Складной и характеристика Био-отзывчивого робота от ДНК оригами

Резюме

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

Аннотация

Наноробота ДНК представляет собой полый гексагональной нанометровый устройство, предназначен для открытия в ответ на конкретные раздражители и настоящим груза поглощенных внутри. Оба раздражители и грузов может быть адаптирована в соответствии с конкретными потребностями. Здесь мы описываем протокол изготовления нанороботов ДНК, с использованием техники ДНК-оригами. Порядок инициирует путем смешивания короткие однонитевые скобы ДНК в акционерное смеси, которая затем добавляется к длинному, круговой, одноцепочечной ДНК эшафот в присутствии складной буфера. Стандартный термо циклер запрограммирован, чтобы постепенно снизить температуру реакции смешивания для облегчения отжиг скобы к эшафот, который является руководящей силой позади складывания нанороботов. После завершения реакции складывания 60 ч завершена, избыток скобы отбрасываются с использованием центробежного фильтра, а затем с помощью визуализации агарозном гель-электрофореза (возраст). Наконец, успешное изготовление на нанороботов проверяется методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ),с использованием уранила формиата-как негативный краситель.

Введение

Использует для нуклеиновых кислот нанотехнологий поразительны. Уступчивость базовой спаривания Уотсона-Крика, а также легкость и относительная низкая стоимость крупномасштабного синтеза заказных олигонуклеотидов ² породила взрыв приложений ³ и исследований в области нанотехнологий ДНК. Структурно ДНК нанотехнологии, основанный на неподвижной распределительной Seeman ^4,5 качестве фундаментального строительного блока использует ДНК в качестве самосборки элементарной единицы для строительства произвольной формы ^6-8.

Недавнее развитие scaffolded ДНК оригами ⁹ методика позволяет на строительство сложных 2D / 3D нано-архитектур ^10-12 с точностью субнанометровым и является эффективным путем для строительства новых функциональных объектов с увеличением сложности и удивительной разнообразия. Процесс строительства основан на длинные лесов однонитевой ДНК, как правило, получают из генома вирусногое, которые могут быть сложены через гибридизации сотен коротких одиночных олигонуклеотидов ДНК называют цепь скрепки. Высокая структурная разрешение получаемых с помощью этого метода является прямым результатом естественных размеров двойной спирали ДНК, в то время как воспроизводимость изготовления является результатом адаптации короткие однонитевые последовательности скрепками, чтобы облегчить максимальной взаимодополняемости водородной связи достижимо. При использовании медленного отжига нарастить проектную наименьшей энергией, термодинамически более предпочтительным наноструктуры достигается с высоким выходом и верности. Простой реализация правил проектирования распределительных в компьютерном коде позволили разработать САПР, таких как caDNAno ^13, что чрезвычайно упрощает задачу проектирования больших и сложных структур, содержащих сотни связанных переходов.

Ранее мы описали конструкцию нанороботов ДНК с помощью инструмента ^14,15 caDNAno. Здесь мы изобразить изготовление ивизуализации, с помощью электронной микроскопии (ПЭМ), в нанороботов, 3D-полой шестигранной наноустройства, с размерами 35 х 35 х 50 нм ^3, предназначен для прохождения основной конформационные изменения в ответ на заранее определенных стимулов и настоящей конкретного груза, например как белки или олигонуклеотиды нуклеиновых кислот, поглощенных внутри. В то время как 12 загрузочные станции доступны внутри полого корпуса, фактическое количество связанного груза отличается от размера груза. Молекулы Грузовые от небольших молекул ДНК ферментов, антител и 5-10 нм наночастиц золота. Cargocan либо быть однородной или гетерогенной, так что каждый нанороботов содержит смесь различных молекул. Зондирования достигается с помощью двух двуспирально замок ворот дизайна ощутить белки, нуклеиновые кислоты и другие химические вещества, основаны либо на aptasensor ^16,17 или нити ДНК смещения ¹⁸ технологий. Последние события в аптамеров протоколов отбора ^19-21 включить дизайн нанороботов отвечаяво все возрастающей диапазоне молекул и клеточных типов.

Ранее работа показала наноробот несущий специфические антитела, которое при связывании со своим антигеном может передавать либо ингибирующий или плодовитых сигнал к внутренней части специфических типов клеток в смешанной популяции клеток ^15. Захватывающая особенность этих наноустройств является их способность выполнять даже более сложные задачи и логика управления с введением различных подтипов нанороботов в одной популяции. Недавно мы показали, конкретные подтипы нанороботов, осуществляющих как положительные или отрицательные регуляторы, контролируя население эффекторной содержащий активную молекулу грузов ^22.

Протокол, представленные здесь описывает изготовление, очищение и визуализации в закрытом нанороботов с последовательностями сенсорных аптамер, которые связывают выборочно PDGF, чтобы облегчить открытие нанороботов ^15,22. Процесс изготовления описано аналогичен пПроцесс изготовления anorobot изначально изображен Дуглас и др. ¹⁵ с изменениями, направленных на снижение продолжительности процесса в целом, в то время как увеличение ставки доходности и очистки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка Скобы бассейн смеси

1. Заказать лиофилизированы ДНК нанороботов скобы на 96-луночных планшетах, перечисленные в таблице 1 (см Материалы) и нормализовать до 10 нмоль. Для более подробного описания конструкции и архитектуры нанороботов ДНК см Бен-Ишай др. ¹⁴ и Дуглас и др. ^15).
2. Разведите каждый главный продукт хорошо с ДНКазы / РНКазы сверхчистого до концентрации 100 мкМ. Для скобы нормализованы до 10 нмоль, восстановить 100 мкл сверхчистой воды.
3. Бассейн вместе 20 мкл каждого скобы с помощью многоканальной пипетки и стерильный 55 мл раствора бассейн.
   Примечание: Поскольку форма нанороботов состоит из 254 основных нитей (включая Core, края, ручек и Гид последовательностей, таблица 1), концентрации каждого из скоб в бассейне скобы является 394 нМ. Снятие скобы из бассейна штапельного или добавления некоторых в другом обмов, может снизить урожайность значительно, или иным образом приводить развернутых агрегатов.

2. Подготовка изготовления реакционную смесь

1. Для стандартной реакционной смеси используют 40 мкл вирусного генома M13mp18 круговой одной нити ДНК, соответствующий 4 пмоль лесов ДНК (100 нМ маточный раствор, см Материалы). Конечная концентрация эшафот в изготовлении смеси 20 нМ, конечный объем 200 мкл.
   1. Отрегулируйте количество лесов ДНК в соответствии с конкретными потребностями; однако, иметь конечную концентрацию лесов ДНК в реакционной смеси при постоянном 20 нМ.
2. Добавьте скрепки, чтобы достичь каркас соотношение скобы от 1 до 10, соответственно. Для нМ концентрации 20 эшафот ДНК, каждый из конечной концентрации 254 Staples "200 нМ. Для 200 мкл конечного объема реакционной добавить 102 мкл смеси скобы бассейна (раздел 1.2).
   1. Добавить специфических последовательностей Gate отдельно гое складные Реакционную смесь в это время. Эти олигонуклеотиды заказываются отдельно и требуют очистки ВЭЖХ. Убедитесь, что ворота олигонуклеотиды находятся в соотношении 1:10 леса в ворота последовательности, т.е. 200 нМ каждого олигонуклеотида на 20 нМ концентрации лесов. Для 200 мкл складной объема реакционной добавить 0,4 мкл для каждого из четырех олигонуклеотидов Gate на фондовой концентрации 100 мкМ.
3. Добавить 10x TAE буферный до конечной концентрации 1х ТАЕ (40 мМ Трис-ацетат, 1 мМ ЭДТА). Для 200 мкл складной объема реакционной, добавить 20 мкл 10х TAE.
4. Добавить 1 М _MgCl 2 до конечной концентрации 10 мМ. Для 200 мкл складной объема реакционной, добавить 2 мкл 1 М MgCl _2.
5. Добавить 36 мкл ДНКазы / РНКазы сверхчистой водой до достижения конечного объема 200 мкл.
6. Вихревые и аликвоту 100 мкл образцов в ПЦР флаконах.
   Примечание: Проконсультируйтесь с тепловой спецификации ЦИКЛОВАТЕЛЬ о максимальных объемах реакции, которые будут использоваться.Уменьшение объемов для удовлетворения этих пределов не снизит урожайность, полученные. Объемы выше максимального значения, указанного поставит под угрозу урожаи реакции.

3. температуры отжига рампы изготовления реакции

1. Программа термоциклер, как следует:
   1. Рампа 85 ° C до 60 ° C со скоростью 5 мин / ° C.
   2. Рампа 60 ° С до 4 ° С, со скоростью 75 мин / ° C.
   3. Держите при температуре 4 ° C до бесконечности.
2. После изготовления закончился хранить образцы при -20 ° C.

4. Удаление избыточных Staples

1. Добавить 100 мкл реакционной смеси складывания на 0,5 мл центробежным фильтром с MWCO 100 кДа. Сохранить 10 мкл образца нанороботов предварительно очистки для последующего анализа.
2. Центрифуга течение 10 мин при 9600 х г в.
3. Добавить 400 мкл буфера (складной 1x TAE, 10 мМ MgCl _2).
4. Повторите шаги 4.2 и 4.3 в два раза больше.
5. Центрифуга течение 5 мин при 9600 х г в.
6. Восстановление концентрата путем размещения фильтра с ног на голову в чистом трубки микроцентрифужных и спина в течение 1 мин при 9600 х г. Конечные объемы могут меняться в зависимости от первоначального объема реакционной смеси, что изготовление был введен в фильтр. Обычно 25-60 мкл конечный объем сконцентрированной пробы нанороботов получается.
7. Измерение концентрации ДНК в образцах через спектрофотометре при 260 нм. Использование молекулярную массу 5,3 мкг / пмоль при расчете молярных концентраций образцов нанороботов.
   Примечание: Молярный коэффициент погашения для двухцепочечной ДНК, 50 мкг / ОД _260, достаточно для большинства приложений. 48 мкг / ОД ₂₆₀ учитывает поли тимин онДНК тянется по краям скрепками.

5. Электрофорез в агарозном геле анализ сложенном нанороботы

1. Приготовление 0,5 × КЭ (45 мМ Трис-борат, 1 мМ ЭДТА), 2% агарозном геле с добавлением 10 мМ _MgCl 2 (взято из Эрнесто Кастро и ^{др. 21):}
   1. Подготовка 0.5x TBE буфер разбавления 6,25 мл 10x КЭ фондовой буфера в 118.75 мл DDH _{2 O.}
   2. Растворить 2,5 г агарозы в 125 мл буфера TBE 0.5x.
   3. Варить до тех пор, в микроволновой печи агарозном полностью не растворится.
   4. Добавить 1,25 мл 1 М MgCl _{2 до} конечной концентрации 10 мМ.
   5. Добавить 7 мкл 10 мг / мл этидийбромида.
   6. Подождите немного раствора прохладно и заполнить лоток гель перед агарозном затвердевает гель. Немедленно установить желаемый гребень.
   7. Готовят 1 л 0.5x КЭ рабочего буфера, добавив 50 мл 10x КЭ буферный и 10 мл 1 М MgCl ₂ до 940 мл DDH _{2 O.}
   8. После гель насыщенный Добавить рабочем буфере для электрофореза устройства и положить устройство в бане со льдом.
2. Нагрузка 1 мкг общей ДНК нанороботов предварительной очистки (шаг 3.2), и очистка должность (шаг 4.7), наряду с эшафотаОбразец ДНК и ДНК-маркер 1 кб, на гель. Приведен пример на рисунке 2. Фактические объемы образцов зависит от концентрации, полученных после очистки. Каждый образцы загружается с загрузочного буфера в соотношении 1: окончательного объемном соотношении 6.
3. Установка источника питания до 80 В и запустить гель в течение 3 ч. Запуск гель в ванну, наполненную льдом и водой. Нанороботы будут разворачиваться и появляются в мазке, если агарозном геле нагревается во время электрофореза. Во время электрофореза добавить дополнительную лед, чтобы держать устройство от нагрева.
4. Просмотр гель на УФ таблице (рисунок 2).

6. Отрицательный Пятно нанороботов с уранила формиата-

1. Получение 2% уранила формиат-раствора (адаптировано из Кастро и др ^23.):
   1. Взвесьте 100 мг уранил-формиат порошка в 15 мл трубки.
   2. Отварить ДНКазы / РНКазы сверхчистой водой в течение 3 мин, чтобы де-оксигенат.
   3. Добавьте 5 мл обедненной кислородом горячей воды (~ 60 ° С)в 15 мл пробирку, содержащую уранилкарбонат-формиат порошок (из предыдущего шага). Плотно закройте крышку, завернуть в алюминиевую фольгу и тщательно вихря в течение 10 мин (закрепить трубки для вихря). Решение должно появиться мутная с желтого цвета.
   4. Фильтр решение через шприц фильтром 0,2 мкм. Решение должно стать ясно.
   5. Аликвоты по 200 мкл раствора в микроцентрифужных пробирках.
   6. Центрифуга на максимальной скорости в течение 5 мин в настольную центрифугу с образцами наплывы внизу трубы.
2. Загрузка образца сетки и отрицательного окрашивания:
   1. Размораживание 200 мкл аликвоты 2% раствора уранила формиат-(полученного в разделе 6.1). Добавьте 10 мкл 0,5 М раствора NaOH и вихря строго в течение 3 мин. Центрифуга на максимальной скорости в течение 5 минут с использованием настольную центрифугу.
   2. Между тем, тлеющего разряда сетки с помощью комнатного воздуха на 0,2 мбар и 25 мА в течение 30 сек.
   3. Добавьте 15 мкл 2 нМ нанороботов образца после очистки (sectiна 4,7) на верхней стороне сетки (проводится щипцами), и пусть впитывают в течение 1 мин. Использование фильтром бумагу для слива избытка жидкости, поместив решетку в верхней части фильтровальной бумаги. Не прикасайтесь к поверхности сетки.
   4. Добавьте 10 мкл 2% уранила-формиата (со стадии 6.2.1) на верхней стороне сетки (проводится щипцами).
   5. Быстро использовать фильтром бумагу для слива избытка жидкости, поместив решетку в верхней части фильтровальной бумаги. Не прикасайтесь к поверхности сетки.
   6. Повторите шаги 6.2.4 и 6.2.5.
   7. Добавьте 10 мкл 2% уранила-формиата (со стадии 6.2.1) на верхней стороне сетки (проводится щипцами). Пусть окрашивание раствора впитаться в течение 30 сек.
   8. Использование фильтром бумагу для слива избытка жидкости, поместив решетку в верхней части фильтровальной бумаги. Не прикасайтесь к поверхности сетки.
   9. Пусть сетка полностью высохнуть в течение по крайней мере 30 мин, лицом вверх на фильтровальной бумаге, перед инъекцией в ПЭМ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Типичные результаты показаны на фиг.2А. Все дорожки содержат 1 мкг тотальной ДНК, измеренное с помощью спектрофотометра (OD _260). По сравнению с круговой одножильному помост ДНК (дорожка 2), нанороботы мешает в геле из-за их более высокой молекулярной массой, в результате скоб?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Мы описали изготовление, очищение и визуализацию нанороботов ДНК. После изготовления гексагональной шасси устройства, функция нанороботов запрограммирован с простой внедрения конкретного груза и зондирования нитей на робота, который легко найти их назначенный положение из-за водор?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNase/RNase free distilled water	Gibco	10977
M13mp18 ssDNA scaffold	NEB	N4040S
10x TAE	Gibco	15558-042
1 M MgCl2	Ambion	AM9530G
Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filter 100K MWCO	Amicon	UFC510024
Agarose	Promega	V3125
TBE buffer	Promega	V4251
Ethidium bromide 10 mg/ml solution	Sigma Aldrich	E1510
1 kb DNA marker	NEB	N3232S
Loading Dye	NEB	B7021S
uranyl formate	polysciences	24762
carbon-coated TEM grids	Science services	EFCF400-Cu-50
Thermal Cycler c1000 Touch	Bio-Rad
Glow Discharge K100X	Emitech
UV table Gel Doc EZ Imager	Bio-Rad
NanoDrop 2000c	Thermo Scientific
TEM FEI-G12	Tecnai