DNA Origami bir Bio-duyarlı Robot katlanması ve Karakterizasyonu

Özet

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

Özet

DNA nanorobot içinde münzevi belirli uyaranlara ve mevcut kargo yanıt açmak için tasarlanmış bir oyuk altıgen nanometrik cihazdır. Her iki uyaranlara ve kargo özel ihtiyaçlarına göre uyarlanabilir. Burada DNA origami tekniği ile, bir DNA nanorobot imalat protokol açıklar. Prosedür daha sonra bir katlama tampon maddesinin mevcudiyetinde, uzun dairesel, tek sarmal bir DNA iskele eklenir stok karışımı içine kısa tek kordonlu bir DNA zımba karıştırılmasıyla başlatır. Standart termo cycler giderek nanorobot katlanması arkasındaki temel güçtür zımba-to-iskele tavlama, kolaylaştırmak için karıştırma reaksiyon sıcaklığını düşürmek için programlanmıştır. 60 saat katlama Reaksiyon tamamlandıktan sonra, fazla zımba agaroz-jel elektroforezi (AGE) ile görselleştirme, ardından bir santrifüj filtre kullanılarak atılır. Son olarak, nanorobot başarılı imalat (TEM) transmisyon elektron mikroskobu ile doğrulanır,Negatif bir boya olarak uranil-format kullanılarak.

Giriş

Nükleik asitler nanoteknoloji için kullandığı şaşırtıcı. Watson-Crick baz eşleştirme tractability olarak ısmarlama oligoların ² büyük ölçekli sentezi kolaylığı ve nispeten düşük maliyetli bir DNA nanoteknoloji alanında uygulamalar ³ patlamasını ve araştırma üretti. Temel yapı taşı olarak hareketsiz Seeman kavşak ^4,5'ten dayalı yapısal DNA nanoteknoloji, keyfi şekilleri ^6-8 inşası için bir öz-montaj ilköğretim ünite olarak DNA kullanımını kolaylaştırır.

Desteksiz DNA origami ⁹ tekniğin son gelişme alt nanometre hassasiyetle karmaşık 2D / 3D nano mimarileri ^10-12 inşası için izin verir ve artan karmaşıklığı ve şaşırtıcı çeşitliliği ile yeni işlevsel nesneler oluşturmak için etkili bir yoldur. Inşaat süreci uzun skafold, tek iplikli DNA dayanır, genellikle viral genom türetilmişKısa tek iplikli DNA oligo yüzlerce melezleşme yoluyla katlanabilir, e zımba denilen. Fabrikasyon tekrarlanabilirliği elde maksimum hidrojen bağlayıcı tamamlayıcılık kolaylaştırmak için kısa, tek iplikli zımba dizileri terzilik sonucu ise bu teknikle elde edilen yüksek çözünürlüklü yapısal, DNA çift sarmal doğal boyutlarının doğrudan bir sonucudur. Yavaş sıcaklık tavlama kullanımı ile termodinamik tercih nanoyapı yüksek verim ve sadakat ulaşılır tasarlanmış düşük-enerji, rampa. Bir bilgisayar kodu kavşak tasarım kurallarının uygulanması son derece kolay bağlanan kavşaklar yüzlerce içeren büyük, karmaşık yapıların tasarlama görevi kolaylaştırmak gibi caDNAno ¹³ olarak CAD araçları, gelişmesini, etkin.

Daha önce caDNAno aracı ^14,15 yardımıyla bir DNA nanorobot tasarımını tarif. Burada imalat tasvir vetransmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile görselleştirme, boyutları nanorobot 3B, içi boş altıgen nanodevice, önceden tespit edilmiş bir uyarım ve mevcut spesifik yük, yanıt olarak büyük bir uygun bir değişiklik geçiren için tasarlanmış 35 x 35 x 50 mil ^3, örneğin protein ya da nükleik asit oligo olarak içeri birikir. 12 yükleme istasyonu boş kasanın içinde mevcut olmakla birlikte, bağlı yüklerin gerçek sayısı kargo boyutu ile değişir. Kargo molekülleri küçük DNA moleküllerinden enzimler, antikorlar ve 5-10 nm altın nanopartiküller değişir. Her nanorobot farklı moleküllerin bir karışımını ihtiva ettiği şekilde, muntazam ya da heterojen Cargocan ya. Algılama aptasensor ^16,17 veya DNA zincir yerinden ¹⁸ teknolojiler üzerinde ya, proteinler, nükleik asitleri ve diğer kimyasalları anlamda iki çift sarmal kilitleme kapıları tasarım yoluyla elde dayanmaktadır. Aptamer seçimi protokolleri ^19-21 son gelişmeler yanıt nanorobots tasarımını sağlayanmoleküller ve hücre tipleri artan aralığı.

Daha önce eser, antijene bağlanma önleyici bir ya da karma hücre grubunun ¹⁵ belirli hücre tipleri içine verimli bir sinyal, ya geçirebilmesi üzerine spesifik bir antikor, bir taşıma nanorobot göstermiştir. Bu nanocihazların bir heyecan verici özelliği, tek bir popülasyonda farklı nanorobot alt tiplerinin tanıtımıyla daha karmaşık görevleri ve mantık kontrolü gerçekleştirmek için yeteneğidir. Son zamanlarda aktif kargo molekülü ²² içeren bir efektör nüfus kontrol pozitif veya negatif düzenleyiciler ya da performans nanorobots belirli alt tipleri gösterdi.

Burada sunulan protokol nanorobot ^15,22 açılmasını kolaylaştırmak için PDGF'ye seçici olarak bağlanan aptamer sensör dizileri ile işlenir bir nanorobot imalatı, saflaştırma ve görüntüleme açıklanmaktadır. Açıklanan imalat süreci n benzerverim ve arıtma oranlarını artırırken anorobot fabrikasyon süreci başlangıçta, Douglas ve arkadaşları ark., genel işlem süresini azaltmaya yönelik değişikliklerle ^{15 ile} tasvir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Staples Havuz karışımının hazırlanması 1.

1. Tablo 1'de listelenen 96-kuyu plakalar üzerinde sipariş liyofilize DNA nanorobot zımba (Malzeme) ve 10 nmol kadar normalleştirmek. DNA nanorobot tasarımı ve mimarisi ayrıntılı bilgi için Ben-Ishay ve ark., ^{14 ve} Douglas ve ark bakın. ^15).
2. 100 uM bir konsantrasyonda her bir zımba de sahip DNase / RNase içermeyen ultra-saf sulandırın. Zımba, 10 nmol normalize için, ultra-saf su 100 ul ile sulandırın.
3. Havuz çok kanallı pipet ve steril bir 55 ml solüsyon havzası kullanarak her elyaf birlikte 20 ul.
   Not: nanorobot şekil, zımba havuzda zımba her birinin konsantrasyonu (Çekirdek, Kenarlar, Kolları ve Kılavuzlar dizileri Tablo 1 de dahil olmak üzere) 254 zımba şeritlerinin oluşur beri 394 nM. Zımba havuzundan zımba çıkarma, ya da farklı vol bazı ekleyerekumes ölçüde veriminin azalmasına veya başka bir şekilde katlanmamış agrega neden olabilir.

Fabrikasyon Reaksiyon Karışımının 2. Hazırlık

1. Standart bir reaksiyon karışımı için (Malzeme, 100 nM stok çözeltisi) iskele DNA 4 pmol karşılık, M13mp18 viral genomun dairesel tek iplikli DNA 40 ul kullanın. Imalat karışımında skafoldun nihai konsantrasyonu 20 nM, nihai hacim 200 ul'dir.
   1. Özel ihtiyaçlarına göre iskele DNA miktarını ayarlayın; Bununla birlikte, sabit bir 20 nM'de, reaksiyon karışımı içinde çatgı DNA nihai konsantrasyon tutun.
2. Sırasıyla 1 ila 10 arasında zımba oranı bir iskele ulaşmak için zımba ekleyin. 20 nM skafold, DNA konsantrasyonu için, 254 Staples'in nihai konsantrasyona sahip her 200 nM'dir. 200 ul son reaksiyon hacmi için zımba havuz karışımı (bölüm 1.2) 102 ul ekleyin.
   1. Inci ayrı ayrı belirli Gate dizileri ekleŞu anda e katlama reaksiyon karışımı. Bu oligolar ayrı sipariş ve HPLC saflaştırma gerektirir. 20 nM skafold konsantrasyonu için her oligodan yani 200 nM, Kapı oligolar 1:10 skafold Gate sekansı oranında mevcut olduğundan emin olun. 200 ul katlanır reaksiyon hacmi için 100 uM stok konsantrasyonunda dört Kapısı oligo her biri için 0.4 ul ekleyin.
3. 1x TAE (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA) nihai konsantrasyona ulaşmak için 10x TAE tamponu hazır ekleyin. 200 ul katlanır reaksiyon hacmi için, 10x TAE 20 ul ekleyin.
4. 10 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar 1 M _MgCI2 ekleyin. 200 ul katlanır reaksiyon hacmi için 1 M _MgCl2 2 ul ekleyin.
5. 200 ul bir son hacme ulaşmak bir DNaz / RNazsız ultra saf su 36 ul ekle.
6. PCR şişelere vorteksleyin ve kısım 100 ul örnekler.
   Not: Kullanılacak maksimum reaksiyon hacimleri ile ilgili termal döngü şartname danışın.Bu sınırları karşılamak için hacim azaltılması elde verimleri azaltmak olmaz. Verimleri tehlikeye atacaktır belirtilen maksimum yukarıdaki Reaksiyon hacimleri.

Fabrikasyon Reaksiyon 3. Sıcaklık Tavlama Rampa

1. Program termal cycler takip gibidir:
   1. 5 dakika / ° C arasında bir oranda 60 ° C'ye kadar 85 ° C Rampa.
   2. Rampa 60 ° C 75 dak / ° C arasında bir oranda 4 ° C arasındadır.
   3. Belirsiz bir süre 4 ° C'de tutun.
2. Sonra fabrikasyon -20 ° C'de mağaza örnekleri sona erdi.

Aşırı Staples 4. Kaldırma

1. 100 kDa MWCO bir ile 0,5 ml santrifüj filtre katlama reaksiyon karışımına 100 ul ekle. Daha sonra analiz için nanorobots ön arıtma bir 10 ul örnek kaydedin.
2. 9600 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj.
3. Katlama tamponu içinde 400 ul (1 x TAE, 10 mM _MgCI2) ekleyin.
4. Tekrarlayın iki kez daha 4.2 ve 4.3 adımları tekrarlayın.
5. 9600 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje.
6. 9600 x g'de 1 dakika boyunca temiz bir mikrosantrifüj tüp ve spin ters filtreyi koyarak konsantre kurtarın. Nihai hacmi filtre konulmuştur üretim tepkime karışımının başlangıç ​​hacmine bağlı olarak değişebilir. Tipik haliyle, konsantre nanorobot numunenin bir 25-60 ul nihai hacim elde edilir.
7. 260 nm'de spektrofotometre aracılığıyla örneklerde DNA konsantrasyonu ölçülür. Nanorobot örneklerinin mol konsantrasyonları hesaplanırken 5,3 ug / pmol moleküler ağırlığa kullanın.
   Not: dsDNA molar sönüm katsayısı, 50 ug / OD _260, bir çok uygulama için yeterli olmaktadır. 48 ug / OD ₂₆₀ Kenarları zımba de dikkate ssDNA uzanan poli timin alır.

Katlanmış Nanorobots 5. Jel Elektroforez Analizi Agaroz

1. 0.5x TBE (45 mM Tris-Borate, 1mM EDTA),% 2 agaroz jel Preparasyon 10 mM _MgCl2 ile desteklenmiş (Ernesto Castro ve ark uyarlanmış ^21.):
   1. _GKD 2 O. 118.75 ml 10x TBE hisse tamponu 6.25 ml seyreltilmesi ile 0.5x TBE tamponu hazırlayın
   2. 0.5x TBE tamponu 125 ml agaroz 2.5 g çözündürülür.
   3. Agaroz tamamen eriyene kadar mikrodalga kaynatın.
   4. 10 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar 1 M _MgCI2, 1.25 ml ilave edilir.
   5. 10 mg 7 ul ekle / ml etidyum bromür.
   6. Biraz serin çözümü için bekleyin ve agaroz jel katılaşır önce jel tepsisi doldurun. Hemen istenen tarak takın.
   7. _GKD 2 O 940 ml 0.5x TBE _MgCl2 10x TBE tamponu hazır 50 ml, 1 M, 10 ml ilave etmek suretiyle tampon çalışan 1 L hazırlayın
   8. Jel buz banyosu içinde elektroforez cihazına tampon ve koyun cihazı çalıştıran katı eklenti sonra.
2. Bir iskele yanında nanorobots öncesi arınma Yük 1 ug toplam DNA (adım 3.2) ve sonrası saflaştırma (adım 4.7),DNA numunesi ve jel üzerine, bir 1 kb DNA marker ile etiketlenebilir. Bir örnek, Şekil 2'de verilmiştir. Numunelerin fiili hacim saflaştırmadan sonra elde edilen konsantrasyonları bağlıdır. 6 nihai hacim oranı: Her numune, bir 1, yükleme tamponu ile yüklenir.
3. 80 V güç kaynağı olarak ayarlayın ve 3 saat jel çalıştırın. Buz ve su ile doldurulmuş bir küvet jel çalıştırın. Nanorobots açılmak ve agaroz jel elektroforez sırasında ısınır eğer smear olarak görünecektir. Elektroforez sırasında ısıtma cihazı tutmak için ek buz ekleyin.
4. UV masaya gör jel (Şekil 2).

Uranil-format ile Nanorobot 6. Negatif Leke

1. % 2'lik üranil-format stok solüsyonunun hazırlanması (Castro et al uyarlanmış ^23).:
   1. 15 ml'lik bir tüp içine uranil-format tozun 100 mg tartılır.
   2. 3 dakika kaynatın DNaz / RNaz ücretsiz ultra saf su de-oksijenatı için.
   3. Deoksijene sıcak su 5 ml (~ 60 ° C)(önceki aşamadan) uranil-format ihtiva eden bir toz 15 ml tüp içine. Sıkıca kapağı kapatın, (bir girdaba tutturmak tüp) titizlikle 10 dakika süreyle alüminyum folyo ve vorteks olarak sarın. Çözüm sarı renk ile bulanık görünmelidir.
   4. 0.2 mikron şırınga fi ltre ile Filtre çözümü. Çözüm açık hale gelmelidir.
   5. Kısım mikrosantrifüj tüpleri içine çözeltisi 200 ul.
   6. Tüpün dibinde havuz örnekleri masa üstü santrifüj 5 dakika boyunca maksimum hızda santrifüj.
2. Izgara ve negatif boyama numunenin yükleme:
   1. % 2'lik üranil-format çözeltisi (6.1 bölümünde tarif edilmiş) bir 200 ul tablet çözülmesini sağlayın. 3 dakika boyunca dikkatli bir 0.5 M NaOH çözeltisi ve girdap 10 ul ekle. Bir masa üstü santrifüj kullanılarak 5 dakika süreyle maksimum hızda santrifüj.
   2. Bu arada, kızdırma deşarj ızgara 0,2 mbar oda havasını kullanarak ve 25 mA 30 sn.
   3. Saflaştırmadan sonra 2 nM nanorobot örnek 15 ul ekle (sectiızgara üst tarafında üzerine 4.7) üzerine (forseps ile düzenlenen) ve 1 dakika boyunca absorbe edelim. Filtre kağıdının üstüne ızgara koyarak fazla sıvıyı boşaltmak için fi ltresi kağıdı kullanın. Izgara yüzeyine dokunmayın.
   4. Izgara üst tarafında üzerine (adım 6.2.1 itibaren)% 2 uranil-format 10 ul ekleyin (forseps ile yapılan).
   5. Hızla filtre kağıdının üstüne ızgara koyarak fazla sıvıyı boşaltmak için fi ltresi kağıdı kullanın. Izgara yüzeyine dokunmayın.
   6. Tekrarlayın 6.2.4 ve 6.2.5 numaralı adımları.
   7. Izgara üst tarafında üzerine (adım 6.2.1 itibaren)% 2 uranil-format 10 ul ekleyin (forseps ile yapılan). Boyama çözeltisi 30 saniye boyunca absorbe olsun.
   8. Filtre kağıdının üstüne ızgara koyarak fazla sıvıyı boşaltmak için fi ltresi kağıdı kullanın. Izgara yüzeyine dokunmayın.
   9. Izgara, en az 30 dakika süreyle tamamen kurumaya TEM içine enjekte önce, bir filtre kağıdı üzerinde edelim.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Örnek sonuçlar Şekil 2A'da gösterilmiştir. Tüm yolları spektrofotometre (OD ₂₆₀₎ üzerinden ölçülen toplam DNA'nın 1 ug içerir. Dairesel tek iplikli DNA iskele (Şerit 2) ile karşılaştırıldığında, nanorobots nedeniyle daha yüksek bir moleküler ağırlığa jelde engellenmektedir, skafold DNA zımba hibridizasyon sonucu (Şerit 3. Kırmızı ok). Şerit 3'te düşük moleküler ağırlık şeridinin skafold DNA (yeşil ok) bağlanmazken, fazla zımba temsil ed...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Biz DNA nanorobot imalatı, arıtma, ve görselleştirme nitelendirdi. Cihazın altıgen şasi imalatı takiben, nanorobot fonksiyonu kolayca nedeniyle mevcut tek iplikli yerleştirme siteleri ¹⁴ ile hidrojen bağlayıcı tamamlayıcılık onların belirlenen pozisyon bulmak robot özgü kargo basit giriş ve algılama ipliklerini ile programlanır ^{, 15,22.}

Tarif edilen imalat protokolü, genellikle origami şekilleri geniş bir katlama laboratuarımızda kullanılmış...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNase/RNase free distilled water	Gibco	10977
M13mp18 ssDNA scaffold	NEB	N4040S
10x TAE	Gibco	15558-042
1 M MgCl2	Ambion	AM9530G
Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filter 100K MWCO	Amicon	UFC510024
Agarose	Promega	V3125
TBE buffer	Promega	V4251
Ethidium bromide 10 mg/ml solution	Sigma Aldrich	E1510
1 kb DNA marker	NEB	N3232S
Loading Dye	NEB	B7021S
uranyl formate	polysciences	24762
carbon-coated TEM grids	Science services	EFCF400-Cu-50
Thermal Cycler c1000 Touch	Bio-Rad
Glow Discharge K100X	Emitech
UV table Gel Doc EZ Imager	Bio-Rad
NanoDrop 2000c	Thermo Scientific
TEM FEI-G12	Tecnai