Dobragem e Caracterização de um robô Bio-responsivo a partir de ADN de Origami

Resumo

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

Resumo

O nanorrobô de DNA é um dispositivo nanométrico hexagonal oco, projetado para abrir em resposta a estímulos específicos e presente de carga sequestradas no interior. Ambos os estímulos e carga podem ser adaptados de acordo com necessidades específicas. Aqui descrevemos o protocolo de fabricação nanorobot ADN, com a utilização da técnica de origami de DNA. O procedimento inicia através da mistura de grampos de ADN de cadeia simples curtos em uma mistura da qual é, em seguida, adicionada a uma longa, circular, de cadeia simples andaime ADN na presença de um tampão de renaturação. Um termociclador padrão é programado para baixar gradualmente a temperatura da reacção de mistura para facilitar o emparelhamento-a-grampos de andaime, a qual é a força condutora por detrás da dobragem da nanorobot. Uma vez que a reacção de dobragem 60 HR está completa, o excesso de grampos são desprezados, utilizando um filtro de centrífuga, seguido de visualização por meio de electroforese em gel de agarose (AGE). Finalmente, o fabrico com sucesso do nanorobot é verificada por microscopia electrónica de transmissão (TEM),com a utilização de uranilo-formiato como coloração negativa.

Introdução

Os usos para os ácidos nucleicos nanotecnologia são surpreendentes. A rastreabilidade da base de emparelhamento de Watson-Crick, bem como a facilidade e baixo custo relativo de síntese em larga escala de feitos sob oligos ² tem gerado uma explosão de aplicações ³ e pesquisas no campo da nanotecnologia de DNA. Nanotecnologia de ADN estrutural, com base no imóvel ^4,5 junção Seeman como um bloco de construção fundamental faz uso de DNA como uma unidade elementar de auto-montagem para a construção de formatos arbitrários ^6-8.

O desenvolvimento recente do DNA origami scaffolded ⁹ técnica permite a construção de complexos nano-arquiteturas 2D / 3D ^10-12 com precisão sub nanômetros e é uma rota eficiente para a construção de novos objetos funcionais com o aumento da complexidade e diversidade surpreendente. O processo baseia-se na construção de um ADN de cadeia simples de comprimento de andaime, usualmente derivada de um genom viralE, que pode ser dobrada através da hibridação de centenas de oligos simples e curtas de DNA strand denominado grampos. A resolução estrutural alta obtida por esta técnica é o resultado directo das dimensões naturais da dupla hélice de ADN, enquanto que a reprodutibilidade de fabricação é o resultado de adaptar as sequências descontínuas de cadeia simples curtos para facilitar o máximo de complementaridade ligações de hidrogénio realizáveis. Com a utilização de uma temperatura de recozimento a rampa lenta concebidos de menor energia, termodinamicamente nanoestrutura preferido é alcançado com altos rendimentos e fidelidade. A fácil implementação de regras de projeto de junção em um código de computador permitiu o desenvolvimento de ferramentas de CAD, tais como caDNAno ^13, que extremamente simplificar a tarefa de projetar estruturas grandes e complexas que contêm centenas de cruzamentos conectados.

Anteriormente tínhamos descrito o desenho de um nanorobot ADN com o auxílio da ferramenta de ^14,15 caDNAno. Aqui nós retratam a fabricação evisualização, através de microscopia eletrônica de transmissão (TEM), do nanorrobô, um nanodevice hexagonal oca 3D, com dimensões de 35 x 35 x 50 nm ^3, destinado a sofrer uma grande mudança conformacional em resposta a um estímulo pré-determinados e presente de carga específica, tais como proteínas ou ácidos nucleicos oligos, sequestrado dentro. Enquanto 12 estações de carga estão disponíveis dentro do chassi oco, o número real de carga limite é diferente com o tamanho da carga. Moléculas de carga variam de pequenas moléculas de ADN de enzimas, anticorpos e nanopartículas de ouro 5-10 nm. Cargocan quer ser homogéneo ou heterogéneo, de modo a que cada nanorobot contém uma mistura de moléculas diferentes. Sensing é conseguido através de dois duplo helicoidal projeto portões de bloqueio para detectar proteínas, ácidos nucleicos ou outros produtos químicos, tanto baseada aptasensor ^16,17 ou fita de DNA deslocamento ¹⁸ tecnologias. Desenvolvimentos recentes em protocolos de seleção de aptâmeros ^19-21 permitir a concepção de nanorobôs respondera uma gama cada vez maior de moléculas e tipos de células.

Trabalhos anteriores mostraram uma nanorobot transportando um anticorpo específico, o qual após se ligar ao seu antigénio pode transmitir quer um efeito inibitório ou um sinal prolífica para o interior de tipos específicos de células numa população de células misturada ^15. Uma característica interessante destes nanodispositivos é a sua capacidade para realizar tarefas mais complexas e até mesmo controle de lógica com a introdução de diferentes subtipos nanorrobôs em uma única população. Recentemente, demonstrou subtipos específicos de nanorrobôs que exercem tanto como reguladores positivos ou negativos, controlando uma população efetoras contendo uma molécula de carga ativa ^22.

O protocolo aqui apresentado descreve a fabricação, de purificação e de imagem de um nanorobot fechado com sequências de aptâmero de sensores que se ligam selectivamente a PDGF para facilitar a abertura da nanorobot ^15,22. O processo de fabrico descrito é semelhante ao nprocesso de fabricação anorobot inicialmente descrito por Douglas et al. ^15, com as alterações que visam reduzir a duração total do processo, ao aumentar as taxas de rendimento e de purificação.

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Protocolo

1. Preparação de Staples Piscina Mistura

1. Encomendar liofilizado DNA grampos nanorrobôs em placas de 96 poços como listadas na Tabela 1 (ver Materiais) e normalizar a 10 nmol. Para uma descrição detalhada do projeto e da arquitetura do nanorrobô de DNA ver Ben-Ishay et al. ^{14 e} Douglas et al. ^15).
2. Reconstituir cada agrafo bem com DNase / RNase-ultrapura livre a uma concentração de 100 uM. Para agrafos normalizados para 10 nmol, reconstitua com 100 ul de água ultrapura.
3. Piscina juntas 20 ul de cada grampo usando um pipetador multicanal e uma bacia de solução estéril de 55 ml.
   Nota: Uma vez que a forma nanorrobô é composta de 254 filamentos descontínuas (incluindo Core, Edges, Puxadores e sequências de Guias, Tabela 1), a concentração de cada um dos grampos na piscina grampos é 394 nM. Retirar os agrafos da piscina grampo, ou adicionando um pouco diferente em volumes, pode reduzir consideravelmente o rendimento, ou de outro modo resultar em agregados não dobradas.

2. Preparação da Mistura de Reacção de Fabricação

1. Para uma mistura de reação padrão usar 40 ul de M13mp18 viral genoma circular de DNA de cadeia simples, o que corresponde a 4 pmol de ADN andaime (100 de solução estoque nM, ver Materiais). A concentração final de andaime na mistura de fabricação é de 20 nm, volume final de 200 ul.
   1. Ajustar a quantidade de ADN de andaime de acordo com necessidades específicas; no entanto, manter a concentração final do ADN andaime na mistura de reacção a uma temperatura constante de 20 nM.
2. Adicionar grampos de andaime para atingir uma razão de grampos de 1 a 10, respectivamente. Para uma concentração de 20 nM DNA andaime, cada uma concentração final os 254 grampos 'é de 200 nm. Para um volume de reacção final de 200 uL adicionar 102 uL da mistura de piscina grampos (secção 1.2).
   1. Adicionar sequências Portão específicos separadamente para the mistura reaccional de dobragem neste momento. Estes oligos são ordenados separadamente e necessitam de purificação por HPLC. Assegurar que os oligos porta estão presentes em uma solução 1:10 andaime para Portão relação sequência, isto é, 200 nM de cada oligo para uma concentração de 20 nM de andaime. Para um volume de reacção de dobrar 200 ul, adicionar 0,4 mL para cada um dos quatro oligo porta a uma concentração de caldo de 100 | iM.
3. Adicionar 10x tampão TAE estoque para atingir uma concentração final de 1x TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM de EDTA). Para um volume de reacção de dobrar 200 ul, adicionar 20 ul de 10 x TAE.
4. Adicionar 1 M _de MgCl2 para uma concentração final de 10 mM. Para um volume de reacção de dobrar 200 ul, adicionar 2 mL de 1 M _de MgCl2.
5. Adicionar 36 ul de DNase / RNase isenta de água ultrapura com uma alcançar um volume final de 200 ul.
6. Amostras de vórtice e alíquota de 100 uL para tubos de PCR.
   Nota: Consultar especificação termociclador sobre os volumes máximos de reacção a serem utilizadas.Reduzindo o volume para atender a esses limites não vai reduzir os rendimentos obtidos. Os volumes de reacção acima do máximo especificado irá comprometer os rendimentos.

3. Temperatura Annealing Rampa de Reacção Fabrication

1. Termociclador programa como segue:
   1. Rampa 85 ° C a 60 ° C a uma velocidade de 5 min / ° C.
   2. Rampa 60 ° C a 4 ° C a uma velocidade de 75 min / ° C.
   3. Manter a 4 ° C indefinidamente.
2. Depois de fabricação terminou armazenar as amostras à temperatura de -20 ° C.

4. A remoção do Staples Excesso

1. Adiciona-se 100 ul de mistura reaccional de dobragem a um filtro de centrífuga de 0,5 ml com um MWCO de 100 kDa. Guardar a uma amostra de 10 ul de pré-purificação nanorobôs para análise posterior.
2. Centrifugar durante 10 minutos a 9.600 x g.
3. Adicionar 400 ul de tampão de dobragem (TAE 1X, _MgCl 2 10 mM).
4. Repita os passos 4.2 e 4.3 vezes mais.
5. Centrifugar durante 5 minutos a 9.600 x g.
6. Recuperar o concentrado colocando o filtro de cabeça para baixo num tubo de microcentrífuga limpo e centrifugação durante 1 min a 9600 x g. Volumes finais pode variar dependendo do volume inicial da mistura de reacção de fabricação que foi colocado dentro do filtro. Tipicamente, um volume final de 25-60 ul de amostra concentrada nanorobot é obtido.
7. Medir a concentração de ADN nas amostras através de espectrofotómetro a 260 nm. Use peso molecular de 5,3 ug / pmol ao calcular as concentrações molares de amostras nanorrobôs.
   Nota: O coeficiente de extinção molar para dsDNA, 50 ug / OD _260, é suficiente para a maioria das aplicações. 48 ug / OD ₂₆₀ leva em conta a timina poli ssDNA se estende aos grampos bordas.

5. Agarose Gel Eletroforese Análise de Dobrado Nanorobots

1. Preparação de TBE 0,5x (45 mM Tris-borato, EDTA 1 mM), 2% de gel de agarose suplementada com 10 _mM de MgCl2 (adaptado de Ernesto Castro et ^{al. 21):}
   1. Prepare tampão TBE 0,5x por diluição de 6,25 ml de tampão de estoque de 10x TBE em 118,75 ml de _DDH 2 O.
   2. Dissolve-se 2,5 g de agarose em 125 ml de tampão TBE 0,5x.
   3. Ferver em microondas até a agarose estar completamente dissolvida.
   4. Adicionar 1,25 ml de 1 M _MgCl2 a concentração final de 10 mM.
   5. Adicionar 7 uL de 10 mg / ml de brometo de etídio.
   6. Aguarde solução para um pouco fria e encher a bandeja de gel antes das solidifica gel de agarose. Instale pente desejado imediatamente.
   7. Prepare 1 litro de tampão TBE 0,5x a executar pela adição de 50 ml de tampão de estoque de 10x TBE e 10 ml de 1 M _de MgCl2 para 940 ml de ddH ₂ O.
   8. Uma vez que é de gel de suplemento sólido tampão de corrida para o dispositivo de electroforese e o dispositivo colocado num banho de gelo.
2. DNA de carga 1 pg total da nanorobôs pré-purificação (passo 3.2), e pós purificação (passo 4.7), ao lado de um andaimeAmostra de ADN e um marcador de ADN de 1 kb, sobre o gel. Um exemplo é dado na Figura 2. Volumes reais de amostras depende das concentrações obtidas após purificação. Cada uma das amostras é carregado com tampão de carga a uma razão de 1: volume final 6.
3. Regule a fonte de energia para 80 V e executar gel durante 3 horas. Submeter o gel em um banho cheio de gelo e água. Nanorobots vai se desdobrar e aparecem como uma mancha se o gel de agarose aquece durante a electroforese. Durante a electroforese adicionar gelo adicional para manter dispositivo de aquecimento.
4. Ver em gel numa mesa de UV (Figura 2).

6. coloração negativa de nanorrobô com uranilo-formato

1. Preparação da solução de 2% uranyl-formato (adaptado de Castro et ^al 23.):
   1. Pesar 100 mg de pó de uranilo-formiato para um tubo de 15 ml.
   2. Ferva DNase / RNase água ultrapura livre por 3 min de-oxigenado.
   3. Adicionar 5 ml de água quente deoxygenated (~ 60 ° C)para dentro do tubo de 15 ml que contém o pó de uranilo-formiato (a partir do passo anterior). Feche bem a tampa, embrulhe em folha de alumínio e vortex rigorosamente por 10 min (tubo de fechamento para um vórtice). Solução deve aparecer turva, com cor amarela.
   4. Filtrar a solução através de uma seringa de 0,2 um fi ltro. Solução deve ficar clara.
   5. Alíquota de 200 ul da solução em tubos de microcentrífuga.
   6. Centrifuga-se a velocidade máxima durante 5 minutos numa centrífuga de topo de mesa para agrupar as amostras na parte inferior do tubo.
2. Carregando de amostra a grade e coloração negativa:
   1. Descongelar uma alíquota de 200 ul de solução de uranilo-formiato de 2% (preparada na secção 6.1). Adicionar 10 ul de solução de NaOH 0,5 M e rigorosamente vortex durante 3 min. Centrifuga-se a velocidade máxima durante 5 minutos, utilizando uma centrífuga de topo de mesa.
   2. Enquanto isso, a grade de descarga luminescente usando ar ambiente a 0,2 mbar e 25 mA durante 30 segundos.
   3. Adicionar 15 ul de 2 nM amostra nanorrobô após purificação (seçem 4.7) para topside da grade (realizada com fórceps) e deixe absorver durante 1 min. Use papel fi ltro para drenar o excesso de líquido através da colocação da grade na parte superior do papel de filtro. Não toque na superfície da grelha.
   4. Adicionar 10 ml de 2% uranyl-formato (do passo 6.2.1) para o topside da grade (realizada com uma pinça).
   5. Rapidamente use papel fi ltro para drenar o excesso de líquido através da colocação da grade na parte superior do papel de filtro. Não toque na superfície da grelha.
   6. Repita os passos 6.2.4 e 6.2.5.
   7. Adicionar 10 ml de 2% uranyl-formato (do passo 6.2.1) para o topside da grade (realizada com uma pinça). Vamos solução de coloração absorver durante 30 segundos.
   8. Use papel fi ltro para drenar o excesso de líquido através da colocação da grade na parte superior do papel de filtro. Não toque na superfície da grelha.
   9. Deixe secar completamente a grade por pelo menos 30 min, viradas para cima em um papel de filtro, antes de injetar na TEM.

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Resultados

Os resultados representativos são mostrados na Figura 2A. Todas as pistas contêm 1 ug de ADN total, medido através de espectrofotómetro (OD _260). Em comparação com a circular andaime de ADN de cadeia simples (pista 2), nanorrobôs são prejudicadas no gel devido ao seu peso molecular mais elevado, o resultado de grampos hibridação com o ADN de andaime (Pista 3. Vermelho seta). A banda de baixo peso molecular na pista 3 representa grampos em excesso que não se ligam a...

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Discussão

Descrevemos a fabricação, a purificação, e a visualização da nanorobot ADN. Após o fabrico do chassi hexagonal do dispositivo, a função do nanorobot é programado com a simples introdução de carga específica e fios de detecção para o robô que facilmente encontrar a sua posição designada devido à complementaridade ligações de hidrogénio com os locais de ligação disponíveis de cadeia simples ^{14 , 15,22.}

O protocolo de fabricação descrito utiliza uma rampa d...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNase/RNase free distilled water	Gibco	10977
M13mp18 ssDNA scaffold	NEB	N4040S
10x TAE	Gibco	15558-042
1 M MgCl2	Ambion	AM9530G
Amicon Ultra 0.5 ml centrifugal filter 100K MWCO	Amicon	UFC510024
Agarose	Promega	V3125
TBE buffer	Promega	V4251
Ethidium bromide 10 mg/ml solution	Sigma Aldrich	E1510
1 kb DNA marker	NEB	N3232S
Loading Dye	NEB	B7021S
uranyl formate	polysciences	24762
carbon-coated TEM grids	Science services	EFCF400-Cu-50
Thermal Cycler c1000 Touch	Bio-Rad
Glow Discharge K100X	Emitech
UV table Gel Doc EZ Imager	Bio-Rad
NanoDrop 2000c	Thermo Scientific
TEM FEI-G12	Tecnai