DNA折り紙からバイオ応答ロボットの折りたたみとキャラクタリゼーション

要約

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

要約

DNAのナノロボットは、特定の刺激と内部隔離存在貨物に応じて開くように設計された中空の六角形ナノメートル装置です。どちらも刺激と貨物は、特定のニーズに応じて調整することができます。ここでは、DNA折り紙の技術を使用して、DNAナノロボット製作プロトコルを記述します。そして、処理は、折り畳み緩衝液の存在下で長い、円形、一本鎖DNAの足場に添加された原料混合物中に短い一本鎖DNAのステープルを混合することにより開始します。標準的なサーモサイクラーは、徐々にナノロボットの折り後ろ案内力でステープルツー足場アニーリングを容易にするために、混合反応温度を下げるようにプログラムされています。 60時間のフォールディング反応が完了したら、過剰なステープルは、アガロースゲル電気泳動（AGE）を介して可視化に続いて遠心分離フィルターを使用して廃棄されます。最後に、ナノロボットの成功した製造は、透過型電子顕微鏡（TEM）により確認され、ネガティブ染色としてウラニルギを用いました。

概要

核酸のナノテクノロジーのための用途は驚異的です。ワトソン-クリック塩基対と同様に、カスタムメイドのオリゴ²の大規模合成の容易さと相対的な低コストの扱いやすさは、アプリケーション³およびDNAナノテクノロジーの分野での研究の爆発を生成しました。基本的なビルディングブロックとして不動シーマン接合^4,5に基づいて、構造のDNAナノテクノロジーは、任意の形状^6-8の建設のための自己組織化基本単位としてのDNAを使用しています。

足場のDNA折り紙⁹技術の最近の開発は、サブナノメートルの精度で複雑 ​​な2D / 3Dナノアーキテクチャ^10-12の構築を可能にし、複雑化し、驚くほどの多様性と新しい機能オブジェクトを構築するための効率的なルートです。建設プロセスが長い足場一本鎖DNAに基づくもので、通常はウイルスGENOM由来短い一本鎖DNAオリゴの何百ものハイブリダイゼーションを介して折り畳むことができるeは、ステープルと呼ばれます。製造の再現性が達成可能な最大の水素結合相補性を容易にするために、短い一本鎖の短配列を調整した結果であるが、この技術により得られた高分解能の構造は、DNA二重らせんの自然な寸法の直接的な結果です。遅い高温アニールの使用は設計最低エネルギーをランプでは、熱力学的に好適なナノ構造は、高い収率及び忠実度に到達しました。コンピュータコードにおける接合設計ルールの簡単な実装は非常に接続された接合部の数百人を含む、大規模で複雑 ​​な構造を設計する作業を簡素化するなどcaDNAno ¹³などのCADツールの開発を可能にしました。

これまで我々はcaDNAnoツール^14,15を用いて、DNAのナノロボットの設計を説明しました。ここでは、製造を表しており、透過型電子顕微鏡（TEM）を介して可視化、の寸法のナノロボット、3D中空六角形のナノデバイス、所定の刺激と存在する特定の貨物に応じて大規模な構造変化を起こすように設計された35×35×50 nmの^3、このようなタンパク質や核酸オリゴとして、内部に隔離。 12ロードステーションは、中空シャーシ内部利用可能であるが、バインドされた貨物の実際の数は、貨物のサイズとは異なります。カーゴ分子は、小DNA分子から、酵素、抗体、および5〜10 nmの金ナノ粒子の範囲。どちらCargocan均一または不均一で、各ナノロボットは、異なる分子の混合物を含むようにします。検出はaptasensor ^16,17またはDNAの鎖置換技術¹⁸のいずれかに基づいて、タンパク質、核酸または他の化学物質を感知するために2つの二重螺旋固定ゲート設計を介して達成されます。アプタマー選択プロトコール^19-21における最近の開発は、応答nanorobotsの設計を可能に分子および細胞型の増え続ける範囲。

初期の研究は、その抗原に結合する混合細胞集団¹⁵内の特定の細胞型の内側に抑制または多産の信号のいずれかを中継することができる特異抗体を担持ナノロボットを示しました。これらのナノデバイスのエキサイティングな機能は、単一集団内の異なるナノロボットサブタイプの導入で、より複雑なタスクとロジック制御を実行する能力です。最近では、アクティブなカーゴ分子^22を含むエフェクター集団を制御する、正または負の調節因子のいずれかとして行うnanorobotsの特定のサブタイプを明らかにしました。

ここで紹介するプロトコルは、ナノロボット^15,22の開放を容易にするために、PDGFに選択的に結合するアプタマーセンサー系列でゲートナノロボットの製造、精製およびイメージングを説明します。説明した製造方法は、nと同様です最初に、収率および精製速度を増加させながら、全体的な処理時間を低減することを目的とした変化にダグラスら ¹⁵によって示さanorobot製造プロセス。

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プロトコル

ステープルズプール混合物の調製

1. 表1に記載された96ウェルプレート上に凍結乾燥したDNAナノロボットのステープルを注文（材料を参照）、10ナノモルに正規化します。 DNAのナノロボットの設計とアーキテクチャの詳細についてはベン・Ishay ら ^14、ダグラスらを参照してください^。15）。
2. 100μMの濃度にDNアーゼ/​​ RNaseフリーの超高純度でうまく各ステープルを再構成します。ステープルが10ナノモルに正規化するために、超純水100μlで再構成します。
3. プール一緒にマルチチャンネルピペッターおよび滅菌55ミリリットルソリューション流域を使用して、各ステープルの20μlの。
   注：ナノロボットの形状（コア、エッジ、ハンドルおよびガイド配列を含む、 表1）254短 ​​鎖から構成されているので、ステープル・プール内のステープルの各々の濃度は394 nMです。ステープルプールからステープルを削除するか、別の巻でのいくつかを追加しますリューム、かなりの収率を減少させる、またはそれ以外の場合は折り畳まれていない集合体になることがあります。

製作反応混合物の調製

1. 標準的な反応混合物について（材料を参照してください 、100 nMの原液）足場DNAの4ピコモルに対応し、M13mp18のウイルスゲノム環状一本鎖DNAを40μlを使用しています。製造混合物中の足場の最終濃度は20 nMで、最終容量200μlのです。
   1. 具体的なニーズに応じて足場DNAの量を調整します。しかしながら、一定の20 nmで反応混合物中の骨格DNAの最終濃度を保ちます。
2. それぞれ、1〜10のステープル比に足場に到達するためにステープルを加えます。 20nMの足場DNA濃度について、ステープル254 'の最終濃度の各々は、200nmです。 200μlの最終反応容量についてステープルプール混合物（セクション1.2）の102μlを添加します。
   1. 目に別々に特定のゲート列を追加します。Eは、この時点で、反応混合物を折り畳みます。これらのオリゴは別途注文し、HPLC精製を必要としています。 20 nMの足場濃度について各オリゴのすなわち 200 nMの、ゲートオリゴ1:10足場ゲートにシーケンス比で存在することを確認してください。 200μlのフォールディング反応容量については、100μMのストック濃度で4門オリゴのそれぞれについて、0.4μlを添加します。
3. 1×TAE（40mMのトリス - 酢酸、1mMのEDTA）の最終濃度に到達するために10倍TAEストック緩衝を追加します。 200μlのフォールディング反応容量の場合、10倍TAEの20μlを添加します。
4. 10mMの最終濃度まで、1MのMgCl _2を加えます。 200μlのフォールディング反応容量は、1 MのMgCl ₂の2μlを添加します。
5. 200μlの最終容量に到達するためのDNase / RNaseを含まない超純水36μLを加えます。
6. PCRバイアルにボルテックスし、アリコート100μlのサンプル。
   注：使用される最大反応体積に関するサーマルサイクラーの仕様を参照してください。これらの制限を満たすために音量を小さくすると得られた収率は減少しません。指定された最大上記の反応ボリュームは利回りを危うくします。

製造反応の3高温アニールのランプ

1. 以下のようにプログラムサーマルサイクラー：
   1. 5分/℃の割合で60℃まで85℃に上昇します。
   2. 75分/℃の割合で4℃まで60℃に上昇します。
   3. 無期限に4℃で保持します。
2. 製造後に-20℃で保存するサンプルを終了しました。

過剰ステープルズの4取り外し

1. 100キロダルトンのMWCOと0.5ミリリットル遠心分離フィルターにフォールディング反応混合物の100μLを加えます。後の分析のためにnanorobots予備精製の10μlのサンプルを保存します。
2. 9,600×gで10分間遠心。
3. フォールディングバッファー（1×TAE、10のMgCl _2）400μlのを追加します。
4. 繰り返し二回より4.2と4.3を繰り返します。
5. 9,600×gで5分間遠心。
6. 9,600×gで1分間きれいなマイクロ遠心チューブやスピンに逆さまにフィルタを配置することによって濃縮物を回復します。最終容積は、フィルタに入れ、製造の反応混合物の初期量に依存して変化し得ます。典型的には、濃縮されたナノロボット試料25-60μlの最終容量を得ました。
7. 260nmで分光光度計を経由して試料中のDNA濃度を測定します。ナノロボットサンプルのモル濃度を算出する際に5.3μgの/ピコモルの分子量を使用してください。
   注意：二本鎖DNA、50μgの/ OD ₂₆₀のためのモル吸光係数を_、ほとんどのアプリケーションで十分です。 48μgの/ OD _260は、エッジのステープルの口座に一本鎖DNAが伸びポリチミンを取ります。

二つ折りNanorobotsの5アガロースゲル電気泳動分析

1. 0.5×TBE（45mMのトリス-ホウ酸、1mMのEDTA）を10mMのMgCl ₂を補充した2％アガロースゲルの調製（エルネスト・カストロらから適応^21。）：
   1. ddH ₂ Oの118.75ミリリットルで10倍TBEストック緩衝の6.25ミリリットルを希釈することにより、0.5×TBE緩衝液を準備
   2. 0.5×TBEバッファーの125ミリリットルで、アガロースの2.5グラムを溶解します。
   3. アガロースが完全に溶解するまで電子レンジで煮。
   4. 10mMの最終濃度になるように、1MのMgCl ₂の1.25ミリリットルを追加します。
   5. 10 mg / mlの臭化エチジウムの7μLを加えます。
   6. 少しクールを解決するために待って、アガロースゲル固化する前にゲルトレイを埋めます。すぐに目的の櫛をインストールします。
   7. ddH _{2 Oを} 940ミリリットルに10倍のTBEストック緩衝し、1MのMgCl ₂の10ミリリットルの50ミリリットルを追加することで、ランニング緩衝液1 Lの0.5倍のTBEを準備
   8. ゲル電気泳動デバイスにバッファを実行している固体のアドオンで、氷浴中にデバイスを入れたら。
2. 足場と一緒nanorobots予備精製の負荷1μgの全DNA（ステップ3.2）、および精製後（ステップ4.7）、ゲル上のDNAサンプルと1 kbのDNAマーカー。 例を図2に示す 。試料の実際の体積は、精製後に得られた濃度に依存します。 6、最終体積比：各サンプルは1でローディングバッファーにロードされます。
3. 80 Vに電源​​を設定し、3時間ゲルを実行します。氷と水で満たされた浴中でゲルを実行します。 Nanorobotsは展開し、アガロースゲル電気泳動中に熱くなる場合スメアとして表示されます。電気泳動時の加熱からデバイスを保つために、追加の氷を追加します。
4. 紫外線テーブル上のビューゲル（ 図2）。

ウラニルギでナノロボットの6陰性染色

1. 2％のウラニルギストック溶液の調製（カストロらから適応^23）：
   1. 15ミリリットルチューブにウラニルギ粉末100mgを秤量します。
   2. 3分間沸騰のDNase / RNaseを含まない超純水は、脱酸素化物をします。
   3. 脱酸素したお湯（〜60℃）の5ミリリットルを追加します。（前のステップから）ウラニルギ粉末を含む15mlチューブに。しっかり開閉蓋、10分（渦に締めチューブ）のために厳密にアルミ箔と渦に包みます。溶液は黄色の色で濁って表示されます。
   4. 0.2μmシリンジフィルターで濾過してソリューションを提供します。溶液は透明になるはずです。
   5. 小分けマイクロ遠心チューブに溶液200μl。
   6. チューブの底のプールサンプルにテーブルトップ遠心機で5分間最大速度で遠心。
2. グリッドとネガティブ染色への試料のローディング：
   1. （セクション6.1で調製した）2％ウラニルギ溶液200μlアリコートを解凍。 3分間厳密に0.5 M NaOH溶液と渦の10μLを加えます。テーブルトップ遠心機を用いて5分間、最大速度で遠心。
   2. 一方、グロー放電グリッド0.2ミリバールと30秒25 mAで部屋の空気を使用して。
   3. 精製後2 nmのナノロボットサンプルの15μlのを追加（secti4.7の）鉗子で開催されたグリッド（）の上面上に、1分間に吸収させます。ろ紙の上にグリッドを配置することにより、余分な液体を排出するフィルター紙を使用してください。グリッド表面に触れないでください。
   4. （鉗子で開催された）グリッドの上面に（ステップ6.2.1から）2％のウラニルメート10μlのを追加します。
   5. すぐにろ紙の上にグリッドを配置することにより、余分な液体を排出するフィルター紙を使用しています。グリッド表面に触れないでください。
   6. 繰り返しは6.2.4と6.2.5を繰り返します。
   7. （鉗子で開催された）グリッドの上面に（ステップ6.2.1から）2％のウラニルメート10μlのを追加します。染色溶液を30秒間吸収しましょう​​。
   8. ろ紙の上にグリッドを配置することにより、余分な液体を排出するフィルター紙を使用してください。グリッド表面に触れないでください。
   9. グリッドは、少なくとも30分間完全に乾燥TEMに注入する前に、ろ紙上に直面しよう。

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結果

代表的な結果を図2Aに示されています。すべてのレーンは、分光光度計（OD _260）を介して測定し、合計1μgのDNAが含まれています。環状一本鎖DNAの足場（レーン2）と比較して、nanorobotsは、それらのより高い分子量、骨格DNA（レーン3赤矢印）にステープルハイブリダイゼーションの結果をゲルに妨げられます。レーン3中の低分子量バンドは、足場のDNA（緑の矢...

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ディスカッション

我々は、製造、精製、およびDNAナノロボットの視覚化を記載しています。デバイスの六角形の筐体の製造に続いて、ナノロボットの機能が容易に、利用可能な一本鎖ドッキング部位^14と水素結合相補性への指定位置を見つけ、ロボットに固有の貨物およびセンシングストランドの簡単な紹介とプログラムされています^、15,22。

説明した製造プロトコルは、...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNase/RNase free distilled water	Gibco	10977
M13mp18 ssDNA scaffold	NEB	N4040S
10x TAE	Gibco	15558-042
1 M MgCl2	Ambion	AM9530G
Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filter 100K MWCO	Amicon	UFC510024
Agarose	Promega	V3125
TBE buffer	Promega	V4251
Ethidium bromide 10 mg/ml solution	Sigma Aldrich	E1510
1 kb DNA marker	NEB	N3232S
Loading Dye	NEB	B7021S
uranyl formate	polysciences	24762
carbon-coated TEM grids	Science services	EFCF400-Cu-50
Thermal Cycler c1000 Touch	Bio-Rad
Glow Discharge K100X	Emitech
UV table Gel Doc EZ Imager	Bio-Rad
NanoDrop 2000c	Thermo Scientific
TEM FEI-G12	Tecnai