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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Entwicklung biotinylatable Fusionsproteine ​​hat viele mögliche Anwendungen in verschiedenen Bereichen der Forschung. Rekombinante Protein-Engineering ist ein geradlinig Verfahren, die kostengünstig ist, das hohe Ausbeuten von kundenspezifischen Proteinen.

Zusammenfassung

Rekombinantes Protein Engineering hat Escherichia coli verwendet (E. coli) Expressionssystemen fast 4 Dekaden, und heute E. coli ist immer noch das am häufigsten verwendete Wirtsorganismus. Die Flexibilität des Systems erlaubt die Zugabe von Einheiten, wie eine Biotin-Tag (für Streptavidin Wechselwirkungen) und größere funktionelle Proteine ​​wie das grün fluoreszierende Protein oder kirschrot Protein. Auch hat die Integration von unnatürlichen Aminosäuren wie Metallionenchelatoren, eindeutig reaktiven funktionellen Gruppen, spektroskopische Sonden und Moleküle verleihen posttranslationale Modifikationen bessere Manipulation von Proteineigenschaften und Funktionen aktivieren. Als Ergebnis dieser Technik schafft anpassbare Fusionsproteine, die erheblichen Nutzen für verschiedene Forschungsfelder zu bieten. Genauer gesagt, hat die biotinylatable Proteinsequenz in viele Zielproteine ​​wegen der hohen Affinität zwischen Biotin Wechselwirkung mit Avidin und Streptavidin übernommen. Dieser Zusatz hat die Verbesserung Detektion und Reinigung des markierten Proteine ​​als auch der Weg für sekundäre Anwendungen wie Zellsortierung unterstützt. So Biotin-markierte Moleküle zeigen einen zunehmenden und großen Einfluss in bioindustriellen und Biomedizin. Für die Zwecke unserer Forschung haben wir rekombinante biotinylierte Fusionsproteine, Nervenwachstumsfaktor (NGF) und semaphorin3A (Sema3A) Funktionsbereiche entwickelt. Wir haben früher, wie diese biotinylierte Fusionsproteine ​​zusammen mit anderen aktiven Proteinsequenzen können Biomaterialien für das Tissue Engineering und regenerative Zwecke gebunden werden berichtet. Dieses Protokoll beschreibt die Grundlagen der Ingenieur biotinylatable Proteine ​​an der Milligramm-Maßstab unter Verwendung einer T7-lac-induzierbaren Vektor-und E. coli-Expressionswirte, ab Transformation zum Scale-up und Reinigung.

Einleitung

Proteine ​​umfassen eine breite Palette von Biomolekülen, die für viele biologische Funktionen verantwortlich sind, letztlich um die richtige Gewebebildung und Organisation führt. Diese Moleküle zu initiieren Tausende von Signalwegen, die Hochregulierung und / oder Herunterregulierung von Genen und anderen Proteinen zu steuern, die Aufrechterhaltung Gleichgewicht innerhalb des menschlichen Körpers. Störung eines einzelnen Proteins beeinflusst diese gesamte Bahn von Signalen, die zu Beginn der verheerenden Störungen oder Krankheiten führen kann. Engineering einzelnen Proteine ​​im Labor bietet eine Lösung zur Bekämpfung dieser Nebenwirkungen und bietet eine Alternative zu niedermolekularen Wirkstoffen. 1977, ein Gen, das 14 Aminosäuren Somatostatin-Sequenz, einer der ersten Werk Polypeptide unter Verwendung von E. geschaffen coli ein. Bald nach 1979 wurde Insulin in pBR322 kloniert, transformiert, ausgedrückt und gereinigt 2. Seitdem haben rekombinanten Proteinen, ihren Einfluss, um mehrere Felder der Rechts erweitertSuche wie Biomaterialien, Wirkstofftransport, Gewebetechnik, Bio-Pharmazie, Landwirtschaft, industrielle Enzyme, Biokraftstoffe, etc. (siehe Referenzen für Bewertungen 3-8). Dies ist weitgehend auf die Vielseitigkeit, die das Verfahren bietet über die Zugabe von anwendungsspezifischen chemischen Einheiten oder Proteinsequenzen zu Zwecken einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Zielproteinidentifizierung, Stabilisierung und Reinigung begrenzt.

Über rekombinante DNA-Technologie können rekombinante Proteine ​​in einer Vielzahl von eukaryotischen und prokaryotischen Wirtssystemen, einschließlich Säuger-, Pflanzen-, Insekten-, Hefe-, Pilz oder Bakterien exprimiert werden. Jeder Host bietet verschiedene Vorteile und in der Regel das beste System wird auf der Grundlage der Proteinfunktion, Ertrag, Stabilität, Gesamtkosten und Skalierbarkeit bestimmt. Bakterien-Zellen fehlen oft die post-translationale Modifikation Mechanismen, die eukaryotischen Wirten (dh Glykosylierung, Disulfidbrücken, E tc.) 5. Als Ergebnis Säuger-und Insekten-Systemen in der Regel eine bessere Kompatibilität und die Expression von eukaryontischen Proteinen führen, aber diese Rechner sind in der Regel teuer und zeitaufwendig 9. Daher E. coli ist der bevorzugte Wirt für unsere Expressionssystem, da die Zellen rasch expandieren in preiswerten Wachstumsbedingungen und die genetische Expression Mechanismen sind gut verstanden 5,9. Zusätzlich ist dieses System leicht trotz des Fehlens von posttranslationalen Modifikationen 10 Scale-up für Produktionszwecke und die Ergebnisse in funktionelle Proteine. Die E. coli K12 Stamm wird in diesem Protokoll für das Klonen gewählt, weil dieser Stamm bietet ausgezeichnete Plasmid-Ausbeuten bezogen auf hohe Transformationseffizienz. Darüber hinaus wird ein E. coli-Stamm BL21 zur Expression verwendet werden, da diese Wirtsstamm enthält die T7-RNA-Polymerase-Gen, gesteuert Protein Expression und Stabilität 11 liefert.

Zelt "> Nach Hostauswahl müssen weitere Pflege in der Wahl des geeigneten Expressionsvektor ausgewählt und gesteuert Proteinexpression zu erleichtern aufgenommen werden. Synthese von rekombinanten Proteinen beginnt mit einem Ziel-DNA-Sequenz, die unter der Leitung des Bakteriophagen T7 Transkriptions-und Translationssignale kloniert wird, und Expression in Wirtszellen, die chromosomale Kopie des T7-RNA-Polymerase-Gen 12 enthält, induziert. Diese Vektoren, aus dem Plasmid pBR322 (für einen Überblick siehe Referenz 13), fest mit dem T7-Promotor zunächst von Studier und Mitarbeiter entwickelten 14 gesteuert und zusätzliche Steuerung durch die Einbeziehung der lac-Operator-lac-Repressor (LAC1) 15,16. Für die rekombinante Proteintechnik bietet das Expressionssystem die Fähigkeit, eine spezifische Aminosäuresequenz eines gewünschten Proteins durch Einsetzen verschiedener DNA-Zielsequenzen anzupassen oder um Fusionsproteine ​​zu erzeugen bis kombinierter Domain gemachts von einzelnen Proteinen. Darüber hinaus können einige Vektorreihe umfassen Peptid-Tag Modifikationen am N-oder C-Terminus angeordnet werden. Unser Gestaltungszwecken wurde ein Histidin (His)-Tag an die DNA-Zielsequenz zur Reinigung aufgenommen und 15 Aminosäure biotinylatable Sequenz wurde für die Biotinylierung 17,18 enthalten. In diesem Protokoll ein Plasmid ein Ampicillin-Resistenz-Gen enthält, wurde ausgewählt, um unsere biotinylatable Fusionsprotein-Sequenzen tragen. Die Expression wird in diesem Vektor durch T7-lac-Promotor kontrolliert und ist leicht mit Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert.

Test Ausdrücke (kleine Kulturen) werden verwendet, um das Vorhandensein und die Löslichkeit des Zielproteins, das entweder in einer löslichen oder unlöslichen Form zu formulieren Reinigungsverfahren ausgedrückt werden kann zu bestimmen. Ein lösliches Protein innerhalb der Bakterienzelle exprimiert wird spontane Faltung unterziehen, um seine native Struktur 19 zu halten. Typischerweise ist die MutterStruktur ist thermodynamisch günstig. In vielen Fällen ist die Stoffwechselaktivität der Rechner ist nicht förderlich für das Zielprotein, indem Druck auf das System, um die unlöslichen Proteinproduktion und die Bildung von Einschlusskörpern von unlöslichen Proteinaggregaten zusammen führt. Damit das Zielprotein denaturiert, wodurch sie im allgemeinen biologisch inaktiven 20. Beide Test Ausdrücke vergrösserte und Isolationsverfahren sind durch die Löslichkeit des Zielproteins bestimmt wird. Eine weitere Renaturierung oder Rückfaltungsschritt für unlösliche Proteine ​​erforderlich. Die resultierenden rekombinanten Proteine ​​können weiter unter Verwendung von Grßenausschluß-Chromatographie gereinigt werden.

Im Haus bietet rekombinanten Proteinproduktion Kostenvorteile gegenüber kommerziellen Produkten seit Milligramm Zielprotein pro Liter Hauptkultur isoliert werden. Die meisten der benötigten Ausrüstung ist in einer typischen biologischen oder chemischen Labor erhältlich. Protein-Engineering ermöglicht die Erzeugungvon kundenspezifischen Fusionsproteine ​​mit zusätzlichen Funktionen, die nicht im Handel erhältlich sind immer. Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Verfahren in der Technik rekombinanten Proteinen beteiligt. Mit diesem Expressionssystem haben wir viele biotinylatable Proteine, wie Interferon-gamma, Plättchenwachstumsfaktor, Knochen-morphogenetisches Protein 21-23 angelegt, aber wir werden auf zwei Proteine, die wir für Axon Führung, NGF (29 kDa ausgebildet konzentrieren ) und Sema3A (91 kDa) 10 (für eine Übersicht siehe Referenz 24). Biotinylierung ist eine übliche Technik zur Identifizierung, Isolierung und Immobilisierung der markierten Proteine ​​unter Verwendung der bekannten Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung 25-27. Biophysikalischen Sonden 28,29, Biosensoren 30 und Quantenpunkte 31 sind Beispiele von Systemen, die hohe Affinität von Biotin-Streptavidin Konjugation mit einem K d in der Größenordnung von 10 -15 M 27 nutzen. Die E. coli bioZinn-Ligase BirA, unterstützt die kovalente Bindung von Biotin an die Lysin-Seitenkette in der Biotin-markierten Sequenz gefunden 18,32. Tethering Biotin an Werkstoffen und Biomolekülen hat anhaltende Abgabe von Wachstumsfaktoren produziert, um für mehrere Tissue Engineering Anwendungen 21,33-35 Zelle. Daher Engineering diese maßgeschneiderten biotinylatable Proteinen ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das mehrere Forschungsinteressen überwinden kann.

Protokoll

1. Die Projektierung des Zielproteins

  1. Mit dem National Center for Biotechnology Information Website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) erhalten eine Aminosäure-Sequenz für das Zielprotein unter Berücksichtigung der Art der Zinsen und Splice-Varianten. Wählen Sie die Aminosäuresequenz, die zu der aktiven Region von Interesse des Proteins entspricht.
    Hinweis: Sema3A wurden Aminosäuren 21-747 entschieden. Fusionsprotein wurde mit NGF, wo die Sequenz von Barstar, Aminosäure 1-90 wurde auf NGF Aminosäuren 122-241 hinzugefügt gestalten.
  2. Um die N-Terminus fügen Sie die folgenden Sequenzen: 6x-His-Tag für die Reinigung (HHHHHH), Tabak Etch Virus (TEV) Protease geschnitten Website zur Entfernung von His-Tag (ENLYFQG), Biotin-Tag-Sequenz für die Biotinylierung von Protein bei K (GLNDIFEAQKIEWHE) und flexiblen Gelenk mit Lücken, die Raum für die richtige Proteinrückfaltung (EFPKPSTPPGSSGGAP) ermöglichen.
    Anmerkung: Diese Sequenzen können je nach der gewünschten Fusions prot variierenEin.
  3. Senden vollständige Aminosäuresequenz an ein Unternehmen für die Gen-Design / Optimierung für gewünschte Wirtsarten und Synthese. Subklonieren in einen Vektor der Wahl mit der BamHI-NotI-Stelle mit einem Kit oder durch Verwendung von kommerziellen Dienstleistungen.

2. Machen Agar-Platten

Hinweis: Es ist sehr wichtig, dass alle Aktien von Antibiotika, Platten, Puffer, etc. ordnungsgemäß gelagert (Temperatur und Dauer) und bleiben frei von Proteasen (sterilisiert).

  1. Abwiegen Agar bei 1,5 Gew.% und Lysogenie Brühe (LB) bei 20 g / L und in eine Glasflasche Medien. Ein 500-ml-Flasche macht etwa 15 Platten.
  2. Volumetrisch hinzufügen Reinstwasser, gut mischen und Autoklaven.
  3. Lassen Flasche kühl an und fügen Sie die entsprechenden Antibiotika. Vermeiden vorzeitigen Erstarrung der Agar, aber wenn Flasche kühlt zu viel und Lösung beginnt zu erstarren, Aufwärmen in der Mikrowelle.
    Hinweis: Unsere Plasmid ein Ampicillin-Resistenz-GenE. Daher müssen alle Schritte Ampicillin bei 100 ug / ml enthalten. Die E. coli K12-Stamm erfordert Klonierung Tetracyclin (12,5 ug / ml) Antibiotikum. BL21-Bakterien-Zellen benötigen keine zusätzliche Antibiotikum.
  4. Gießen 25-30 ml Lösung in 90 mm Petrischalen und genügend Zeit, um zu trocknen.
  5. Label-Gericht mit geeigneten Antibiotika und speichern upside-down in 4 ° C, mit Parafilm oder in einem wiederverschließbaren Beutel.
    Hinweis: Die Platten sind gut für etwa einen Monat.

3. Klonierung des Biotin Tagged Plasmid

Hinweis: Die Bedingungen sind aseptisch gemacht.

  1. Spin down Plasmid-Vektor bei 6.000 xg für 3 min, um zu pelletieren, und fügen Sie 10 ul sterilisiert Reinstwasser.
  2. Entfernen Sie 50 ul chemisch kompetente E. coli-Zellen hohe Transformationseffizienz von -80 ° C und sofort auf Eis für 5-10 min.
  3. 1 ul der Vektor-Lösung bei 0,5-1 ng/5056, L-Zellen an die 50 &mgr; l E. coli-Zellen, und legen Sie die restlichen Plasmid in -80 ° C
  4. Platzieren der Bakterien-Zellen, die den Vektor auf Eis für 5 min.
  5. Hitzeschock die Zelle und Vektor Mischung für 30-45 sec in 42 ° C Wasserbad und Ortszellen wieder auf Eis für 2 min.
  6. Add 250 ul Superbrühe mit optimalen Repression (SOC)-Medium (2% w / v-Bacto-Trypton, 0,5% w / v Bacto-Hefeextrakt, 8,56 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM MgSO 4, 20 mM Glucose , hochreinem Wasser, pH = 7,0) hinzugefügt und bei 250 Upm bei 37 ° C für 30 min.
    Hinweis: SOC nicht autoklavierbar, sondern Filter durch ein 0,22 um-Filter sterilisiert werden.
  7. Trockenplatten 10-15 min vor dem Beschichten Zellen.
  8. Pipette 25, 50 und 100 &mgr; l der Zelllösung auf separate Agarplatten, die Ampicillin (100 &mgr; g / ml) und Tetracyclin (12,5 ug / ml) Antibiotika. Verwenden Sie Glasperlen Lösung gleichmäßig auf Agar-Platten zu verteilen.
  9. Platten bei 37 ° C inkubieren upside-down für 15-18 Std.
  10. Check für kleine Einzelbakterienkolonien auf den Platten bei 4 ° C lagern Oberseite nach unten bis zur weiteren Verwendung (Fig. 2A).
    1. Wenn keine Kolonien vorhanden sind:
      1. Überprüfen Sie die Frische und Sterilität von Puffern und Zubehör.
      2. Erhöhen Sie die Menge von Plasmid E. hinzugefügt coli K12-Stamm.
    2. Wenn große Kolonien vorhanden sind oder ein übermäßiges Wachstum der Kolonien (Abbildung 2B und 2C), restreak ein neues Agar-Platte mit einer sterilen Impföse oder Platten Zellen bei niedriger Lautstärke.
  11. Beimpfen von 5 ml LB, enthaltend Ampicillin (100 &mgr; g / ml) und Tetracyclin (12,5 ug / ml) Antibiotika mit einer einzelnen Kolonie transformierter E. coli-Zellen. Aufwachsen Zellen über Nacht bei 37 ° C bei 250-300 UpM.
  12. Der folgende Tag, verwenden Sie ein Plasmid Isolation Kit, um die Zielvektor aus der Nacht gro isolierenw-und Speicher gereinigt Plasmid bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.
    1. Optional: Überprüfen Sie die Reinheit und Konzentration der Plasmid mit Absorptionswert bei 260 und 280 nm erhalten.

4. Transformation von Plasmid in Expression-Host

Hinweis: Die Bedingungen sind aseptisch gemacht.

  1. Wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,10 für E. coli BL21-Zellen mit den folgenden Änderungen:
    Hinweis: BL21 Zellen benötigen keine zusätzliche Antibiotika Ampicillin daher nur auf den Agarplatten zur Transformation aufgenommen.
    1. In 2-5 ul isolierte Plasmid bei 0,5-2 ng/50 ul Zellen aus Schritt 3,12-50 ul E. coli-Expressionswirtszellen.
    2. Hitzeschock-Zellen, die für 60 bis 90 Sekunden.
    3. Schütteln Lösung mit SOC-Medium bei 250 rpm für 60 min statt 30 min.
  2. Zupfen Sie eine Einzelkolonie von transformierten Bakterienzellen aus der Petrischale mit einem sterile Applikatorstäbchen und in ein Reagenzglas mit 5 ml LB-Medium mit der entsprechenden Konzentration an Ampicillin (100 ug / ml).
  3. Platzieren Reagenzgläser in Schüttler über Nacht bei 37 ° C bei 250 UpM.
  4. Am folgenden Morgen, nehmen Sie 200 ul der Nacht wachsen-up und auf 5 ml LB mit Ampicillin bei 100 ug / ml hinzuzufügen.
  5. Frieren Sie unten die restlichen Zellen mit 250 ul 50% Glycerin (steril) auf 750 ul Kultur und halten in -80 ° C
    Hinweis: Neue Testausdruck und Scale-up-Verfahren kann mit einem sterilen Applikator-Stick, ein Kratzen der gefrorenen Zellen zu erhalten und Impfen LB mit den entsprechenden Antibiotika durchgeführt werden.
  6. Platzieren Reagenzglas in Schüttler bei 250-300 Upm bei 37 ° C, bis die optische Dichte (OD) zwischen 0,7-0,8 bei einer Absorption von 600 nm gemessen.
  7. Induzieren Zellen mit IPTG in einer Endkonzentration von 1 mM.
  8. Schütteln für weitere 4 h bei 37 ° C bei 300 UpM. Alternativ können auch Zellenüber Nacht bei 18 ° C bei 250-300 rpm geschüttelt werden. Dies kann eine höhere Ausbeute an Plasmid zu erzeugen in Abhängigkeit von dem Zielprotein.
  9. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)-Analyse der Testausdruck
    1. Nehmen Sie 500 ul der Kultur und der Platz in einem 1,5-ml-Tube. Spin down bei 13-15 g für 5 min. Überstand abgießen Flüssigkeit und beschriften "löslich". Pellet unter Vortexen in 200 &mgr; l Beladungsfarbstoff (50 ul 2-Mercaptoethanol, 950 &mgr; l Laemmli-Probenpuffer).
      Hinweis: Löslich Bakterienpellets wird verwendet, um zu bestimmen, ob das rekombinante Protein in den cytoplasmatischen Regionen der Bakterienzellen. Pellets können in -80 ° C ohne Belastung Farbstoff, bis sie benötigt gespeichert werden. Ein Steuerbakterienkultur, die nicht transformiert oder induziert worden ist, kann als lösliche als auch zum Vergleich behandelt werden.
    2. Nehmen Sie 1000 ul der Kultur und in einem 1,5-ml-Tube. Spin down bei 13-15 g für 5 min.Überstand abgießen Flüssigkeit und beschriften "unlöslich".
      Hinweis: unlöslich Pellets Denaturierung Verfahren unten, um Proteine ​​in Einschlusskörpern von Bakterien Zellen gefunden loslassen zu unterziehen. Pellets können in -80 ° C bis zum Gebrauch gelagert werden. Ein Steuerbakterienkultur, die nicht transformiert oder induziert worden ist, kann als unlösliche als auch zum Vergleich behandelt werden.
      1. Resuspendieren Sie das unlösliche Pellet in 200 ul BugBuster und bei Raumtemperatur für 30 min.
      2. Spin down Probe erneut bei 13-15 g für 5 min und nehmen 50 ul Überstand und es um neue "unlöslich" 1,5-ml-Röhrchen hinzufügen.
      3. Dann fügen Sie 50 ul Ladefarbstoff auf diese neue Probe.
    3. Sieden löslichen und unlöslichen Proben für 5 min, um Proteine ​​für die SDS-PAGE-Analyse zu denaturieren.
    4. Legen Sie jede Probe in Elektrophorese-Gel mit Standard-Leiter.
    5. Um zu visualisieren, die Proteinproben mit einem staining Reagenz und folgen Sie der Firma Protokoll.
    6. Bestimmen, ob das Protein exprimiert, in den löslichen und / oder unlöslichen Fraktionen durch Vergleich dieser zwei Bahnen sowie den Vergleich der Spuren mit den löslichen und unlöslichen Kontrollspuren (siehe Anmerkung 4.9.1 und 4.9.2) auf den SDS-PAGE-Gel (Abb. 2). Ein dunkles Band sollte um das Molekulargewicht des Proteins in der löslichen oder unlöslichen Fahrspuren angezeigt. Damit wird festgelegt, welche Isolierungsverfahren in Protokoll Nr. 6 zu verwenden.
      Anmerkung: Wenn ein Band in diesen beiden Regionen entweder als Isolation in 6 verwendeten Protokoll unten durchgeführt werden, oder das Protein kann in beide Richtungen getrennt werden, um zu bestimmen, welche Isolierungsverfahren erzeugt eine höhere Ausbeute an rekombinantem Protein (Fig. 3) .
    7. Wenn ein 4 h und Induktion über Nacht durchgeführt wurde, festzustellen, welche Induktionsmethode die höchste Proteinproduktion für das Scale-up-Prozess (Abbildung 2).

5. Scale-up Verfahren und Hauptkultur

  1. Bereiten Wachstumsmedien mit 85,7 g Terrific Broth und 28,8 ml 50% Glycerin in 1,8 l Reinstwasser und Autoklaven auf Flüssigkeitskreislauf für 1 Stunde.
  2. Starten Sie eine Übernachtkultur von gefrorenen Zell Lager in Schritt 4.5 erstellt.
    Hinweis: Die Bedingungen sind aseptisch gemacht.
    1. Mischungs 20 ml LB mit einer Endkonzentration von Ampicillin bei 100 ug / ml in einer sterilen 125 ml Erlenmeyerkolben.
    2. Mit einem sterilen Applikator-Stick einen Verschrottung von transformierten E. coli-Zellen und Drop-Applikator in den Kolben. Entfernen Applikator-Stick und Stecker Kolben mit Schaumstoffstopper oder Baumwolle und mit Alufolie abdecken, um die Sterilität zu erhalten.
    3. Schütteln über Nacht bei 250 UpM bei 37 ° C.
  3. Hauptkultur
    Hinweis: Die Bedingungen sind aseptisch gemacht.
    1. Gießen-Nacht-Kultur in 1,8 L von sterilen Nährmedien und fügen Ampicillin bei 100 &mgr; g / ml und 6 bis 8 Tropfen sterilen Antischaum 204 unter Verwendung einer Pasteurpipette.
    2. Platz Kulturen in einem 37 ° C Wasserbad mit 0,2 mm durch Belüftung Steine ​​gefilterte Druckluft Blasenbildung in Kulturen.
    3. Sobald der OD 600 nm von 0,7-0,8 erreicht, induziert mit IPTG (1 mM) und damit zur Induktion entweder 4 h bei 37 ° C oder über Nacht in Abhängigkeit von löslichen / unlöslichen Ergebnisse von SDS-PAGE in Schritt 4.9 auftreten, auf 18 ° C.
  4. Sammeln E. coli-Zellen
    1. Spin-Down der Zellkultur in 1 l-Zentrifugenflaschen (2 Flaschen / Kultur) für 15 min bei 14.000 × g bei 4 ° C.
    2. Überstand abgießen und mit einem dünnen Spachtel, schöpfen die Bakterien zu pelletieren in zwei 50-ml-Röhrchen. Die Zellen werden erneut durch Zentrifugation für einige Minuten pelletiert werden.
      Hinweis: Jeder 1,8-l-Kultur in zwei Bakterienpellets, eine in jeder 50-ml-Zentrifugenrohr führen.
    3. Shop-Pellets in -80 C bis Proteinisolierung.

6. Isolierung und Reinigung von rekombinantem Protein

Hinweis: Wenn das Protein in der löslichen Region auf Basis von SDS-PAGE-Analyse von Schritt 4,9, dann wird "native Isolation" verwendet werden, aber für die unlöslichen Proteinen "Nonnative Isolation"-Verfahren durchgeführt.

  1. Zelllyse
    1. Nonnative
      1. Transformierten E. entfernen coli Pellet von -80 ° C Gefrierschrank und 20 ml Lyse / Waschpuffer (Tabelle 1) zu jedem Zentrifugenröhrchen.
      2. Vortex und schütteln Sie die gefrorenen Pellets, bis es taut und löst in der Pufferlösung ohne großen Brocken. Inkubation über Nacht auf Nutator. Am folgenden Morgen sollte das Pellet jetzt eine viskose Aufschlämmung aufgrund der Denaturierung des Proteins aus dem Puffer sein.
      3. Zentrifugieren der Aufschlämmung bei 20.500 × g bei Raumtemperatur für 30 min. Den Überstand in ein frisches Röhrchen für die Isolierung und entsorgen Sie die Pellets.
    2. Native
      1. Erhalten transformierten E. coli Pellet von -80 ° C Gefrierschrank.
      2. Hinzufügen Lysis Buffer (Tabelle 1) Zentrifugenröhrchen auf ein Endvolumen von 30 ml zu erreichen und zu entfernen gefrorene Pellet durch Verwirbeln und rigoros Schütteln. Zeigen Pellet auf Eis.
      3. Waschen Sonicator Sonde mit 70% Ethanol bei 100% Amplitude für 1-2 min. Wiederholen Sie dann mit hochreinem Wasser.
      4. Ultraschallbad Bakterien zu pelletieren, während auf Eis für 5 min (Gesamtzeit von 10 min).
        1. Stellen Ultraschallgerät bei 30% Amplitude mit Puls von 30 Sekunden an/30 s aus.
        2. Bob Zentrifugenröhrchen nach oben und unten während der Beschallung Intervall, um vollständig brechen die Zellpellet. Am Ende der Gesamtzeit sollte es keine sichtbaren Bakterien zu pelletieren Verlassen einer sehnig, zähflüssige Brei.
        3. Reinigen Sie das Ultraschallgerät Sonde zwischen verschiedenen Proteinisolierungen sowie für die Lagerung mit 70% Ethanol und Reinstwasser, wie in Schritt 6.1.2.3 beschrieben.
      5. Zentrifugieren der Aufschlämmung bei 20.500 × g bei 4 ° C für 30 min. Den Überstand in ein frisches Röhrchen für die Isolierung und entsorgen Sie die Pellets.
  2. Ni-NTA-Affinitäts-Chromatographie
    1. Nonnative
      1. 1-ml-Ni 2 +-NTA-Harz-Lösung zu jedem Zentrifugenröhrchen (2 ml Harz für insgesamt 1,8 l-Kultur) und Inkubieren bei Raumtemperatur für mindestens 1 h auf Nutator.
      2. Gießen Schlamm in Affinitätssäule und lassen Lösung durch Hahn Ventil vollständig in die Abfallbecherglas tropfen.
      3. Zuführen 10 Wäschen mit 10 ml Lyse / Waschpuffer für jeden Waschgang.
        1. Für die ersten zwei Wäschen, fügen Sie die 10 ml-Zentrifugenröhrchen auf die zusätzliche Harz zu entfernen und gießen Sie dann in die Spalte. Die zusätzlichen Waschungen können direkt Spalte hinzugefügt werden.
        2. Nach jedem Wasch, rühren Sie den Harz mit einem Glasstab. Sobald der Wasch tropft in den Abfall Becher können die nächsten 10 ml zugegeben werden.
      4. Nach dem vollständigen dr waschendurch ips, in der Nähe Absperrventil, entfernen und ersetzen Abfallbecherglas mit 50 ml-Zentrifugenröhrchen für die Protein-Sammlung.
      5. 15 ml Elutionspuffer (Tabelle 1) und rühren-up Harz, so dass Lösung für 5 min zu sitzen. Absperrhahn öffnen Ventil und sammeln Elution. Wiederholen Sie den Vorgang mit weiteren 15 ml.
    2. Ureinwohner
      1. Folgen Sie der Nonnative Affinity Chromatography oben (Schritte 6.2.1.1-6.2.1.4) mit Ausnahme stellen Sie die folgenden Parameter:
        1. Inkubieren Ni 2 +-NTA-Harz-Lösung bei 4 ° C für mindestens 1 h auf Nutator.
        2. Verwenden Sie die geeignete Waschpuffer (Tabelle 1).
      2. 5 ml Elutionspuffer (Tabelle 1) und Inkubation mit Harz 5 min.
        1. Offene Absperrventil und sammeln Elution, bis die meisten der Lösung durchtropft.
        2. In 90 ul / Bradford Reagenz auf 96-Well-Platte zu löschen. Nach jeder Elution ermöglichen 10 ul soLösung, um aus der Spalte in den wohl mit 90 ul Bradford-Reagenz tropfen.
        3. Weiter Zugabe von 5 ml Elution Buffer an, bis Bradford-Test erkennt nicht mehr Protein (Farbe reicht von dunkelblau bis hellblau zu löschen). Dies dauert in der Regel 4-5 Elutionsvolumina.
  3. Dialyse / Renaturierung
    1. Machen nonnative (Renaturierung) und native Dialyse-Puffer (Tabelle 1) und Speicher in 4 ° C
      Anmerkung: Der pH-Wert der Dialyse-Puffer werden durch isoelektrische Punkt des Zielproteins (pI) bestimmt. Als eine Faustregel, Proteine ​​sollten mindestens einen vollen Punkt über oder unter ihrem pI-Werte gepuffert werden.
    2. Übertragen nativen und nicht-nativen Elutionen einen Dialyseschlauch mit entsprechenden Molekulargewichtsgrenze (25.000 MWCO für NGF und 50.000 MWCO für Sema3A). Je eine Proteinprobe in jeweiligen Dialysepuffer 1 für 4 h bei 4 ° C und dann mit dem entsprechenden Puffer 2 über ersetzenNacht bei 4 ° C
      Hinweis: Protein muss in jedem Puffer für mindestens 4 Stunden für die ordnungsgemäße Rückfaltung und Pufferaustausch stattfinden dialysiert werden.
    3. Konzentrieren Sie die dialysiert Protein Elutionen auf weniger als 5 ml Zentrifugen mit Spin-Konzentratoren.
      Hinweis: Die Proteine ​​können durch Verwendung schneller Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC) gereinigt und erneut eingeengt werden.
  4. Bestimmen Proteinkonzentration (mg / ml) durch Gefriertrocknen einer 10-50 ml Probe in einem vorgewogenen Zentrifugenröhrchen.
    1. Optional: Bestimmung des Extinktionskoeffizienten ε, so daß die Konzentration des Proteins in Zukunft Isolierungen durch Messung der Absorption einer Probe bei 280 nm unter Verwendung des Lambert-Beer-Gesetzes bestimmt werden: C = A 280nm / ε L, wobei L die Weglänge ist.

7. Biotinylierung von gereinigtem Protein

  1. Dialysiere Proteine ​​in 10.000 MWCO Dialysekassetten against 10 mM Tris (pH = 8,0), die Änderung der Puffer alle 4 Stunden mit insgesamt sechs Veränderungen.
  2. Transfer der rekombinanten Proteine ​​(jetzt in 10 mM Tris-Puffer), um 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen für die Biotinylierung.
  3. Biotinylieren Proteine ​​unter Verwendung einer Biotin-Protein-Ligase-Kit.
  4. Proteine ​​dialysiert gegen PBS (pH = 7,4) mit 10.000 MWCO Dialysekassetten mit 3 Puffer ändert einen Tag für 2 Tage.
  5. Bestimmen Sie die Prozent Biotinylierung von Proteinen mit Hilfe eines quantitativen Kit.
  6. Bestimmen Sie die Konzentration wieder wie in 6.4 und bei 4 ° C oder aliquotieren und bei -20 ° C zur Langzeitlagerung beschrieben.

Ergebnisse

Klonierung und Expression-Test

Wenn Beschichtung richtig durchgeführt wird, sollten einzelne isolierte Kolonien zu bilden, um die Chancen Zupfen klonalen transformierten Bakterien-Zellen (2A) zu erhöhen. Wenn jedoch zu viele Zellen plattiert, Platten zu lange bei 37 ° C inkubiert oder Transformation ist fraglich, Kolonien können die Agar-Platte abdecken oder bilden größere Aggregate von Zellen (Fig. 2B und 2C). W...

Diskussion

Rekombinante Proteintechnik ist eine sehr mächtige Technik, die viele Disziplinen überspannt. Es ist kostengünstig, abstimmbaren und ein relativ einfaches Verfahren, das die Herstellung von hohen Ausbeuten von kundenspezifischen Proteinen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Gestaltung und die Zielproteine ​​exprimieren, ist nicht immer einfach. Basale Expression und rekombinante Proteinstabilität ist von den spezifischen Möglichkeiten der Vektor, E. coli-Zellstämme, Peptid-Tag Ergänzungen und Kulti...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Die Autoren danken der University of Akron für die Finanzierung, die diese Arbeit unterstützt bestätigen.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5%Chem-Impex International127100 g
2-Hydroxyethylmercaptan β-MercaptoethanolChem-Impex International642250 ml
Acetic acid, glacialEMDAX0073-92.5 L
AgarBioshopAGR001.500500 g
Ampicillin sodium salt Sigma-AldrichA951825 g
Antifoam 204Sigma-AldrichA6426500 g
Barstar-NGF pET-21a(+)GenScript USA Inc.4 µg
BL21(DE3) Competent CellsNovagen694501 ml; Expression Host
Bradford reagentSigma-AldrichB6916500 ml
BugBusterNovagen70922-3100 ml
Gel filtration standardBio-Rad151-19016 vials
GlycerolBioshopGLY001.11 L
Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochlorideChem-Impex International1521 kg
His-Pur Ni-NTA ResinThermo Scientific88222100 ml
Hydrochloric acidEMDHX0603-32.5 L
Imidazole Chem-Impex International418250 g
IPTGChem-Impex International194100 g
Laemmli sample bufferBio-Rad161-073730 ml
Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surfaceChem-Impex International270500 g
LB Broth  Sigma-AldrichL30221 kg
NovaBlue Competent CellsNovagen698251 ml; Cloning Host
Phosphate buffered salineSigma-AldrichP5368-10PAK10 pack
Potassium ChlorideChem-Impex International012471 kg
Sema3A-pET-21a(+)GenScript USA Inc.4 µg
SimplyBlue SafeStainInvitrogenLC60601 L
Sodium chlorideSigma-AldrichS5886-1KG1 kg
Sodium hydroxideFisher ScientificS318-500500 g
Sodium phosphate diabasicSigma-AldrichS5136-500G500 g
Sodium phosphate monobasicSigma-AldrichS5011500 g
Terrific BrothBioshopTER409.55 kg
Tetracycline hydrochlorideChem-Impex International66725 g
Tris/Glycine/SDS Buffer, 10xBio-Rad16107321 L
Trizma BaseSigma-AldrichT15031 kg
Tryptone, pancreaticEMD1.07213.10001 kg
Yeast extract, granulatedEMD1.03753.0500500 g
 ÄKTApurifier10GE Healthcare28-4062-64Includes kits and accessories
Benchtop Orbital ShakerThermo ScientificSHKE4000MAXQ 4000
BirA500AvidityBirA500Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution
Dialysis CasetteThermo Scientific66380Slide-A-Lyzer (Extra Strength)
Dialysis TubingSpectrum Laboratories132127, 132129MWCO: 25,000 and 50,000
Flow Diversion Valve FV-923GE Healthcare11-0011-70
FluoReporter Biotin Quantification Assay KitInvitrogen1094598
Frac-950 Tube Racks, Rack CGE Healthcare18-6083-13
Fraction Collector Frac-950GE Healthcare18-6083-00Includes kits and accessories
Heated/Refrigerated Circulator VWR13271-102Model 1156D
Heating Oven FD SeriesBinderModel FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pgGE Healthcare17-1069-01Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI Avanti CentrifugeBeckman Coulter393126
JA 25.50 RotorBeckman Coulter363055
JLA 8.1 RotorBeckman Coulter969329Includes 1 L polyporpylene bottles
JS 5.3 RotorBeckman Coulter368690
Laminar Flow HoodThemo Scientific1849Forma 1800 Series Clean Bench
Microplate ReaderTECANinfinite M200
Mini-PROTEAN Tetra CellBio-Rad165-80044-gel vertical electrophoresis system
Mini-PROTEAN TGX Precast GelsBio-Rad456-9036Any kDa, 15-well comb
Ni-NTA ColumnBio-Rad737-251249 ml volume ECONO-Column
Plasmid Miniprep KitOmega Bio-TekD6943-01
PowerPac HC Power SupplyBio-Rad164-5052250 V, 3 A, 300 W
Round Bottom Polypropylene Copolymer TubesVWR3119-005050 ml tubes for JA 25.50 rotor
Spin-X UF ConcentratorsCorning431488, 431483 20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da
Subcloning ServiceGenScript USA Inc.Protein Services
Ultrasonic Processor Cole-Parmer18910445AModel CV18
Vortex-Genie 2Scientific IndustriesSI-0236Model G560

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