Pieghevole e caratterizzazione di un robot bio-reattiva da origami di DNA

Riepilogo

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

Abstract

Il nanorobot DNA è un dispositivo nanometrico cava esagonale, progettato per aprire in risposta a stimoli specifici e presentare merci sequestrate all'interno. Entrambi gli stimoli e le merci possono essere personalizzati in base alle esigenze specifiche. Qui si descrive il protocollo di fabbricazione nanorobot DNA, con l'uso della tecnica origami di DNA. Il procedimento inizia miscelando brevi graffette DNA filamenti singoli, in una miscela di magazzino che viene poi inserito in un lungo, circolare, scaffold DNA a singolo filamento in presenza di un buffer di piegatura. Un cycler termico standard viene programmato per ridurre gradualmente la temperatura di reazione di miscelazione per facilitare la ricottura graffette da ponteggio, che è la forza guida dietro la piegatura della nanorobot. Una volta che la reazione di piegatura 60 hr è completa, graffette eccesso vengono eliminati utilizzando un filtro centrifugo, seguita da visualizzazione tramite elettroforesi in gel di agarosio-(AGE). Infine, successo fabbricazione del nanorobot viene verificata mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM),con l'uso di uranile-formiato come colorazione negativa.

Introduzione

Gli usi per gli acidi nucleici nanotecnologie sono sbalorditivi. La trattabilità della base Watson-Crick accoppiamento nonché la facilità e relativo basso costo della sintesi su larga scala di oligo misura ² ha generato un'esplosione di applicazioni ³ e ricerca nel campo delle nanotecnologie DNA. Nanotecnologie DNA strutturale, basato sul immobile ^4,5 giunzione Seeman come un elemento fondamentale fa uso di DNA come unità elementare auto-assemblaggio per la costruzione di forme arbitrarie ^6-8.

Il recente sviluppo del DNA ponteggi origami ⁹ tecnica permette per la costruzione di complessi 2D / 3D nano-architetture ^10-12 con precisione sub-nanometrica ed è un percorso efficace per la costruzione di nuovi oggetti funzionali con l'aumentare della complessità e la diversità sorprendente. Il processo di costruzione si basa su un DNA a singolo filamento lungo scaffold, di solito derivato da un genom viralee che può essere piegato attraverso l'ibridazione di centinaia di singoli brevi oligo filamento di DNA definito graffette. La risoluzione strutturale elevato ottenuto con questa tecnica è la diretta conseguenza delle dimensioni naturali del DNA a doppia elica, mentre la riproducibilità della fabbricazione è il risultato della modulazione dei brevi sequenze singolo filamento fiocco per facilitare la massima complementarità idrogeno-bonding realizzabile. Con l'uso di una temperatura di ricottura lenta rampa la creazione più bassa energia, termodinamicamente nanostruttura preferito è raggiunto in alte rese e fedeltà. La semplice applicazione di regole di progettazione di giunzione in un codice di calcolo ha permesso lo sviluppo di strumenti CAD, come caDNAno ^13, che semplifica molto il compito di progettare grandi strutture complesse che contengono centinaia di incroci collegati.

Precedentemente abbiamo descritto la progettazione di un nanorobot DNA con l'ausilio dello strumento ^14,15 caDNAno. Qui ci raffiguriamo la fabbricazione evisualizzazione, tramite microscopia elettronica a trasmissione (TEM), del nanorobot, una cavità nanodevice esagonale 3D, con dimensioni di 35 x 35 x 50 nm ^3, destinato a subire un cambiamento conformazionale in risposta a determinati stimoli predeterminati e presenti carico specifico, tale come proteine ​​o oligonucleotidi di acidi nucleici, sequestrati all'interno. Mentre 12 stazioni di carico sono disponibili all'interno del telaio cavità, il numero effettivo di carico legato differisce a carico di formato. Molecole cargo vanno da piccole molecole di DNA di enzimi, anticorpi e 5-10 nanoparticelle d'oro nm. Cargocan essere sia uniforme o eterogenea, tale che ogni nanorobot contiene una miscela di diverse molecole. Rilevamento avviene tramite due porte a doppia elica disegno di bloccaggio per rilevare proteine, acidi nucleici o altre sostanze chimiche, basato sia su aptasensor ^16,17 o filamento di DNA spostamento ¹⁸ tecnologie. I recenti sviluppi in aptamer protocolli di selezione ^19-21 consentono la progettazione di nanorobot risponderead una gamma sempre crescente di molecole e tipi di cellule.

Lavoro precedenza ha mostrato un nanorobot trasportano un anticorpo specifico, che in seguito al legame al suo antigene può trasmettere sia un inibitore o un segnale prolifica all'interno di specifici tipi cellulari in una popolazione cellulare mista ^15. Una caratteristica interessante di questi nanodispositivi è la loro capacità di svolgere compiti ancora più complessi e controllo logico con l'introduzione di diversi sottotipi nanorobot in una singola popolazione. Recentemente abbiamo dimostrato specifici sottotipi di nanorobot che effettuano sia come regolatori positivi o negativi, che controlla una popolazione effettori contenente un carico molecola attiva ^22.

Il protocollo presentato qui descritta la realizzazione, la purificazione e l'imaging di un nanorobot gated con sequenze sensori aptameri che si legano selettivamente al PDGF per facilitare l'apertura del nanorobot ^15,22. Il processo di fabbricazione descritto è simile al nprocesso di fabbricazione anorobot inizialmente descritto da Douglas et al. ^{15 con} modifiche volte a ridurre la durata complessiva dei processi, aumentando i tassi di rendimento e purificazione.

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Protocollo

1. Preparazione di Staples Pool Miscela

1. Ordinare liofilizzato DNA graffette nanorobot su piastre da 96 pozzetti come elencato nella tabella 1 (vedi Materiali) e normalizzare a 10 nmol. Per una descrizione dettagliata della progettazione e architettura del nanorobot DNA vedere Ben-Ishay et al. ¹⁴ e Douglas et al. ^15).
2. Ricostituire ogni fiocco bene con DNasi / ultrapuro RNasi-free a una concentrazione di 100 micron. Per punti normalizzati a 10 nmol, ricostituire con 100 ml di acqua ultrapura.
3. Pool insieme 20 ml di ogni fiocco usando una pipetta multicanale e di una sterile, 55 ml di soluzione di bacino.
   Nota: Poiché la forma nanorobot è composto di 254 filamenti fiocco (compresi core, Bordi, maniglie e sequenze Guide, Tabella 1), la concentrazione di ciascuno dei punti in piscina Staples è 394 nm. Rimozione di graffette da piscina fiocco, o l'aggiunta di un po 'diverso a volUmes, può ridurre notevolmente la resa, o comunque provocare aggregati spiegate.

2. Preparazione di Fabrication Reaction Miscela

1. Per una miscela di reazione standard di utilizzare 40 ml di M13mp18 virale genoma circolare singolo filamento di DNA, corrispondenti a 4 pmol di ponteggio DNA (100 nM soluzione madre, vedi Materiali). Concentrazione finale del ponteggio nella miscela fabbricazione è di 20 nm, volume finale di 200 ml.
   1. Regolare la quantità di DNA patibolo in base alle esigenze specifiche; tuttavia, mantenere la concentrazione finale di scaffold DNA nella miscela di reazione ad una costante di 20 nM.
2. Aggiungere punti per raggiungere un ponteggio di graffette rapporto di 1 a 10, rispettivamente. Per una concentrazione di 20 nM impalcatura di DNA, ciascuna delle concentrazione finale dei 254 punti "è di 200 nm. Per un volume di reazione finale microlitri 200 aggiungere 102 ml di miscela Staples piscina (punto 1.2).
   1. Aggiungi specifiche sequenze di cancelli separatamente the miscela di reazione pieghevole in questo momento. Questi oligo sono ordinati separatamente e richiedono purificazione HPLC. Assicurarsi che oligo gate sono presenti in 1:10 scaffold Gate rapporto sequenza, cioè 200 nM di ciascun oligo di 20 nM concentrazione ponteggio. Per un volume di reazione di piegatura 200 microlitri, aggiungere 0,4 ml per ciascuna delle quattro oligo Gate a una concentrazione di 100 mM magazzino.
3. Aggiungere 10x TAE magazzino tampone per raggiungere una concentrazione finale di 1x TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA). Per un volume di reazione pieghevole 200 ml, aggiungere 20 ml di 10x TAE.
4. Aggiungere 1 M MgCl ₂ ad una concentrazione finale di 10 mM. Per un volume di reazione di piegatura 200 microlitri, aggiungere 2 ml di 1 M MgCl _2.
5. Aggiungere 36 ml di DNasi / RNasi acqua ultrapura gratuito per un raggiungere un volume finale di 200 ml.
6. Campioni Vortex e un'aliquota di 100 microlitri in fiale per PCR.
   Nota: consultare le specifiche termociclatore per quanto riguarda i volumi massimi di reazione da utilizzare.Riducendo il volume di rispettare tali limiti non ridurrà le rese ottenute. Volumi di reazione al di sopra del massimo specificato metterà in pericolo le rese.

3. temperatura di ricottura Rampa di Fabrication Reazione

1. Programma termociclatore come segue:
   1. Rampa 85 ° C a 60 ° C ad una velocità di 5 min / ° C.
   2. Rampa 60 ° C a 4 ° C ad una velocità di 75 min / ° C.
   3. Mantenere a 4 ° C indefinitamente.
2. Dopo la fabbricazione è finita conservare i campioni a -20 ° C.

4. Rimozione di Staples in eccesso

1. Aggiungere 100 pl di miscela di reazione di piegatura ad un filtro centrifugo 0,5 ml con MWCO di 100 kDa. Salvare un campione di 10 ml di nanorobot pre-purificazione per un'analisi successiva.
2. Centrifugare per 10 minuti a 9.600 x g.
3. Aggiungere 400 ml di tampone pieghevole (1x TAE, 10 mM MgCl _2).
4. Ripetere i punti 4.2 e 4.3 per altre due volte.
5. Centrifugare per 5 min a 9.600 x g.
6. Recupero il concentrato posizionando il filtro capovolto in una provetta pulita e centrifugare per 1 min a 9.600 x g. Volumi finali possono variare a seconda del volume iniziale della miscela di reazione fabbricazione che è stato messo nel filtro. Tipicamente si ottiene un volume finale 25-60 microlitri di campione nanorobot concentrato.
7. Misurare la concentrazione di DNA nei campioni tramite spettrofotometro a 260 nm. Utilizzare peso molecolare di 5,3 mg / pmol quando calcolare le concentrazioni molari dei campioni nanorobot.
   Nota: Il coefficiente di estinzione molare per dsDNA, 50 ug / OD _260, è sufficiente per la maggior parte delle applicazioni. 48 mcg / OD ₂₆₀ tiene conto della timina poli ssDNA estende ai bordi graffette.

5. Gel di Agarosio Analisi di Folded Nanorobots

1. Preparazione di 0,5x TBE (45 mM Tris-borato, EDTA 1 mM), 2% gel di agarosio integrato con 10 mM MgCl ₂ (adattato da Ernesto Castro et ^{al. 21):}
   1. Preparare tampone TBE 0.5x diluendo 6,25 ml di 10x TBE buffer in magazzino 118.75 ml di _DDH 2 O.
   2. Sciogliere 2.5 g di agarosio in 125 ml di tampone TBE 0.5x.
   3. Far bollire in forno a microonde fino agarosio è completamente sciolto.
   4. Aggiungere 1,25 ml di 1 M MgCl ₂ alla concentrazione finale di 10 mM.
   5. Aggiungere 7 ml di 10 mg / ml di bromuro di etidio.
   6. Attendere che la soluzione per un po 'freddo e riempire il vassoio gel prima si solidifica gel agarosio. Installa subito pettine desiderato.
   7. Preparare 1 L 0,5x TBE tampone di corsa con l'aggiunta di 50 ml di 10x TBE scorta regolatrice e 10 ml di 1 M MgCl _2-940 ml di _DDH 2 O.
   8. Una volta gel è add solido tampone di corsa al dispositivo elettroforesi e mettere dispositivo in un bagno di ghiaccio.
2. Carico 1 mg DNA totale del nanorobot pre-purificazione (punto 3.2), e la purificazione posta (punto 4.7), a fianco di un ponteggioCampione di DNA e un marcatore DNA 1 kb, sul gel. Un esempio è riportato nella figura 2. Volumi di campioni effettivi dipendono dalle concentrazioni ottenute dopo purificazione. Ogni campione è caricato con tampone di caricamento in un rapporto 1: volume 6 finale.
3. Impostare fonte di alimentazione a 80 V e correre il gel per 3 ore. Eseguire il gel in un bagno riempito con acqua e ghiaccio. Nanorobot spiegheranno e appaiono come una macchia se il gel si riscalda durante l'elettroforesi. Durante l'elettroforesi aggiungere ghiaccio supplementare per mantenere dispositivo da riscaldamento.
4. Vista gel su un tavolo UV (Figura 2).

6. Macchia negativo di nanorobot con uranile-formiato

1. Preparazione di soluzione uranile-formiato 2% (adattato da Castro et ^{al. 23):}
   1. Pesare 100 mg di polvere di uranile-formiato in un tubo da 15 ml.
   2. Bollire DNase / RNase acqua ultrapura gratuito per 3 min per de-ossigenato.
   3. Aggiungere 5 ml di acqua calda deossigenata (~ 60 ° C)nel tubo 15 ml contenente la polvere uranile-formiato (dal passo precedente). Chiudere bene il coperchio, avvolgere in un foglio di alluminio e vortex rigorosamente per 10 min (tubo a fissare un vortice). Soluzione deve apparire torbido con un colore giallo.
   4. Filtro soluzione attraverso un 0,2 micron siringa fi ltro. Soluzione dovrebbe diventare trasparente.
   5. Aliquota 200 ml di soluzione in microprovette.
   6. Centrifugare alla massima velocità per 5 minuti in una centrifuga da tavolo per campioni piscina sul fondo della provetta.
2. Caricamento di campione alla rete e colorazione negativa:
   1. Sbrinare un'aliquota di 200 ml di soluzione di uranile-formiato 2% (preparato nella sezione 6.1). Aggiungere 10 ml di soluzione 0,5 M di NaOH e vortex rigorosamente per 3 min. Centrifugare a massima velocità per 5 minuti con una centrifuga da tavolo.
   2. Nel frattempo, griglia glow-scarico con aria ambiente a 0,2 mbar e 25 mA per 30 sec.
   3. Aggiungere 15 ml di 2 nm campione nanorobot dopo la purificazione (sectisu 4.7) sul lato superiore della griglia (tenuto con una pinza) e lasciate assorbire per 1 min. Utilizzare carta ltro fi per drenare il liquido in eccesso ponendo la griglia sulla parte superiore della carta da filtro. Non toccare la superficie della griglia.
   4. Aggiungere 10 ml di uranile-formiato 2% (dal punto 6.2.1) sul lato superiore della griglia (tenuto con una pinza).
   5. Utilizzare rapidamente carta ltro fi per drenare il liquido in eccesso ponendo la griglia sulla parte superiore della carta da filtro. Non toccare la superficie della griglia.
   6. Ripetere i punti 6.2.4 e 6.2.5.
   7. Aggiungere 10 ml di uranile-formiato 2% (dal punto 6.2.1) sul lato superiore della griglia (tenuto con una pinza). Lasciate soluzione colorante assorbe per 30 sec.
   8. Utilizzare carta ltro fi per drenare il liquido in eccesso ponendo la griglia sulla parte superiore della carta da filtro. Non toccare la superficie della griglia.
   9. Lasciate che la griglia di asciugare completamente per almeno 30 minuti, a faccia in su una carta da filtro, prima di iniettare nel TEM.

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Risultati

Risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 2A. Tutte le corsie contengono 1 mg di DNA totale, misurata mediante spettrofotometro (OD _260). Rispetto al ponteggio circolare DNA a singolo filamento (corsia 2), nanorobots sono ostacolati nel gel causa del loro peso molecolare più elevato, il risultato di graffette ibridazione al DNA ponteggio (Lane 3. Red freccia). La banda basso peso molecolare a Lane 3 rappresenta graffette in eccesso che non si legano al DNA patibol...

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Discussione

Abbiamo descritto la fabbricazione, la purificazione, e visualizzazione del nanorobot DNA. Dopo la fabbricazione del telaio esagonale del dispositivo, la funzione del nanorobot è programmato con la semplice introduzione di carico specifico e fili di rilevamento al robot che facilmente trovare la posizione designata causa idrogeno-bonding complementarità con siti di aggancio disponibile singolo filamento ^{14 , 15,22.}

Il protocollo di fabbricazione descritto utilizza una rampa di r...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNase/RNase free distilled water	Gibco	10977
M13mp18 ssDNA scaffold	NEB	N4040S
10x TAE	Gibco	15558-042
1 M MgCl2	Ambion	AM9530G
Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filter 100K MWCO	Amicon	UFC510024
Agarose	Promega	V3125
TBE buffer	Promega	V4251
Ethidium bromide 10 mg/ml solution	Sigma Aldrich	E1510
1 kb DNA marker	NEB	N3232S
Loading Dye	NEB	B7021S
uranyl formate	polysciences	24762
carbon-coated TEM grids	Science services	EFCF400-Cu-50
Thermal Cycler c1000 Touch	Bio-Rad
Glow Discharge K100X	Emitech
UV table Gel Doc EZ Imager	Bio-Rad
NanoDrop 2000c	Thermo Scientific
TEM FEI-G12	Tecnai