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Resumen

El desarrollo de las proteínas de fusión biotinylatable tiene muchas aplicaciones potenciales en diversos campos de la investigación. La ingeniería de proteínas recombinantes es un procedimiento recta hacia adelante que es rentable, proporcionando altos rendimientos de proteínas de diseño personalizado.

Resumen

La ingeniería de proteínas recombinantes ha utilizado la Escherichia coli (E. coli) sistemas de expresión para casi 4 décadas, y en la actualidad E. coli es todavía el organismo huésped más utilizado. La flexibilidad del sistema permite la adición de restos tales como una etiqueta de biotina (para las interacciones de estreptavidina) y proteínas funcionales más grandes, como la proteína verde fluorescente o la proteína rojo cereza. Además, la integración de los aminoácidos no naturales tales como quelantes de iones metálicos, grupos funcionales reactivos de forma única, sondas espectroscópicas, y moléculas que imparten las modificaciones post-traduccionales ha permitido una mejor manipulación de propiedades de la proteína y funcionalidades. Como resultado de esta técnica crea proteínas de fusión adaptables que ofrecen una utilidad significativa para los distintos ámbitos de investigación. Más específicamente, la secuencia de la proteína biotinylatable se ha incorporado en muchos proteínas diana debido a la alta interacción de afinidad entre la biotina con la avidina y estreptavidina. Esta adición ha ayudado a mejorar la detección y purificación de proteínas etiquetadas, así como abrir el camino para aplicaciones secundarias como la clasificación de células. Así, las moléculas marcadas con biotina muestran una influencia creciente y generalizada en los campos bioindustriales y biomédicas. Para el propósito de nuestra investigación hemos diseñado proteínas de fusión biotinilada recombinantes que contienen el factor de crecimiento nervioso (NGF) y semaphorin3A (Sema3A) regiones funcionales. Hemos informado anteriormente de cómo estas proteínas de fusión biotinilada, junto con otras secuencias de proteínas activas, pueden ser atados a biomateriales para la ingeniería de tejidos y propósitos de regeneración. Este protocolo describe los conceptos básicos de las proteínas biotinylatable ingeniería en la escala de miligramos, utilizando un vector lac inducible T7 y E. Los huéspedes de expresión de E. coli, a partir de la transformación a escala de tratamiento y purificación.

Introducción

Proteínas cubren una amplia gama de biomoléculas que son responsables de muchas funciones biológicas, en última instancia conduce a la formación de tejido adecuado y la organización. Estas moléculas inician miles de vías de señalización que controlan la regulación y / o baja regulación de genes y otras proteínas, mantener el equilibrio en el cuerpo humano. La interrupción de una sola proteína afecta a toda esta red de señales, que puede conducir a la aparición de trastornos o enfermedades devastadoras. Ingeniería de proteínas individuales en el laboratorio ofrece una solución para combatir estos efectos adversos y ofrece una alternativa a los fármacos de moléculas pequeñas. En 1977, un gen que codifica la secuencia de aminoácidos de la somatostatina 14 fue uno de los primeros polipéptidos creados por ingeniería utilizando E. coli 1. Poco después, en 1979, la insulina fue clonado en el plásmido pBR322, transformada, expresó, y purificado 2. Desde entonces, las proteínas recombinantes han ampliado su influencia en varios campos de la research como biomateriales, la administración de fármacos, ingeniería de tejidos, productos biofarmacéuticos, la agricultura, enzimas industriales, biocombustibles, etc (para revisiones ver referencias 3-8). Esto se debe en gran parte a la versatilidad que ofrece la técnica a través de la adición de restos químicos específicos de la aplicación o las secuencias de proteínas para propósitos incluyendo, pero no limitado a, la identificación de proteínas diana, estabilización y purificación.

A través de la tecnología del ADN recombinante, las proteínas recombinantes se pueden expresar en una variedad de sistemas de huésped eucariotas y procariotas incluyendo mamíferos, plantas, insectos, levaduras, hongos o bacterias. Cada anfitrión ofrece diferentes ventajas y por lo general el mejor sistema es determinado con base en la función de la proteína, el rendimiento, la estabilidad, el coste total, y la escalabilidad. Las células bacterianas a menudo carecen de los mecanismos de modificación después de la traducción que proporcionan huéspedes eucariotas (es decir, la glicosilación, disulfuro de transición, e tc.) 5. Como resultado, los sistemas de mamíferos y de insectos generalmente resultan en una mejor compatibilidad y la expresión de proteínas eucarióticas, sin embargo estos anfitriones son típicamente más caro y consume mucho tiempo 9. Por lo tanto, E. coli es el anfitrión favorito para nuestro sistema de expresión porque las células se expanden rápidamente en condiciones de crecimiento de bajo costo y los mecanismos de expresión genética se entienden bien 5,9. Además, este sistema es fácil de escalar-para fines de producción y los resultados en las proteínas funcionales a pesar de la falta de modificaciones post-traduccionales 10. La E. coli cepa K12 se elige en este protocolo para la clonación porque esta cepa ofrece excelentes rendimientos de plásmido basado en la alta eficiencia de transformación. Además, una E. coli cepa BL21 se utiliza para la expresión, porque esta cepa huésped contiene el gen de la polimerasa de ARN de T7, que proporciona expresión de la proteína controlada y la estabilidad 11.

tienda de campaña "> Después de la selección de acogida, además se debe tener cuidado en la selección del vector de expresión ideal para facilitar la expresión de la proteína seleccionada y controlada. síntesis de proteínas recombinantes comienza con una secuencia de ADN diana que se clona bajo la dirección de las señales de traducción de la transcripción del bacteriófago T7 y, y expresión es inducida en las células huésped que contienen copias cromosómicas del gen de ARN polimerasa de T7 12. Estos vectores, derivados de pBR322 plásmido vector (para una revisión véase la referencia 13), están estrechamente controlada por el promotor de T7 desarrollado inicialmente por Studier y colegas 14 y proporcionar adicional control a través de la inclusión del operador lac y represor lac (LAC1) 15,16. Para la ingeniería de proteínas recombinantes, este sistema de expresión ofrece la posibilidad de adaptar una secuencia específica de aminoácidos de una proteína deseada mediante la inserción de diferentes secuencias de ADN diana o para crear proteínas de fusión compuesto por dominio combinados de proteínas individuales. Además, algunas series de vectores incluyen modificaciones de etiquetas peptídicas que ser colocados en el extremo N o C. Para nuestros fines de diseño, se añadió una histidina (His) de etiquetas a la secuencia diana de ADN para la purificación y una secuencia de biotinylatable 15 aminoácidos se incluyó para biotinilación 17,18. En este protocolo un plásmido que contiene un gen de resistencia a ampicilina, fue elegido para llevar las secuencias de proteínas de fusión biotinylatable. Expresión se controla en este vector a través del promotor lac de T7 y es fácilmente indujo con isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG).

Expresiones de ensayo (cultivos a pequeña escala) se utilizan para determinar la presencia y la solubilidad de la proteína diana, que se puede expresar en cualquiera de una forma soluble o insoluble para formular procedimientos de purificación. Una proteína soluble expresado dentro de la célula de las bacterias se someterá plegado espontánea para mantener su estructura nativa 19. Por lo general el nativoestructura es termodinámicamente favorable. En muchos casos, la actividad metabólica del anfitrión no es propicio para la proteína diana, la colocación de la tensión en el sistema que conduce a la producción de proteína insoluble y la formación de cuerpos de inclusión compuestas de agregados de proteínas insolubles. Por lo tanto la proteína diana se desnaturaliza, haciéndolos generalmente biológicamente inactivo 20. Ambas expresiones de prueba se escalan en marcha, y los procedimientos de aislamiento se determinan por la solubilidad de la proteína diana. Se requiere una renaturalización adicional o replegamiento paso para proteínas insolubles. Las proteínas recombinantes resultantes se pueden purificar adicionalmente usando cromatografía de exclusión de tamaño.

En la casa de producción de proteínas recombinantes ofrece ventajas de costes sobre los productos comerciales desde miligramos de proteína diana se pueden aislar por litro de cultivo principal. La mayor parte del equipo necesario está disponible en un laboratorio biológico o químico típico. La ingeniería de proteínas permite la creaciónde proteínas de fusión de encargo con funcionalidades adicionales que no siempre están disponibles comercialmente. La Figura 1 representa los principales procedimientos involucrados en la ingeniería de proteínas recombinantes. Con este sistema de expresión que hemos creado muchas proteínas biotinylatable, como el interferón gamma, factor de crecimiento derivado de las plaquetas, y la proteína morfogenética ósea-21-23, pero nos centraremos en dos proteínas que hemos diseñado para el guiado de los axones, NGF (29 kDa ) y Sema3A (91 kDa) 10 (para una revisión véase la referencia 24). La biotinilación es una técnica común para la identificación, la inmovilización y el aislamiento de proteínas marcadas que utilizan la interacción biotina-estreptavidina bien conocido 25-27. Sondas biofísicos 28,29, biosensores 30 y 31 puntos cuánticos son algunos ejemplos de sistemas que utilizan la alta afinidad de la conjugación de biotina-estreptavidina con una K d del orden de 10 -15 M 27. La E. bio coliligasa estaño, BirA, ayuda en la unión covalente de biotina a la cadena lateral de lisina se encuentra dentro de la biotina etiquetada secuencia de 18,32. Tethering biotina a los materiales y biomoléculas ha producido la liberación sostenida de factores de crecimiento a los teléfonos para múltiples aplicaciones de ingeniería de tejidos 21,33-35. Por lo tanto, la ingeniería de estas proteínas biotinylatable de diseño personalizado es una herramienta poderosa que puede trascender los múltiples intereses de investigación.

Protocolo

1. Proyeccion de proteína diana

  1. Uso del Centro Nacional para la Información Biotecnológica sitio web (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) obtener una secuencia de aminoácidos de la proteína diana, teniendo en cuenta las especies de interés y las posibles variantes de empalme. Seleccionar la secuencia de aminoácidos que corresponde a la región activa de interés de la proteína.
    Nota: Para Sema3A, se eligieron los aminoácidos 21-747. Una proteína de fusión fue diseñado con NGF en donde la secuencia de barstar, aminoácidos 1-90, se añadió a los aminoácidos 122 a 241 de NGF.
  2. Para la N-terminal añaden las secuencias siguientes: 6X-Su etiqueta para la purificación (HHHHHH), virus del grabado del tabaco (TEV) sitio de corte de la proteasa para el retiro de su etiqueta (ENLYFQG), biotina etiquetada secuencia de biotinilación de proteínas en K (GLNDIFEAQKIEWHE) y bisagra flexible con lagunas que permitirán espacio para el replegamiento de proteínas adecuada (EFPKPSTPPGSSGGAP).
    Nota: Estas secuencias pueden variar dependiendo de la prot de fusión deseadaein.
  3. Enviar secuencia de aminoácidos completa a una empresa para el gen de diseño / optimización para las especies huésped deseadas y síntesis. Subclónese en un vector de elección de usar el sitio BamHI-NotI usando un kit o mediante la utilización de los servicios comerciales.

2. Fabricación de las placas de agar

Nota: Es muy importante que todas las existencias de antibióticos, placas, tampones, etc se almacenan correctamente (temperatura y duración) y permanecer libre de las proteasas (esterilizada).

  1. Pesar agar al 1,5% en peso y el caldo lysogeny (LB) a 20 g / L y colocar en una botella de vidrio de medios. Una botella de 500 ml de hace unos 15 platos.
  2. Añadir Volumétricamente agua ultrapura, mezclar bien y autoclave.
  3. Deje la botella fría al tacto y añadir los antibióticos apropiados. Evite la solidificación prematura de agar, sin embargo, si la botella se enfría demasiado y la solución comienza a congelar, recalentar en el microondas.
    Nota: Nuestra plásmido contiene un gen de resistencia a ampicilinae. Por lo tanto, todos los pasos deben contener ampicilina a 100 mg / ml. La E. coli cepa K12 de clonación requiere tetraciclina (12,5 mg / ml) a los antibióticos. Células de las bacterias BL21 no requieren ningún antibiótico adicional.
  4. Vierta 25-30 ml de solución en 90 mm placas de Petri y dejar tiempo para secarse.
  5. Plato de etiquetas con los antibióticos apropiados y almacenar al revés en 4 ° C, con Parafilm o en una bolsa con cierre.
    Nota: Las placas son buenas para aproximadamente un mes.

3. Clonación de la biotina marcada con etiqueta del plásmido

Nota: Las condiciones se realizan asépticamente.

  1. Decantar plásmido vector en 6000 xg durante 3 minutos con el fin de sedimentar, y añadir 10 l de agua ultrapura esterilizada.
  2. Retire 50 l de E. químicamente competentes coli células de alta eficiencia de transformación de -80 ° C y se coloca inmediatamente en hielo durante 5 a 10 min.
  3. Añadir 1 l de solución de vector en 0,5-1 ng/5056; l células a la 50 l de E. coli células y colocar el plásmido restante en -80 ° C.
  4. Colocar las células de las bacterias que contienen el vector en hielo durante 5 min.
  5. El choque térmico de la célula y la mezcla de vectores durante 30-45 segundos en 42 ° C baño de agua y colocar las células de espalda en hielo durante 2 min.
  6. Añadir 250 l de caldo de súper óptima con la represión de catabolitos (SOC) medio (2% w / v de Bacto-triptona, 0,5% w / v de extracto de Bacto-levadura, NaCl 8,56 mM, 2,5 mM de KCl, 20 mM de MgSO4, 20 mM de glucosa , agua ultrapura, pH = 7,0) y agitar a 250 rpm a 37 º C durante 30 min.
    Nota: SOC no debe esterilizarse en autoclave, pero se esterilizó por filtración a través de un filtro de 0,22 micras.
  7. Placas secas 10-15 min antes de células en placas.
  8. Pipetear 25, 50, y 100 l de solución de células en placas de agar separadas que contienen la ampicilina (100 mg / ml) y tetraciclina (12,5 mg / ml) antibióticos. Utilice cuentas de vidrio para distribuir la solución de manera uniforme sobre las placas de agar.
  9. Incubar las placas boca abajo a 37 ° C durante 15-18 horas.
  10. Compruebe si hay pequeñas colonias de bacterias individuales en placas y almacenar al revés a 4 ° C hasta su uso posterior (Figura 2A).
    1. Si no hay colonias están presentes:
      1. Compruebe la frescura y la esterilidad de los tampones y los suministros.
      2. Aumente la cantidad de plásmido añadido E. coli cepa K12.
    2. Si grandes colonias están presentes o si hay un crecimiento excesivo de las colonias (Figura 2B y 2C), restreak una nueva placa de agar con un asa de inoculación estéril o células de la placa a menor volumen.
  11. Inocular 5 ml de LB que contiene ampicilina (100 mg / ml) y tetraciclina (12,5 mg / ml) antibióticos con una sola colonia de E. transformado células de E. coli. Las células crecen en marcha durante la noche a 37 ° C a 250-300 rpm.
  12. Al día siguiente, utilice un kit de aislamiento de plásmidos con el fin de aislar el vector objetivo del gro durante la nochew-up store y purificado de plásmido a -80 ° C hasta su uso posterior.
    1. Opcional: comprobación de la pureza y la concentración de plásmido mediante lectura de la absorbancia obtenida a 260 y 280 nm.

4. Transformación de plásmido en Expresión Anfitrión

Nota: Las condiciones se realizan asépticamente.

  1. Repita los pasos 03.02 a 03.10 para E. células de E. coli BL21 con los siguientes cambios:
    Nota: las células BL21 no requieren antibióticos adicionales, por lo tanto, sólo la ampicilina se añade a las placas de agar para la transformación.
    1. Añadir 2-5 l de plásmido aislado a 0,5-2 ng/50 células mu l de paso 3,12-50 l E. células huésped de expresión coli.
    2. Células de choque térmico de 60 a 90 seg.
    3. Agitar solución que contiene medio SOC a 250 rpm durante 60 min en lugar de 30 min.
  2. Arranca una sola colonia de células de las bacterias transformadas de la placa de Petri con una sterile aplicador y colocar en un tubo de ensayo que contiene 5 ml de LB caldo con la concentración adecuada de ampicilina (100 mg / ml).
  3. Colocar tubos de ensayo en la coctelera durante la noche a 37 ° C a 250 rpm.
  4. A la mañana siguiente, tome 200 l de la noche a la mañana creciendo en marcha y añadirlo a 5 ml de LB que contiene ampicilina a 100 mg / ml.
  5. Congele hasta las células restantes con 250 l 50% de glicerol (estéril) a 750 l cultura y tener en -80 ° C.
    Nota: Nueva expresión de la prueba y los procedimientos de escalado se puede hacer mediante el uso de un aplicador estéril para obtener un raspado de células congeladas e inoculando LB con los antibióticos apropiados.
  6. Coloque tubo de ensayo en agitador a 250-300 rpm a 37 ° C hasta que la densidad óptica (DO) se mide entre 0,7-0,8 a una absorbancia de 600 nm.
  7. Inducir a las células con IPTG a una concentración final de 1 mM.
  8. Agitar durante una 4 horas adicionales a 37 ° C a 300 rpm. Alternativamente las células también puedense sacudió durante la noche a 18 ° C a 250-300 rpm. Esto puede producir un mayor rendimiento de plásmido dependiendo de la proteína diana.
  9. Dodecil sulfato de sodio poliacrilamida electroforesis en gel (SDS-PAGE) Análisis de expresión de prueba
    1. Tomar 500 l de la cultura y el lugar en un tubo de 1,5 ml. Haga girar hacia abajo a 13-15 g durante 5 min. Vierta el líquido sobrenadante y la etiqueta "Soluble." Resuspender el sedimento con agitación en vórtex en 200 l de colorante de carga (50 l 2-mercaptoetanol, 950 l de tampón de muestra de Laemmli).
      Nota: pellets de bacterias solubles se utilizarán para determinar si la proteína recombinante es en las regiones citoplasmáticas de las células de las bacterias. Los pellets pueden ser almacenados en -80 ° C sin colorante de carga hasta que se necesite. Un cultivo de bacterias de control que no ha sido transformada o inducida puede ser tratada como solubles, así como para la comparación.
    2. Tome 1.000 l de la cultura y el lugar en un tubo de 1,5 ml. Haga girar hacia abajo a 13-15 g durante 5 min.Vierta el líquido sobrenadante y la etiqueta "insoluble".
      Nota: sedimentos insolubles se someterán a los procedimientos de desnaturalización a continuación con el fin de liberar proteínas que se encuentran en cuerpos de inclusión de células de las bacterias. Los pellets pueden ser almacenados en -80 ° C hasta que se necesite. Un cultivo de bacterias de control que no ha sido transformada o inducida puede ser tratada como insolubles, así como para la comparación.
      1. Resuspender el sedimento insoluble en 200 l Bugbuster y dejar a temperatura ambiente durante 30 min.
      2. Centrifugar la muestra de nuevo a 13-15 g durante 5 min y tomar 50 l de sobrenadante y añadirlo a la nueva "Insoluble" tubo de 1.5 ml.
      3. A continuación, añadir 50 l de colorante de carga a esta nueva muestra.
    3. Hervir ambas muestras solubles e insolubles durante 5 min para desnaturalizar las proteínas para el análisis de SDS-PAGE.
    4. Cargue cada muestra en un gel de electroforesis con escalera estándar.
    5. Con el fin de visualizar las muestras de proteína utilizan un staining de reactivo y seguir el protocolo de la compañía.
    6. Determinar si la proteína se expresa en las fracciones solubles y / o insolubles mediante la comparación de estos dos carriles, así como la comparación de los carriles a los carriles solubles e insolubles de control (véase la Nota 4.9.1 y 4.9.2) en el gel de SDS-PAGE (Figura 2). Una banda oscura debería aparecer alrededor del peso molecular de la proteína en los carriles solubles o insolubles. Esto determinará que el aislamiento procedimiento a utilizar en el Protocolo 6.
      Nota: Si hay una banda en ambas de estas regiones que cualquiera de aislamiento utilizado en el Protocolo 6 a continuación se puede realizar, o la proteína se puede aislar en ambos sentidos con el fin de determinar qué método de aislamiento produce un mayor rendimiento de la proteína recombinante (Figura 3) .
    7. Si se realizó una hora y durante la noche de inducción 4, determinar qué método de inducción tiene la producción de proteína más alta para el proceso de ampliación (Figura 2).

5. Escalamiento Procedimiento y Cultura Principal

  1. Preparar medio de crecimiento con 85,7 g de caldo Terrific Broth y 28,8 ml de 50% de glicerol en 1,8 L de agua ultrapura y en autoclave de ciclo de líquido durante 1 hora.
  2. Inicie un cultivo nocturno de células madre congelada creado en el paso 4.5.
    Nota: Las condiciones se realizan asépticamente.
    1. Mezclar 20 ml de LB y con una concentración final de ampicilina a 100 g / ml en un matraz Erlenmeyer de 125 ml estéril.
    2. El uso de un aplicador estéril tomar un desguace de transformado E. coli células y aplicador gota en el matraz. Retire aplicador y el frasco con tapón tapón de espuma o algodón y cubrir con papel de aluminio para mantener la esterilidad.
    3. Agite durante la noche a 250 rpm a 37 º C.
  3. Cultura Principal
    Nota: Las condiciones se realizan asépticamente.
    1. Vierta cultivo de una noche en 1,8 L de medio de cultivo estéril y añadir ampicilina a 100 g / ml y 6 a 8 gotas de antiespumante estéril 204 usando una pipeta Pasteur.
    2. Culturas lugar en un 37 ° C baño de agua con 0,2 mm filtrados burbujeo de aire comprimido en las culturas a través de las piedras de aireación.
    3. Una vez que la OD 600 nm alcanza 0,7-0,8, inducir con IPTG (1 mM) y permitir la inducción que se produzca, ya sea para 4 horas a 37 ° C o durante la noche a 18 ° C dependiendo de los resultados solubles / insolubles de SDS-PAGE en el paso 4.9.
  4. Recopilación de E. Las células de E. coli
    1. Centrifugar el cultivo celular en botellas de 1 L de centrifugadora (de 2 botellas / cultivo) durante 15 min a 14.000 xg a 4 ° C.
    2. Retirar el sobrenadante y usando una espátula fina, cucharada a las bacterias de pellets en dos tubos de 50 ml. Las células se pueden sedimentaron de nuevo por centrifugación durante unos pocos minutos.
      Nota: Cada cultura 1,8 L resultará en dos pellets de bacterias, uno en cada tubo de centrífuga de 50 ml.
    3. Bolitas en tienda a -80 C hasta que el aislamiento de proteínas.

6. Aislamiento y purificación de la proteína recombinante

Nota: Si la proteína se encuentra en la región soluble a base de análisis SDS-PAGE de la etapa 4.9, se utilizará "aislamiento nativo", pero para las proteínas insolubles procedimientos "Isolation no nativas" se llevará a cabo.

  1. La lisis celular
    1. No nativos
      1. Retire transformado E. coli de pellets de -80 ° C congelador, y añadir 20 ml de lisis / tampón de lavado (Tabla 1) a cada tubo de centrífuga.
      2. Vortex y agitar el sedimento congelado hasta que se descongele y se disuelve en la solución tampón sin grandes trozos. Incubar en nutator durante la noche. A la mañana siguiente, el precipitado debe ahora ser una suspensión viscosa debido a la desnaturalización de la proteína de la memoria intermedia.
      3. Centrifugar la suspensión a 20.500 x g a temperatura ambiente durante 30 min. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo para el aislamiento y desechar el sedimento.
    2. Nativo
      1. Obtener la transformada E. pellets coli de -80 ° C congelador.
      2. Añadir Tampón de Lisis (Tabla 1) al tubo de centrífuga para llegar a un volumen final de 30 ml, y desalojar congelado en gránulos por agitación y agitación rigurosa. Coloque pellet en hielo.
      3. Lavar sonicador de sonda con etanol al 70% a 100% de la amplitud durante 1-2 minutos. A continuación, repita con agua ultrapura.
      4. Bacterias Sonicar pellets mientras en hielo durante 5 min (tiempo total de 10 min).
        1. Set de ultrasonidos a 30% de la amplitud con el pulso de 30 segundos on/30 s apagado.
        2. Tubo de centrífuga Bob arriba y hacia abajo durante el intervalo de ultrasonidos para romper completamente el sedimento celular. Al final del tiempo total transcurrido no debe haber bacterias visibles de pellets dejando una suspensión viscosa viscosa.
        3. Limpiar la sonda de ultrasonidos entre diferentes aislamientos de proteínas, así como para el almacenamiento utilizando etanol al 70% y agua ultrapura tal como se describe en el paso 6.1.2.3.
      5. Centrifugar la suspensión a 20.500 xg a 4 ° C durante 30 min. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo para el aislamiento y desechar el sedimento.
  2. Ni-NTA cromatografía de afinidad
    1. No nativos
      1. Añadir 1 ml de Ni 2 +-NTA solución de resina a cada tubo de centrífuga (2 ml de resina total para una cultura 1,8 L) y se incuba a temperatura ambiente durante al menos 1 hora en nutator.
      2. Vierta suspensión en columna de afinidad y permita que la solución goteará a través de la válvula de llave de paso completamente en vaso de precipitados de residuos.
      3. Realice 10 lavados con 10 ml de lisis / Wash Buffer para cada lavado.
        1. Para los dos primeros lavados, agregue los 10 ml al tubo de centrífuga para eliminar la resina adicional y luego verter en columna. Los lavados adicionales se pueden añadir directamente a la columna.
        2. Después de cada lavado, se agita la resina con una varilla de vidrio. Una vez que el lavado gotea en el vaso de residuos, se pueden añadir los siguientes 10 ml.
      4. Después de lavar completamente drIPS a través, cierre la válvula de llave de paso, apartar el vaso de residuos y reemplazar con 50 ml tubo de centrífuga para la recogida de la proteína.
      5. Añadir 15 ml de tampón de elución (Tabla 1) y se agita-up de la resina, permitiendo que la solución repose durante 5 min. Abrir la válvula de corte y la elución por cobrar. Repita de nuevo con un adicional de 15 ml.
    2. Nativo
      1. Siga el no nativo para cromatografía de afinidad anteriormente (Pasos 6.2.1.1-6.2.1.4) excepto ajustar los siguientes parámetros:
        1. Incubar Ni2 solución de resina +-NTA a 4 ° C durante al menos 1 hora en nutator.
        2. Utilice el tampón de lavado apropiado (Tabla 1).
      2. Añadir 5 ml de tampón de elución (Tabla 1) y se incuba con la resina durante 5 min.
        1. Abrir la válvula de corte y recoger la elución hasta que la mayoría de la solución ha goteado a través.
        2. Añadir 90 l / pocillo de reactivo de Bradford para borrar placa de 96 pocillos. Después de cada elución permite 10 l de modolución a gotear de la columna en el pocillo que contiene 90 l de reactivo Bradford.
        3. Continúe agregando 5 ml tampón de elución a la vez hasta el ensayo de Bradford ya no detecta la proteína (color va de azul oscuro a azul claro para borrar). Esto usualmente toma 4-5 volúmenes de elución.
  3. Diálisis / renaturalización
    1. Hacer no nativo (renaturalización) y tampones de diálisis nativas (Tabla 1) y almacenar en 4 ° C.
      Nota: El pH de los tampones de diálisis se determina por el punto isoeléctrico de la proteína diana (pI). Como regla del pulgar proteínas debe ser amortiguada por lo menos un punto completo por encima o por debajo de sus valores de PI.
    2. Transferencia eluciones nativos y no nativos a un tubo de diálisis con corte de peso molecular apropiado (25.000 MWCO para el NGF y 50.000 MWCO para Sema3A). Colocar cada muestra de proteína en los respectivos tampón de diálisis 1 durante 4 horas a 4 ° C y luego vuelva a colocar con el respectivo tampón 2 sobrela noche a 4 ° C.
      Nota: La proteína tiene que ser dializados en cada búfer durante al menos 4 horas para replegamiento apropiado y el intercambio de tampón a tener lugar.
    3. Se concentran las eluciones proteína dializados a menos de 5 ml utilizando concentradores de spin centrifugadoras.
      Nota: Las proteínas se pueden purificar adicionalmente mediante el uso de cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) y se concentró de nuevo.
  4. Determinar la concentración de proteína (mg / ml) por liofilización de una muestra de 10-50 ml en un tubo de microcentrífuga previamente pesado.
    1. Opcional: determinar el coeficiente de extinción, ε, de manera que la concentración de proteína se puede determinar en aislamientos futuras mediante la medición de la absorbancia de una muestra a 280 nm usando la ley de Beer-Lambert: C = A 280 nm / εl, donde l es la longitud de la trayectoria.

7. La biotinilación de la proteína purificada

  1. Dializar proteínas en 10.000 MWCO casetes de diálisis against Tris 10 mM (pH = 8,0), cambiando el tampón cada 4 h con un total de 6 cambios.
  2. Transferir las proteínas recombinantes (ahora en 10 mM de tampón Tris) a 2 ml tubos de microcentrífuga para biotinilación.
  3. Proteínas biotinilado utilizando un kit de ligasa de proteína biotina.
  4. Dializar proteínas frente a PBS (pH = 7,4) usando casetes de diálisis de MWCO de 10.000 con 3 cambios de tampón de un día durante 2 días.
  5. Determinar el por ciento de biotinilación de proteínas usando un kit de cuantificación.
  6. Determinar la concentración de nuevo como se describe en el punto 6.4 y se almacenan a 4 ° C o alícuota y almacenar a -20 ° C para almacenamiento a largo plazo.

Resultados

Clonación y expresión de prueba

Cuando chapado se realiza correctamente, colonias aisladas individuales deben formar para aumentar las posibilidades de que el desplume bacterias transformadas clonal de células (Figura 2A). Sin embargo, si se colocan demasiadas células, las placas se incubaron demasiado tiempo a 37 ° C o transformación es cuestionable, las colonias pueden cubrir la placa de agar o formar agregados más grandes de las células

Discusión

Ingeniería de proteínas recombinantes es una técnica muy poderosa que abarca muchas disciplinas. Es rentable, sintonizable y un procedimiento relativamente simple, lo que permite la producción de altos rendimientos de proteínas de diseño personalizado. Es importante tener en cuenta que el diseño y la expresión de proteínas diana no siempre es sencillo. La expresión basal y estabilidad de la proteína recombinante dependen de opciones específicas de vector, E. cepas de E. coli de células, ad...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a la Universidad de Akron para el financiamiento que apoya este trabajo.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5%Chem-Impex International127100 g
2-Hydroxyethylmercaptan β-MercaptoethanolChem-Impex International642250 ml
Acetic acid, glacialEMDAX0073-92.5 L
AgarBioshopAGR001.500500 g
Ampicillin sodium salt Sigma-AldrichA951825 g
Antifoam 204Sigma-AldrichA6426500 g
Barstar-NGF pET-21a(+)GenScript USA Inc.4 µg
BL21(DE3) Competent CellsNovagen694501 ml; Expression Host
Bradford reagentSigma-AldrichB6916500 ml
BugBusterNovagen70922-3100 ml
Gel filtration standardBio-Rad151-19016 vials
GlycerolBioshopGLY001.11 L
Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochlorideChem-Impex International1521 kg
His-Pur Ni-NTA ResinThermo Scientific88222100 ml
Hydrochloric acidEMDHX0603-32.5 L
Imidazole Chem-Impex International418250 g
IPTGChem-Impex International194100 g
Laemmli sample bufferBio-Rad161-073730 ml
Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surfaceChem-Impex International270500 g
LB Broth  Sigma-AldrichL30221 kg
NovaBlue Competent CellsNovagen698251 ml; Cloning Host
Phosphate buffered salineSigma-AldrichP5368-10PAK10 pack
Potassium ChlorideChem-Impex International012471 kg
Sema3A-pET-21a(+)GenScript USA Inc.4 µg
SimplyBlue SafeStainInvitrogenLC60601 L
Sodium chlorideSigma-AldrichS5886-1KG1 kg
Sodium hydroxideFisher ScientificS318-500500 g
Sodium phosphate diabasicSigma-AldrichS5136-500G500 g
Sodium phosphate monobasicSigma-AldrichS5011500 g
Terrific BrothBioshopTER409.55 kg
Tetracycline hydrochlorideChem-Impex International66725 g
Tris/Glycine/SDS Buffer, 10xBio-Rad16107321 L
Trizma BaseSigma-AldrichT15031 kg
Tryptone, pancreaticEMD1.07213.10001 kg
Yeast extract, granulatedEMD1.03753.0500500 g
 ÄKTApurifier10GE Healthcare28-4062-64Includes kits and accessories
Benchtop Orbital ShakerThermo ScientificSHKE4000MAXQ 4000
BirA500AvidityBirA500Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution
Dialysis CasetteThermo Scientific66380Slide-A-Lyzer (Extra Strength)
Dialysis TubingSpectrum Laboratories132127, 132129MWCO: 25,000 and 50,000
Flow Diversion Valve FV-923GE Healthcare11-0011-70
FluoReporter Biotin Quantification Assay KitInvitrogen1094598
Frac-950 Tube Racks, Rack CGE Healthcare18-6083-13
Fraction Collector Frac-950GE Healthcare18-6083-00Includes kits and accessories
Heated/Refrigerated Circulator VWR13271-102Model 1156D
Heating Oven FD SeriesBinderModel FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pgGE Healthcare17-1069-01Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI Avanti CentrifugeBeckman Coulter393126
JA 25.50 RotorBeckman Coulter363055
JLA 8.1 RotorBeckman Coulter969329Includes 1 L polyporpylene bottles
JS 5.3 RotorBeckman Coulter368690
Laminar Flow HoodThemo Scientific1849Forma 1800 Series Clean Bench
Microplate ReaderTECANinfinite M200
Mini-PROTEAN Tetra CellBio-Rad165-80044-gel vertical electrophoresis system
Mini-PROTEAN TGX Precast GelsBio-Rad456-9036Any kDa, 15-well comb
Ni-NTA ColumnBio-Rad737-251249 ml volume ECONO-Column
Plasmid Miniprep KitOmega Bio-TekD6943-01
PowerPac HC Power SupplyBio-Rad164-5052250 V, 3 A, 300 W
Round Bottom Polypropylene Copolymer TubesVWR3119-005050 ml tubes for JA 25.50 rotor
Spin-X UF ConcentratorsCorning431488, 431483 20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da
Subcloning ServiceGenScript USA Inc.Protein Services
Ultrasonic Processor Cole-Parmer18910445AModel CV18
Vortex-Genie 2Scientific IndustriesSI-0236Model G560

Referencias

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