JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Разработка biotinylatable слитые белки имеет много потенциальных применений в различных областях исследований. Рекомбинантный инженерно белок является прямым процедура, которая является экономически эффективным, обеспечивая высокие урожаи специально разработанных белков.

Аннотация

Рекомбинантный инженерно белок используется кишечной палочки (E.coli) системы экспрессии на протяжении почти 4 десятилетия, а сегодня Е. палочка по-прежнему наиболее широко используется организмом-хозяином. Гибкость системы позволяет добавлением фрагментов, таких как биотин тега (для стрептавидином взаимодействий) и больших функциональных белков, как зеленый флуоресцентного белка или вишнево-красного белка. Кроме того, интеграция неестественных аминокислот, таких как ионов металлов хелаторов, однозначно активных функциональных групп, спектроскопических зондов, и молекул, придающих пост-трансляционные модификации позволило лучше манипулирование свойствами белковых и функциональных возможностей. В результате этот метод создает настраиваемые слитые белки, которые предлагают значительные утилиту для различных областях исследований. Более конкретно, biotinylatable последовательность белка были включены в многих белков-мишеней вследствие высокой аффинности взаимодействия между биотина с авидином и стрептавидином. Это дополнение помог в повышении обнаружения и очистки меченых белков, а также открывая путь для вторичных приложений, таких как сортировки клеток. Таким образом, биотин-меченых молекул показать все большую и широкую влияние в Биоиндастриэл и биомедицинских областях. Для целей нашего исследования мы разработали рекомбинантных белков биотинилированное слияния, содержащие фактор роста нервов (ФРН) и semaphorin3A (Sema3A) функциональные области. Мы сообщали ранее, как эти белки слияния биотинилированный, вместе с другими активными белковых последовательностей, могут быть привязаны к биоматериалов для тканевой инженерии и регенеративной целей. Этот протокол описывает основы инженерной biotinylatable белков в масштабе миллиграмм, используя Т7 лаковые индуцибельную вектор и E. палочки хозяева выражения, начиная с преобразования масштабирования и очистки.

Введение

Белки охватывают широкий диапазон биомолекул, которые отвечают за многих биологических функций, в конечном счете, приводит к правильного формирования тканей и организации. Эти молекулы инициировать тысячи путей, которые контролируют до регулирования и / или понижающей регуляции генов и других белков сигнализации, поддержания равновесия в человеческом теле. Срыв одного белка влияет весь этот веб сигналов, что может привести к возникновению разрушительных расстройств или заболеваний. Инженерно отдельные белки в лаборатории предлагает одно решение для борьбы с этими отрицательных последствий и предлагает альтернативу низкомолекулярных препаратов. В 1977 году, ген, кодирующий последовательность соматостатина 14 аминокислот был одним из первых инженерных полипептидов, созданных с помощью E. палочка 1. Вскоре после того как в 1979 году, инсулин был клонирован в плазмиду pBR322, трансформируется, выразил, и очищенный 2. С тех пор, рекомбинантные белки расширили свое влияние на несколько областей реснить поиск таких как биоматериалов, доставки лекарств, тканевой инженерии, биофармацевтических препаратов, сельского хозяйства, промышленных ферментов, биотоплива и т.д. (по отзывам см. ссылки 3-8). Это в значительной степени из-за гибкости, что метод предлагает через добавлением специализированных химических фрагментов или белковых последовательностей для целей, включая, но не ограничиваясь этим, идентификации целевой белок, стабилизации и очистки.

Через технологии рекомбинантной ДНК, рекомбинантные белки могут быть экспрессированы в различных эукариотов и прокариотов хост-системы, включая млекопитающих, растений, насекомых, дрожжей, грибков или бактерий. Каждый хост предлагает различные преимущества и, как правило, лучшие системы определяется на основе функции белка, выход, стабильность, общей стоимости и масштабируемость. Бактерии клетки часто не хватает посттрансляционные механизмы модификации, что эукариотические хозяева предоставляют (т.е. гликозилирования дисульфид мостов, E TC.) 5. В результате млекопитающих и насекомых системы обычно приводит к лучшей совместимости и экспрессии эукариотических белков, однако эти узлы, как правило, дороже и отнимает много времени 9. Таким образом, Е. палочка является благоприятствования хост для нашей системы экспрессии, поскольку клетки быстро расширяться в недорогих условий роста и генетические механизмы экспрессии хорошо понимал 5,9. Кроме того, эта система легко масштабируется вверх для производственных целей и результатов в функциональных белков, несмотря на отсутствие пост-трансляционных модификаций 10. Е. Штамм E.coli К12 выбирается в этом протоколе для клонирования, поскольку этот штамм предлагает прекрасные урожаи плазмиды на основе высокой эффективностью преобразования. Кроме того, Е. штамм BL21 используется для выражения, потому что эту гостиницу штамм содержит РНК ген полимеразы Т7, которая обеспечивает контролируемое экспрессию белка и стабильности 11.

палатка "> После выбора узла, далее следует соблюдать осторожность при выборе идеального вектора экспрессии, чтобы облегчить выбирают и регулируют экспрессию белка. Синтез рекомбинантных белков начинается с целевой последовательностью ДНК, которая клонирована в соответствии с направлением транскрипции бактериофага Т7 и сигналов перевода, и экспрессия индуцируется в клетках-хозяевах, содержащих хромосомные копии гена РНК-полимеразы Т7 12. Эти векторы, полученные из плазмидного вектора pBR322 (для обзора см. ссылку 13), которые под жестким контролем промотора T7 первоначально разработанного Studier и его коллеги 14 и обеспечивают дополнительное контроль путем включения оператора ЛАК и лаковые репрессор (lac1) 15,16. Для рекомбинантного белка техники, эта система выражение дает возможность адаптировать конкретную аминокислотную последовательность желаемого белка путем вставки различные последовательности ДНК-мишени или создать слитые белки состоит из комбинированного областис с одного белков. Кроме того, некоторые векторные серии включают пептидные изменения тегов, которые будут размещены на N или С-конца. Для наших целей дизайна, гистидин (His) был добавлен к последовательности-мишени ДНК для очистки и biotinylatable последовательность 15 аминокислоты были включены для биотинилирования 17,18. В этом протоколе плазмиду, содержащую ген устойчивости к ампициллину, была выбрана, чтобы нести наши белковые последовательности biotinylatable синтеза. Выражение управляется в этом векторе через Лак промотора Т7 и легко индуцировали изопропил β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG).

Тестовые выражения (мелкомасштабные культур) используются для определения присутствия и растворимость белка-мишени, что может быть выражено либо в растворимой или нерастворимой форме, чтобы сформулировать процедуры очистки. Растворимый белок выразил в бактерий клетки будут испытывать спонтанное сворачивание сохранить свою нативную структуру 19. Обычно роднойструктура термодинамически выгодным. Во многих случаях метаболическая активность хозяина не способствует белка-мишени, оказывает давление на систему, что приводит к нерастворимого продукции белка и образованием телец включения, состоящие из нерастворимых белковых агрегатов. Таким образом, целевой белок денатурирует, что делает их, как правило биологически неактивными 20. Оба теста выражения в увеличенном масштабе, и процедуры выделения определяются растворимости белка-мишени. Дополнительным ренатурация или шаг повторной укладки требуется для нерастворимых белков. Полученные рекомбинантные белки могут быть дополнительно очищен с помощью эксклюзионной хроматографии.

В доме рекомбинантного белка предлагает экономически преимуществ по сравнению с коммерческими продуктами, так как миллиграммов белка-мишени, могут быть выделены на литр основной культуры. Большая часть необходимого оборудования имеется в типичной биологической или химической лаборатории. Белковая инженерия позволяет создаватьпользовательских слитых белков с добавлением функций, которые не всегда имеются в продаже. Рисунок 1 показаны основные процедуры, связанные с инженерно рекомбинантных белков. С помощью этой системы экспрессии мы создали множество biotinylatable белки, такие как интерферон-гамма, тромбоцитарный фактор роста и костного морфогенетического белка-21-23, но мы будем сосредоточить внимание на двух белков, которые мы предназначенных для аксонов, NGF (29 кДа ) и Sema3A (91 кДа) 10 (для обзора см. ссылку 24). Биотинилирование является общим методом для идентификации, иммобилизации и изоляции меченых белков с использованием известного биотин-стрептавидин взаимодействие 25-27. Биофизические зонды 28,29, биосенсоры 30, и квантовые точки 31 приведены некоторые примеры систем, которые используют высокое сродство биотин-стрептавидин сопряжения с Уб на порядка 10 -15 М 27. Е. палочка биоолово лигазы, Бира, помогает в ковалентного биотина в боковой цепи лизина, находящегося в этом биотина последовательность 18,32 помечены. Модем биотин к материалам и биомолекул выпустила задержанную доставку факторов роста в ячейку для нескольких тканевой инженерии 21,33-35. Поэтому, машиностроение эти специально разработанных biotinylatable белки является мощным инструментом, который может превзойти несколько научных интересов.

протокол

1. Проектирование белок-мишень

  1. Использование Национальный центр биотехнологической информации веб-сайта (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) получить аминокислотную последовательность для белка-мишени с учетом видов интереса и любых вариантах сплайсинга. Выбор аминокислотную последовательность, которая соответствует активной области, представляющей интерес белка.
    Примечание: Для Sema3A, аминокислоты 21-747 были выбраны. Слитый белок был разработан с NGF где последовательность барстара, аминокислоты 1-90, был добавлен к NGF аминокислот 122-241.
  2. Для N-конец добавить последующие последовательности: 6X-Его тегов для очистки (HHHHHH), Табак Etch Virus (ТРВ) протеазы вырезать сайт для удаления Его тега (ENLYFQG), биотин последовательность помечены для биотинилирования белка в К (GLNDIFEAQKIEWHE) и гибкий шарнир с пробелами, что позволит комнату для надлежащего белка рефолдинга (EFPKPSTPPGSSGGAP).
    Примечание: Эти последовательности могут варьироваться в зависимости от желаемого слитого протЭйн.
  3. Отправить полную последовательность аминокислот в компанию для генной конструкции / оптимизации для желаемых видов хозяев и синтеза. Подклон в вектор выбора с помощью сайт BamHI-NotI с использованием набора или с использованием коммерческих услуг.

2. Создание агаром

Примечание: Очень важно, что все запасы антибиотиков, пластин, буферы и т.д. хранятся надлежащим образом (температура и продолжительность) и остаются свободными протеаз (стерилизовать).

  1. Взвесить агар 1,5% масс и лизогении бульона (LB) при 20 г / л и месте в стеклянной СМИ бутылки. 500 мл бутылка составляет около 15 пластин.
  2. Объемно добавить сверхчистой воды, хорошо перемешать, и автоклав.
  3. Пусть бутылку прохладной на ощупь и добавить соответствующие антибиотики. Избегайте преждевременного затвердевания агара, но если бутылка охлаждается слишком много, и решение начинает застывать, разогреть в микроволновой печи.
    Примечание: Наша плазмиды содержит ампициллиноустойчивости поколенияэ. Таким образом, все шаги должны содержать ампициллин в концентрации 100 мкг / мл. Е. палочка клонирование K12 штамм требуется тетрациклин (12,5 мкг / мл) к антибиотикам. BL21 бактерии клетки не требует никакого дополнительного антибиотик.
  4. Налейте 25-30 мл раствора на 90 мм чашки Петри и дать время, чтобы высохнуть.
  5. Этикетка блюдо с соответствующими антибиотиками и хранить в обратном порядке в 4 ° С, с парафильмом или в закрывающемся мешке.
    Примечание: Плиты хороши течение приблизительно одного месяца.

3. Клонирование Биотин Tagged плазмиды

Примечание: Условия сделаны в асептических условиях.

  1. Спином вниз плазмиды вектор на 6000 мкг в течение 3 мин для того, чтобы Пелле, и добавить 10 мкл стерилизованной воды высшей степени очистки.
  2. Удалить 50 мкл химически компетентную E. палочки клетки высокой эффективности преобразования от -80 ° С и сразу же разместить на льду в течение 5-10 мин.
  3. Добавить 1 мкл вектора решения в 0,5-1 ng/5056; л клеток к 50 мкл Е. палочки клетки и поместить оставшиеся плазмиды в -80 ° С
  4. Поместите бактерий клеток, содержащих вектор на льду в течение 5 мин.
  5. Тепловой удар клетка и вектор смесь в течение 30-45 сек в 42 ° С водяной бане и место клеток обратно на льду в течение 2 мин.
  6. Добавить 250 мкл супер оптимального бульоне с катаболитной репрессии (SOC) Среднее (2% вес / об бактотриптона, 0,5% вес / объем Бакто-дрожжевой экстракт, 8,56 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 20 мМ MgSO 4, 20 мМ глюкозы , ультрачистой воды, рН = 7,0) и встряхивают при 250 оборотах в минуту при 37 ° С в течение 30 мин.
    Примечание: SOC не необходимо обрабатывать в автоклаве, но быть стерилизовали фильтрованием через фильтр 0,22 мкм.
  7. Сухие пластины 10-15 мин до посева клеток.
  8. Пипетка 25, 50, и 100 мкл раствора клеточной на разных объектах агаровых чашках, содержащих ампициллин (100 мкг / мл) и тетрациклин (12,5 мкг / мл) антибиотиков. Используйте стеклянные бусы распространять решение равномерно пластин агара.
    9. <литий> Выдержите пластины вверх-вниз при 37 ° С в течение 15-18 часов.
  9. Проверьте для небольших индивидуальных колоний бактерий на пластинах и хранить в перевернутом положении при 4 ° С до дальнейшего использования (рис. 2А).
    1. Если нет колоний не присутствуют:
      1. Проверьте свежесть и стерильность буферов и расходных материалов.
      2. Увеличьте количество плазмиды добавлен в Е. палочка K12 штамм.
    2. Если крупные колонии имеются или есть разрастание колоний (рис. 2В и 2С), restreak новый агар пластины с помощью стерильной петли прививки или пластины клетки при низком уровне громкости.
  10. Инокулировать 5 мл LB, содержащей ампициллин (100 мкг / мл) и тетрациклин (12,5 мкг / мл) антибиотиков с одной колонии трансформированной E. палочки клетки. Grow-вверх клетки в течение ночи при 37 ° С при 250-300 оборотов в минуту.
  11. На следующий день, используйте набор для выделения плазмиды для того, чтобы изолировать целевой вектор от ночного ГруW-и хранения очищенной плазмидной при -80 ° С до дальнейшего использования.
    1. Дополнительно: Проверьте чистоту и концентрацию плазмиды с помощью абсорбции чтение, полученной при 260 и 280 нм.

4. Трансформация плазмиды в Expression хост

Примечание: Условия сделаны в асептических условиях.

  1. Повторите шаги 3.2-3.10 для Е. палочка BL21 клетки со следующими изменениями:
    Примечание: BL21 клетки не требует никаких дополнительных антибиотики, поэтому только ампициллин добавляют к чашках с агаром для трансформации.
    1. Добавить 2-5 мкл изолированной плазмиды в 0,5-2 ng/50 мкл клеток от шага 3,12 до 50 мкл Е. палочки принимающие выражение клетки.
    2. Теплового шока клетки для 60-90 сек.
    3. Встряхнуть раствор, содержащий SOC среды при 250 оборотах в минуту в течение 60 мин вместо 30 мин.
  2. Срывать одну колонию трансформированных клеток бактерий из чашки Петри с стерIle стержень аппликатора и место в пробирке, содержащей 5 мл LB бульоне с соответствующей концентрации ампициллина (100 мкг / мл).
  3. Поместите пробирки в шейкере в течение ночи при 37 ° С при 250 оборотах в минуту.
  4. На следующее утро, принять 200 мкл ночной расти вверх и добавить его в 5 мл LB, содержащей ампициллин при 100 мкг / мл.
  5. Замораживание вниз оставшиеся клетки с 250 мкл 50% глицерина (стерильной) до 750 мкл культуры и держать в -80 ° C.
    Примечание: Новый тестовое выражение и МАСШТАБА процедуры можно сделать, используя стерильный аппликатор для получения скрип замороженных клеток и прививки LB с соответствующими антибиотиками.
  6. Поместите пробирку в шейкере при 250-300 оборотов в минуту при 37 ° С, пока оптическая плотность (OD) не измеряется между 0,7-0,8 при оптической плотности 600 нм.
  7. Вызвать клетки с помощью IPTG до конечной концентрации 1 мМ.
  8. Взболтать в течение дополнительных 4 ч при 37 ° С при 300 оборотах в минуту. В качестве альтернативы клетки могут такжебыть встряхивали в течение ночи при 18 ° С при 250-300 оборотов в минуту. Это может привести к более высокий выход плазмиды в зависимости от целевого белка.
  9. Додецилсульфата натрия полиакриламидном геле (SDS-PAGE) Анализ экспрессии испытаний
    1. Возьмите 500 мкл культуры и поместить в 1,5 мл трубки. Спин вниз на 13-15 мкг в течение 5 мин. Слейте надосадочную жидкость и этикетка "растворимый". Ресуспендируют осадок с вортексе в 200 мкл загрузочного красителя (50 мкл 2-меркаптоэтанола, 950 мкл буфера Лэммли образец).
      Примечание: Растворимые бактерии гранулы будут использоваться для определения того, рекомбинантный белок в цитоплазматических регионах бактериальных клеток. Гранулы могут быть сохранены в -80 ° C без загрузки краситель до необходимости. Культура управления бактерии, которые не были трансформированы или индуцированный можно рассматривать как растворимые, а также для сравнения.
    2. Возьмите 1000 мкл культуры и поместить в 1,5 мл трубки. Спин вниз на 13-15 мкг в течение 5 мин.Слейте надосадочную жидкость и этикетка "Не растворим."
      Примечание: Нерастворимые гранулы будут проходить процедуры денатурации ниже, для того, чтобы освободить белков, обнаруженных в телах включения клеток бактерий. Гранулы могут быть сохранены в -80 ° С до использования. Культура управления бактерии, которые не были трансформированы или индуцированный можно рассматривать как нерастворимый а также для сравнения.
      1. Ресуспендируют осадок нерастворимого в 200 мкл Bugbuster и оставить при комнатной температуре в течение 30 мин.
      2. Спином вниз образец снова в 13-15 мкг в течение 5 мин и принимать по 50 мкл супернатанта и добавить его в новой «неразрешимых» 1,5 мл трубки.
      3. Затем добавляют 50 мкл загрузочного красителя в этом новом образце.
    3. Варить как растворимые, так и нерастворимые образцы в течение 5 мин для денатурации белков для анализа SDS-PAGE.
    4. Загрузите каждую пробу в геле со стандартной лестницы.
    5. Для того чтобы визуализировать образцы белка использовать staininг реагента и следовать протоколу компании.
    6. Определите, выражает ли белок в растворимой и / или нерастворимых фракций, сравнивая эти две полосы, а также сравнивая полосы в растворимых и нерастворимых полос контроля (см. Примечание 4.9.1 и 4.9.2) на SDS-PAGE гель (рис. 2). Темно группа должна появляются вокруг молекулярной массы белка в растворимыми или нерастворимыми полос. Это будет определять, какие изоляция процедура для использования в Протоколе 6.
      Примечание: Если есть группа в обоих этих регионах, чем любой изоляция используется в Протоколе 6 ниже, могут быть выполнены или белок может быть выделен в обоих направлениях, чтобы определить, какой метод изоляции производит более высокий выход рекомбинантного белка (рис. 3) .
    7. Если час и на ночь индукции 4 был проведен, определить, какой метод индукции имеет самый высокий производство белка для наращивания масштабов процесса (рис. 2).

    10. 5. Шкала деятельности Порядок и Главная Культура

    1. Подготовка питательной среды с 85,7 г Потрясающе бульоне и 28,8 мл 50% глицерина в 1,8 л воды высшей степени очистки и автоклав на жидком цикла в течение 1 часа.
    2. Начните ночной культуры из замороженных клеток складе созданный на шаге 4.5.
      Примечание: Условия сделаны в асептических условиях.
      1. Смешайте 20 мл LB и с конечной концентрации ампициллина, при 100 мкг / мл в стерильном 125 мл колбу Эрленмейера.
      2. Используя стерильный аппликатор взять слом трансформированной E. палочки клетки и падение аппликатор в колбу. Удалить аппликатор и плагин колбу с пеной пробкой или хлопка и накрыть алюминиевой фольгой, чтобы сохранить стерильность.
      3. Встряхнуть в течение ночи при 250 оборотах в минуту при 37 ° С
    3. Главная Культура
      Примечание: Условия сделаны в асептических условиях.
      1. Налейте ночной культуры в 1,8 л стерильных питательной среды и добавить ампициллин в 100 мкг / мл и от 6 до 8 капель стерильной пеногасителя 204 с использованием пипетки Пастера.
      2. Место культуры в 37 ° C бане воды с 0,2 мм фильтрованный сжатый воздух пузырьков в культурах через аэрации камней.
      3. После того, как OD 600 нм достигает 0,7-0,8, индуцируют с помощью IPTG (1 мм) и позволяют индукции происходить либо 4 ч при 37 ° С или в течение ночи при 18 ° С в зависимости от растворимых / нерастворимых результатов SDS-PAGE на шаге 4.9.
    4. Сбор E. кишечной клетки
      1. Спином вниз клеточной культуры в 1 л центрифуг бутылок (2 бутылки / культура) в течение 15 мин при 14 000 мкг при 4 ° С.
      2. Слейте супернатант и с помощью тонкой лопаточкой, совок бактерии осаждения на две 50 мл пробирок. Клетки могут быть снова осаждают центрифугированием в течение нескольких минут.
        Примечание: Каждый 1,8 л культуры приведет к двум бактерий гранул, по одному в каждом 50 мл центрифужную пробирку.
      3. Храните гранулы в -80 С до изоляции белка.

    6. Выделение и очистка рекомбинантного белка

    Примечание: Если белок находится в растворимой регионе на основе анализа SDS-PAGE со стадии 4.9, то "Родной Изоляция" будет использоваться, но для нерастворимые белки "Nonnative изоляции» процедур будет выполнена.

    1. Лизиса клеток
      1. Nonnative
        1. Удалить трансформированной E. палочка осадок от -80 ° C морозильник, и добавить 20 мл лизирующего / промывочного буфера (табл. 1) каждому трубки центрифуги.
        2. Vortex и встряхните замороженный шарик, пока он не тает и растворяет в буферный раствор без каких-либо больших кусков. Выдержите на nutator ночь. На следующее утро осадок должны теперь быть собой вязкую суспензию из-за денатурации белка из буфера.
        3. Центрифуга суспензии при 20500 х г при комнатной температуре в течение 30 мин. Передача супернатант в новую пробирку для изоляции и отбросить гранул.
        2. Родной
        1. Получить превращается Е. палочка осадок от -80 ° C морозильник.
        2. Добавить лизирующего буфера (табл. 1) в центрифужную пробирку, чтобы достичь конечного объема 30 мл и сместить замороженный осадок на вортексе и встряхивания строго. Поместите шарик на льду.
        3. Промыть ультразвукового зонда 70% этанолом при амплитуде 100% в течение 1-2 мин. Затем повторите с особо чистой воды.
        4. Разрушать ультразвуком бактерий осаждения в то время как на льду в течение 5 мин (всего истечении 10 мин).
          1. Установите ультразвукового при амплитуде 30% с импульсом 30 сек on/30 сек выкл.
          2. Боб центрифуги трубки вверх и вниз во интервала обработки ультразвуком для того, чтобы полностью разбить осадок клеток. В конце общего затраченного времени должно быть никаких видимых бактерии не оставляя осаждения волокнистую вязкую суспензию.
          3. Чистку ультразвукового зонда между различными белковыми выделений, а также для хранения с помощью 70% этанола и ультрачистой воды, как описано в шаге 6.1.2.3.
        5. Центрифуга суспензии при 20500 х г при 4 ° С в течение 30 мин. Передача супернатант в новую пробирку для изоляции и отбросить гранул.
    2. Ni-NTA аффинной хроматографии
      1. Nonnative
        1. Добавить 1 мл Ni 2 +-NTA смолы решение каждой трубки центрифуги (2 общей смолы мл для 1,8 л культуры) и инкубировать при комнатной температуре в течение по крайней мере 1 час на nutator.
        2. Налейте суспензии в аффинной колонке и позволяют решение капать через кран клапан полностью в сточные стакан.
        3. Выполните 10 моет с 10 мл Lysis / промывочного буфера для каждой стирки.
          1. В течение первых двух промываний, добавьте 10 мл в центрифужную пробирку, чтобы удалить дополнительную смолу и затем вылить в колонке. Дополнительные моющие средства могут быть добавлены непосредственно в колонну.
          2. После каждой стирки, перемешать смолу с стеклянной мешалки. После того, как мыть капает в стакан с отходами, могут быть добавлены следующие 10 мл.
        4. После мыть полностью дризображений в секунду через, недалеко кран кран, снять отходов стакан и заменить 50 мл трубки центрифуги для сбора белка.
        5. Добавить 15 мл буфера для элюции (табл. 1) и перемешать-до смолы, что позволяет решение сидеть в течение 5 мин. Открыть кран клапан и собирать элюирования. Повторите еще раз с дополнительными 15 мл.
      2. Родной
        1. Следуйте неродном аффинной хроматографии выше (шаги 6.2.1.1-6.2.1.4), за исключением настроить следующие параметры:
          1. Выдержите Ni 2 +-NTA смолы раствор при 4 ° С в течение не менее 1 часа на nutator.
          2. С помощью соответствующего промывочного буфера (табл. 1).
        2. Добавить 5 мл буфера для элюции (табл. 1) и инкубируют со смолой в течение 5 мин.
          1. Открыть кран клапан и не собирать вымывание пока большая часть раствора капала через.
          2. Добавить 90 мкл / лунку Брэдфорд реагент для очистки 96 лунками. После каждого элюирования позволяют 10 мкл такLution капать из колонны в скважину, содержащий 90 мкл Брэдфорд реагента.
          3. Продолжайте добавлением 5 мл буфера для элюции в то время, пока Брэдфорд анализ больше не обнаруживает белок (цвет идет от темно-синего до светло-голубого, чтобы очистить). Это обычно занимает 4-5 объемы элюирования.
    3. Диализа / Ренатурация
      1. Сделать неродном (ренатурацию) и родные диализа буферов (табл. 1) и магазин в 4 ° С.
        Примечание: рН диализного буфера определяются изоэлектрической точки белка-мишени в (PI). Как правило белков должны быть помещены в буфер по крайней мере один полный пункт выше или ниже их значений Pi.
      2. Трансфер родные и неродные ELUTIONS в диализной трубке с соответствующим молекулярная масса отсечки (25000 MWCO для ФРН и 50000 MWCO для Sema3A). Место каждого образца белка в соответствующем буфере для диализа 1 в течение 4 часов при 4 ° С, а затем заменить с соответствующим буфером 2 надночь при 4 ° C.
        Примечание: Белок должен быть диализовали в каждом буфере в течение по крайней мере 4 часа для правильного повторной укладки и замены буфера иметь место.
      3. Концентрат диализовали в белковых ELUTIONS до менее чем 5 мл с использованием центрифуги концентраторов.
        Примечание: Белки могут быть дополнительно очищен с помощью быстрой жидкостной хроматографии протеинов (FPLC) и концентрируют снова.
    4. Определить концентрацию белка (мг / мл) сушкой вымораживанием образец в 10-50 мл в предварительно взвешенную микроцентрифужную пробирку.
      1. Дополнительно: определить коэффициент поглощения, ε, так что концентрация белка может быть определена в будущих выделений, измеряя поглощение образца при 280 нм с использованием закона Beer-Ламберта: C = A 280 нм / εl, где л является длина пути.

    7. Биотинилирование очищенного белка

    1. Диализировать белков в 10000 MWCO диализа кассеты AGainst 10 мМ Трис (рН = 8,0), заменой буфера каждые 4 ч в общей сложности 6 изменений.
    2. Перенесите рекомбинантных белков (в настоящее время в 10 мМ Трис-буфера) в 2 мл микро-трубки центрифуги для биотинилирования.
    3. Biotinylate белки, используя лигазную комплект биотин белка.
    4. Диализировать белки против PBS (рН = 7,4), используя 10 000 MWCO диализа кассеты с 3 буфера изменяет день в течение 2 дней.
    5. Определить процент биотинилирования белков с использованием набора для количественного определения.
    6. Определить концентрацию снова, как описано в п. 6.4 и хранить при температуре 4 ° С или аликвоты и хранить при температуре -20 ° С в течение длительного хранения.

Результаты

Клонирование и испытаний Выражение

Когда покрытие выполняется должным образом, одной изолированной колонии должны сформировать увеличить шансы выщипывание клональная трансформированные клетки бактерий (рис. 2а). Однако, если слишком много клетки...

Обсуждение

Рекомбинантный инженерно белок является очень мощная техника, которая охватывает множество дисциплин. Он является экономически эффективным, перестраиваемый и относительно простая процедура, что позволяет производство высокими выходами специально разработанных белков. Важно отмет?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить признательность в Университете Акрона за финансирование, которое поддерживает эту работу.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5%Chem-Impex International127100 g
2-Hydroxyethylmercaptan β-MercaptoethanolChem-Impex International642250 ml
Acetic acid, glacialEMDAX0073-92.5 L
AgarBioshopAGR001.500500 g
Ampicillin sodium salt Sigma-AldrichA951825 g
Antifoam 204Sigma-AldrichA6426500 g
Barstar-NGF pET-21a(+)GenScript USA Inc.4 µg
BL21(DE3) Competent CellsNovagen694501 ml; Expression Host
Bradford reagentSigma-AldrichB6916500 ml
BugBusterNovagen70922-3100 ml
Gel filtration standardBio-Rad151-19016 vials
GlycerolBioshopGLY001.11 L
Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochlorideChem-Impex International1521 kg
His-Pur Ni-NTA ResinThermo Scientific88222100 ml
Hydrochloric acidEMDHX0603-32.5 L
Imidazole Chem-Impex International418250 g
IPTGChem-Impex International194100 g
Laemmli sample bufferBio-Rad161-073730 ml
Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surfaceChem-Impex International270500 g
LB Broth  Sigma-AldrichL30221 kg
NovaBlue Competent CellsNovagen698251 ml; Cloning Host
Phosphate buffered salineSigma-AldrichP5368-10PAK10 pack
Potassium ChlorideChem-Impex International012471 kg
Sema3A-pET-21a(+)GenScript USA Inc.4 µg
SimplyBlue SafeStainInvitrogenLC60601 L
Sodium chlorideSigma-AldrichS5886-1KG1 kg
Sodium hydroxideFisher ScientificS318-500500 g
Sodium phosphate diabasicSigma-AldrichS5136-500G500 g
Sodium phosphate monobasicSigma-AldrichS5011500 g
Terrific BrothBioshopTER409.55 kg
Tetracycline hydrochlorideChem-Impex International66725 g
Tris/Glycine/SDS Buffer, 10xBio-Rad16107321 L
Trizma BaseSigma-AldrichT15031 kg
Tryptone, pancreaticEMD1.07213.10001 kg
Yeast extract, granulatedEMD1.03753.0500500 g
 ÄKTApurifier10GE Healthcare28-4062-64Includes kits and accessories
Benchtop Orbital ShakerThermo ScientificSHKE4000MAXQ 4000
BirA500AvidityBirA500Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution
Dialysis CasetteThermo Scientific66380Slide-A-Lyzer (Extra Strength)
Dialysis TubingSpectrum Laboratories132127, 132129MWCO: 25,000 and 50,000
Flow Diversion Valve FV-923GE Healthcare11-0011-70
FluoReporter Biotin Quantification Assay KitInvitrogen1094598
Frac-950 Tube Racks, Rack CGE Healthcare18-6083-13
Fraction Collector Frac-950GE Healthcare18-6083-00Includes kits and accessories
Heated/Refrigerated Circulator VWR13271-102Model 1156D
Heating Oven FD SeriesBinderModel FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pgGE Healthcare17-1069-01Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI Avanti CentrifugeBeckman Coulter393126
JA 25.50 RotorBeckman Coulter363055
JLA 8.1 RotorBeckman Coulter969329Includes 1 L polyporpylene bottles
JS 5.3 RotorBeckman Coulter368690
Laminar Flow HoodThemo Scientific1849Forma 1800 Series Clean Bench
Microplate ReaderTECANinfinite M200
Mini-PROTEAN Tetra CellBio-Rad165-80044-gel vertical electrophoresis system
Mini-PROTEAN TGX Precast GelsBio-Rad456-9036Any kDa, 15-well comb
Ni-NTA ColumnBio-Rad737-251249 ml volume ECONO-Column
Plasmid Miniprep KitOmega Bio-TekD6943-01
PowerPac HC Power SupplyBio-Rad164-5052250 V, 3 A, 300 W
Round Bottom Polypropylene Copolymer TubesVWR3119-005050 ml tubes for JA 25.50 rotor
Spin-X UF ConcentratorsCorning431488, 431483 20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da
Subcloning ServiceGenScript USA Inc.Protein Services
Ultrasonic Processor Cole-Parmer18910445AModel CV18
Vortex-Genie 2Scientific IndustriesSI-0236Model G560

Ссылки

  1. Itakura, K., et al. Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin. Science. 198 (4321), 1056-1063 (1977).
  2. Goeddel, D. V., et al. Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (1), 106-110 (1979).
  3. Romano, N. H., Sengupta, D., Chung, C., Heilshorn, S. C. Protein-engineered biomaterials: nanoscale mimics of the extracellular matrix. Biochim. Biophys. Acta. 1810 (3), 339-349 (2011).
  4. Sengupta, D., Heilshorn, S. C. Protein-engineered biomaterials: highly tunable tissue engineering scaffolds. Tissue Eng. Part B Rev. 16 (3), 285-293 (2010).
  5. Kamionka, M. Engineering of therapeutic proteins production in Escherichia coli. Curr. Pharm. Biotechnol. 12 (2), 268-274 (2011).
  6. Rao, A. G. The outlook for protein engineering in crop improvement. Plant Physiol. 147 (1), 6-12 (2008).
  7. Wen, F., Nair, N. U., Zhao, H. Protein engineering in designing tailored enzymes and microorganisms for biofuels production. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (4), 412-419 (2009).
  8. Singh, R. K., Tiwari, M. K., Singh, R., Lee, J. K. From protein engineering to immobilization: promising strategies for the upgrade of industrial enzymes. Int. J. Mol. Sci. 14 (1), 1232-1277 (2013).
  9. Bernaudat, F., et al. Heterologous expression of membrane proteins: choosing the appropriate host. PLoS One. 6 (12), (2011).
  10. McCormick, A. M., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. Specific immobilization of biotinylated fusion proteins NGF and Sema3A utilizing a photo-cross-linkable diazirine compound for controlling neurite extension. Bioconjug. Chem. 24 (9), 1515-1526 (2013).
  11. Studier, F. W., Daegelen, P., Lenski, R. E., Maslov, S., Kim, J. F. Understanding the differences between genome sequences of Escherichia coli. B strains REL606 and BL21(DE3) and comparison of the E. coli B and K-12. 394 (4), 653-680 (2009).
  12. Merck KGaA, . . Novagen pET System Manual. , 1-63 (2011).
  13. Balbas, P., Bolivar, F. Back to basics: pBR322 and protein expression systems in E. coli. Methods Mol. Biol. 267, 77-90 (2004).
  14. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol.. 189 (1), 113-130 (1986).
  15. Dubendorff, J. W., Studier, F. W. Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor. J. Mol. Biol. 219 (1), 45-59 (1991).
  16. Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).
  17. Tucker, J., Grisshammer, R. Purification of a rat neurotensin receptor expressed in Escherichia coli. Biochem. J.. 317, 891-899 (1996).
  18. Schatz, P. J. Use of peptide libraries to map the substrate specificity of a peptide-modifying enzyme: a 13 residue consensus peptide specifies biotinylation in Escherichia coli). Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).
  19. Anfinsen, C. B. Principles that govern the folding of protein chains. Science. 181 (4096), 223-230 (1973).
  20. Villaverde, A., Carrio, M. M. Protein aggregation in recombinant bacteria: biological role of inclusion bodies. Biotechnol. Lett. 25 (17), 1385-1395 (2003).
  21. Leipzig, N. D., Wylie, R. G., Kim, H., Shoichet, M. S. Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds. Biomaterials. 32 (1), 57-64 (2011).
  22. Tam, R. Y., Cooke, M. J., Shoichet, M. S. A covalently modified hydrogel blend of hyaluronan-methyl cellulose with peptides and growth factors influences neural stem/progenitor cell fate. J. Mater. Chem. 22, 19402-19411 (2012).
  23. Li, H., Wijekoon, A., Leipzig, N. D. 3D Differentiation of Neural Stem Cells in Macroporous Photopolymerizable Hydrogel Scaffolds. PLoS One. 7 (11), (2012).
  24. McCormick, A. M., Leipzig, N. D. Neural regenerative strategies incorporating biomolecular axon guidance signals. Ann. Biomed. Eng. 40 (3), 578-597 (2012).
  25. Kay, B. K., Thai, S., Volgina, V. V. High-throughput biotinylation of proteins. Methods Mol. Biol. 498, 185-196 (2009).
  26. Bayer, E. A., Wilchek, M. Protein biotinylation. Methods Enzymol. 184, 138-160 (1990).
  27. Weber, P. C., Ohlendorf, D. H., Wendoloski, J. J., Salemme, F. R. Structural origins of high-affinity biotin binding to streptavidin. Science. 243 (4887), 85-88 (1989).
  28. Chen, I., Ting, A. Y. Site-specific labeling of proteins with small molecules in live cells. Curr. Opin. Biotechnol. 16 (1), 35-40 (2005).
  29. Howarth, M., Ting, A. Y. Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin. Nat. Protoc. 3 (3), 534-545 (2008).
  30. Hutsell, S. Q., Kimple, R. J., Siderovski, D. P., Willard, F. S., Kimple, A. J. High-affinity immobilization of proteins using biotin- and GST-based coupling strategies. Methods Mol. Biol. 627, 75-90 (2010).
  31. Marek, P., Senecal, K., Nida, D., Magnone, J., Senecal, A. Application of a biotin functionalized QD assay for determining available binding sites on electrospun nanofiber membrane. J. Nanobiotechnol. 9, 48 (2011).
  32. Cull, M. G., Schatz, P. J. Biotinylation of proteins in vivo and in vitro using small peptide tags. Methods Enzymol. 326, 430-440 (2000).
  33. Miller, R. E., Kopesky, P. W., Grodzinsky, A. J. Growth factor delivery through self-assembling peptide scaffolds. Clin. Orthop. Relat. Res. 469 (10), 2716-2724 (2011).
  34. Davis, M. E., Hsieh, P. C., Grodzinsky, A. J., Lee, R. T. Custom design of the cardiac microenvironment with biomaterials. Circ. Res. 97 (1), 8-15 (2005).
  35. Tokatlian, T., Shrum, C. T., Kadoya, W. M., Segura, T. Protease degradable tethers for controlled and cell-mediated release of nanoparticles in 2- and 3-dimensions. Biomaterials. 31 (31), 8072-8080 (2010).
  36. Gill, R. T., Valdes, J. J., Bentley, W. E. A comparative study of global stress gene regulation in response to overexpression of recombinant proteins in Escherichia coli. Metab. Eng. 2 (3), 178-189 (2000).
  37. Sivashanmugam, A., et al. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein Sci. 18 (5), 936-948 (2009).
  38. Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nat. Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  39. Marston, F. A. The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in Escherichia coli. Biochem. J. 240 (1), 1-12 (1986).
  40. Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb. Cell Fact. 4 (1), (2005).
  41. de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli. BMC Biotechnol. 7, 32 (2007).
  42. de Groot, N. S., Ventura, S. Effect of temperature on protein quality in bacterial inclusion bodies. FEBS Lett. 580 (27), 6471-6476 (2006).
  43. Ventura, S., Villaverde, A. Protein quality in bacterial inclusion bodies. Trends Biotechnol. 24 (4), 179-185 (2006).
  44. Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures. Biotechnol. Bioeng. 96 (6), 1101-1106 (2007).
  45. Peternel, S., Komel, R. Isolation of biologically active nanomaterial (inclusion bodies) from bacterial cells. Microb. Cell Fact. 9, 66 (2010).
  46. Garcia-Fruitos, E. Inclusion bodies: a new concept. Microb. Cell Fact. 9. 9, 80 (2010).
  47. Li, Y., Sousa, R. Expression and purification of E. coli BirA biotin ligase for in vitro biotinylation. Protein Expr. Purif. 82 (1), 162-167 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

83AviTagNi NTA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены