorbieren 30 Sek.
   8. Verwenden Filterpapier, um die überschüssige Flüssigkeit, indem das Gitter über dem Filterpapier abtropfen. Die Gitteroberfläche nicht berühren.
   9. Ließ das Gitter vollständig trocknen für mindestens 30 min, nach oben auf ein Filterpapier, vor dem Einspritzen in das TEM.

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Ergebnisse

Repräsentative Ergebnisse sind in 2A gezeigt. Alle Spuren enthalten 1 & mgr; g Gesamt-DNA über Spektrophotometer (OD ₂₆₀₎ gemessen. Im Vergleich mit dem kreisförmigen Einzelstrang-DNA-Gerüst (Spur 2), sind Nanoroboter im Gel aufgrund ihrer höheren Molekulargewicht behindert, ist das Ergebnis von Klammern Hybridisierung an das Gerüst DNA (Spur 3 roter Pfeil). Das Gewicht Band mit niedrigem Molekular in Spur 3 stellt überschüssige Heftklammern, die nicht auf das Schafott DNA (grüne...

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Diskussion

Wir beschrieben die Herstellung, Reinigung und Visualisierung der DNA-Nanoroboter. Nach der Herstellung des hexagonalen Chassis der Vorrichtung wird die Funktion des Nanoroboters mit der einfachen Einführung spezifischer Ladung und Erfassen Stränge an den Roboter, die leicht zu finden ihre bestimmten Position aufgrund von Wasserstoffbrücken Komplementarität vorhanden einsträngigen Andockstellen ¹⁴ programmiert ^{, 15,22.}

Die beschriebenen Herstellungsprotokoll verwen...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNase/RNase free distilled water	Gibco	10977
M13mp18 ssDNA scaffold	NEB	N4040S
10x TAE	Gibco	15558-042
1 M MgCl2	Ambion	AM9530G
Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filter 100K MWCO	Amicon	UFC510024
Agarose	Promega	V3125
TBE buffer	Promega	V4251
Ethidium bromide 10 mg/ml solution	Sigma Aldrich	E1510
1 kb DNA marker	NEB	N3232S
Loading Dye	NEB	B7021S
uranyl formate	polysciences	24762
carbon-coated TEM grids	Science services	EFCF400-Cu-50
Thermal Cycler c1000 Touch	Bio-Rad
Glow Discharge K100X	Emitech
UV table Gel Doc EZ Imager	Bio-Rad
NanoDrop 2000c	Thermo Scientific
TEM FEI-G12	Tecnai