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Resumo

Desenvolvimento de proteínas de fusão biotinylatable tem muitas aplicações potenciais em diversas áreas de pesquisa. Engenharia de proteínas recombinantes é um procedimento para a frente que é eficaz em termos de custos, rendimentos elevados de proteínas personalizados.

Resumo

Engenharia de proteínas recombinantes utilizou Escherichia coli (E. coli) para sistemas de expressão de quase quatro décadas, e hoje E. coli é ainda o organismo hospedeiro mais utilizado. A flexibilidade do sistema permite a adição de porções tais como uma etiqueta de biotina (para interacção com estreptavidina) e proteínas funcionais maiores, como a proteína fluorescente verde ou proteína vermelho cereja. Além disso, a integração de aminoácidos não naturais como quelantes de iões de metais, grupos funcionais reactivos, exclusivamente sondas espectroscópicas, e as moléculas que conferem modificações pós-traducionais permitiu uma melhor manipulação de propriedades de proteína e funcionalidades. Como resultado desta técnica cria proteínas de fusão personalizáveis ​​que oferecem utilidade significativa para vários campos de pesquisa. Mais especificamente, a sequência da proteína biotinylatable foi incorporado em muitas proteínas alvo, devido à interacção de alta afinidade entre biotina com a avidina e estreptavidina. Esta adição tem ajudado no aumento da detecção e purificação de proteínas marcadas, bem como abrindo o caminho para aplicações secundárias, tais como separação de células. Assim, as moléculas marcadas com biotina mostram uma influência crescente e generalizada nos campos Bioindustrial e biomédicas. Para efeitos de nossa pesquisa, temos projetado proteínas de fusão biotinilado recombinantes contendo fator de crescimento do nervo (NGF) e semaphorin3A (SEMA3A) regiões funcionais. Nós temos descrito anteriormente como estas proteínas de fusão biotinilado, juntamente com outras sequências de proteínas activas, pode ser preso a biomateriais para a engenharia de tecidos e efeitos regenerativos. Este protocolo descreve os conceitos básicos de proteínas biotinylatable engenharia na escala miligrama, utilizando um vetor lac induzível T7 e E. hospedeiros de expressão de E. coli, a partir da transformação de aumento de escala e purificação.

Introdução

Proteínas de cobrir uma vasta gama de biomoléculas que são responsáveis ​​por muitas funções biológicas, levando à formação de tecido adequado e organização. Estas moléculas de milhares de iniciar as vias de sinalização que controlam a regulação positiva e / ou sub-regulação de genes e outras proteínas, mantendo o equilíbrio dentro do corpo humano. O rompimento de uma única proteína afeta toda esta teia de sinais, que podem levar ao aparecimento de distúrbios ou doenças devastadoras. Engenharia proteínas individuais no laboratório oferece uma solução para combater estes efeitos adversos e oferece uma alternativa aos medicamentos de pequenas moléculas. Em 1977, um gene que codifica a sequência de aminoácidos de somatostatina 14 foi um dos primeiros polipeptídeos engenharia criadas utilizando E. coli 1. Logo depois, em 1979, a insulina foi clonado no plasmídeo pBR322, transformada, expressa, purificada e 2. Desde então, as proteínas recombinantes têm expandido sua influência em vários campos da research como biomateriais, a entrega da droga, engenharia de tecidos, biofármacos, agricultura, enzimas industriais, biocombustíveis, etc (para revisões ver referências 3-8). Isto é principalmente devido à versatilidade que a técnica oferece através da adição de porções de aplicação de produtos químicos específicos ou sequências de proteínas para fins incluindo, mas não limitado a, a identificação das proteínas alvo, de estabilização e de purificação.

Através da tecnologia de DNA recombinante, as proteínas recombinantes podem ser expressas em uma variedade de sistemas de hospedeiros eucariotas e procariotas, incluindo mamíferos, plantas, insectos, leveduras, fungos e bactérias. Cada host oferece diferentes vantagens e, normalmente, o melhor sistema é determinado com base na função da proteína, rendimento, estabilidade, custo total, e escalabilidade. Células de bactérias, muitas vezes não têm os mecanismos de modificação pós-traducionais que os anfitriões fornecem eucarióticas (ou seja, glicosilação, dissulfeto de transição, e tc.) 5. Como resultado, os sistemas de mamífero e de insecto geralmente resultam em melhor compatibilidade e de expressão de proteínas eucarióticas, no entanto estes hospedeiros são geralmente mais caros e 9 demorado. Portanto, E. coli é o hospedeiro preferido para o nosso sistema de expressão, porque as células se expandem rapidamente em condições de crescimento de baixo custo e os mecanismos de expressão genética são bem compreendidos 5,9. Além disso, este sistema é de fácil aumento de escala para fins de produção e resulta em proteínas funcionais, apesar da ausência de modificações pós-translacionais 10. A E. coli K12 tensão é escolhida neste protocolo para a clonagem, porque esta estirpe oferece excelentes rendimentos plasmídeos baseados em alta eficiência de transformação. Além disso, uma E. coli estirpe BL21 utilizado para a expressão porque esta estirpe hospedeira contem o gene da RNA polimerase de T7, que proporciona a expressão da proteína e da estabilidade controlada 11.

tenda "> Após a seleção anfitriã, mais cuidado deve ser tomado na escolha do vetor de expressão ideal para facilitar selecionados e controlados expressão da proteína. Sintetizando proteínas recombinantes começa com uma sequência de DNA alvo que é clonado sob a direção de transcrição bacteriófago T7 e sinais de tradução e expressão é induzida em células hospedeiras contendo cópias cromossómicas do gene da T7 ARN polimerase 12. Estes vectores, derivados de pBR322 plasmídeo vector (para uma revisão ver referência 13), é rigorosamente controlada pelo promotor T7 inicialmente desenvolvido por Studier e colegas 14 e fornecer adicional controlo por meio da inclusão do operador lac e o repressor lac (LAC1) 15,16. Para a engenharia de proteína recombinante, este sistema de expressão oferece a possibilidade de adaptar a uma sequência específica de aminoácidos de uma proteína desejada através da inserção de sequências de DNA alvo diferentes ou para criar proteínas de fusão composta de domínio combinados de proteínas individuais. Além disso, algumas séries de vetores incluem modificações tag peptídeo a ser colocados no N ou C terminal. Para os nossos propósitos de desenho, uma histidina (His) tag foi adicionado à sequência de ADN alvo para a purificação e uma sequência de 15 aminoácidos biotinylatable foi incluído para biotinilação 17,18. Neste protocolo de um plasmídeo contendo um gene de resistência à ampicilina, foi escolhido para realizar os nossos sequências de proteínas de fusão biotinylatable. A expressão é controlada por este vector, através do promotor lac de T7 e é facilmente induzida com isopropil β-D-1-tiogalactopiranosido (IPTG).

Expressões de ensaio (culturas em pequena escala) são usados ​​para determinar a presença e a solubilidade da proteína alvo, que pode ser expresso numa forma solúvel ou insolúvel para formular os procedimentos de purificação. Uma proteína solúvel expressa dentro da célula bacteriana será submetido a dobragem espontânea para manter a sua estrutura nativa 19. Tipicamente, o nativoestrutura é termodinamicamente favorável. Em muitos casos, a actividade metabólica do hospedeiro não é favorável para a proteína alvo, colocando pressão no sistema que leva à produção de proteína insolúvel e a formação de corpos de inclusão na forma de agregados de proteínas insolúveis. Assim, a proteína alvo desnatura, tornando-os biologicamente inactivos, geralmente 20. Ambas as expressões de ensaio são incrementados, e os procedimentos de isolamento é determinada pela solubilidade da proteína alvo. Um adicional de renaturação ou redobramento etapa é necessária para as proteínas insolúveis. As proteínas recombinantes resultantes podem ser ainda purificado usando cromatografia de exclusão de tamanho.

No casa de produção de proteína recombinante oferece vantagens de custo sobre os produtos comerciais desde miligramas de proteína alvo pode ser isolado por litro de cultura principal. A maior parte do equipamento necessário está disponível num laboratório biológico ou químico típico. Engenharia de proteínas permite a criaçãode proteínas de fusão de costume com funcionalidades adicionais que nem sempre estão disponíveis comercialmente. Figura 1 mostra os principais procedimentos envolvidos na engenharia de proteínas recombinantes. Com este sistema de expressão que criamos muitas proteínas biotinylatable, como o interferon-gama, fator de crescimento derivado das plaquetas e proteína morfogenética óssea-21-23, mas vamos nos concentrar em duas proteínas que nós projetamos para orientação do axônio, NGF (29 kDa ) e SEMA3A (91 kDa) 10 (para revisão ver referência 24). A biotinilação é uma técnica comum para a identificação, a imobilização e isolamento de proteínas marcadas utilizando a interacção biotina-estreptavidina bem conhecido 25-27. Sondas biofísicas 28,29, biossensores 30, e quantum dots 31 são alguns exemplos de sistemas que utilizam a alta afinidade de conjugação biotina-estreptavidina com um K d da ordem de 10 -15 M 27. A E. coli bioligase de estanho, BirA, auxilia na ligação covalente de biotina para a cadeia lateral de lisina encontrada no interior da sequência de biotina marcado 18,32. Tethering biotina aos materiais e biomoléculas produziu entrega sustentada de fatores de crescimento para a célula para múltiplas aplicações em engenharia de tecidos 21,33-35. Portanto, engenharia estas proteínas biotinylatable design personalizado é uma ferramenta poderosa que pode transcender a múltiplos interesses de pesquisa.

Protocolo

1. Projecção da proteína alvo

  1. Usando o Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) obter uma sequência de aminoácidos para a proteína alvo tendo em conta as espécies de interesse e as variantes de emenda. Seleccionar a sequência de aminoácidos que corresponde à região activa de interesse da proteína.
    Nota: Para SEMA3A, aminoácidos 21-747 foram escolhidos. A proteína de fusão foi concebido com NGF, onde a sequência de barstar, aminoácido 1-90, foi adicionado a aminoácidos de NGF 122-241.
  2. Ao N-terminal adicione as seguintes seqüências: 6X-his para a purificação (HHHHHH), Tabaco Etch Vírus (TEV) corte local protease para a remoção de seu tag (ENLYFQG), biotina marcado seqüência para biotinilaï de proteína em K (GLNDIFEAQKIEWHE) e dobradiça flexível com aberturas que permitam espaço para refolding proteína adequada (EFPKPSTPPGSSGGAP).
    Nota: Estas sequências podem variar dependendo do prot fusão desejadaein.
  3. Enviar sequência completa de aminoácidos de uma empresa para o gene projeto / otimização para espécies hospedeiras desejados e síntese. Subclone em um vetor de escolha utilizando o sítio BamHI-NotI usando um kit ou utilizando serviços comerciais.

2. Fazendo placas de ágar

Nota: É muito importante que todas as reservas de antibióticos, pratos, buffers, etc, são armazenados adequadamente (temperatura e duração) e permanecem livres de proteases (esterilizado).

  1. Pesar agar a 1,5% em peso e caldo lisogenia (LB) a 20 g / L e coloque em uma garrafa de vidro de mídia. Uma garrafa de 500 ml faz cerca de 15 placas.
  2. Volumetricamente adicionar água ultrapura, misture bem, e autoclave.
  3. Deixe esfriar garrafa ao toque e adicionar os antibióticos apropriados. Evite solidificação prematura de agar, no entanto, se garrafa esfria muito e solução começa a congelar, aquecer no microondas.
    Nota: Nossa plasmídeo contém um gen de resistência à ampicilinae. Portanto, todos os passos devem conter ampicilina a 100 ug / ml. A E. coli K12 estirpe clonagem requer tetraciclina (12,5 ug / ml) do antibiótico. Células bacterianas BL21 não requerem qualquer antibiótico adicional.
  4. Despeje 25-30 ml de solução em 90 milímetros pratos de Petri e permitir tempo para secar.
  5. Prato Label com antibióticos apropriados e loja de cabeça para baixo em 4 ° C, com Parafilm ou em um saco hermeticamente fechado.
    Nota: As placas são bons para cerca de um mês.

3. Clonagem da Biotina Tagged plasmídeo

Nota: As condições são realizadas de forma asséptica.

  1. Girar plasmídeo vetor a 6.000 xg por 3 min, a fim de agregar e adicionar 10 ml de água ultrapura esterilizada.
  2. Remover 50 mL de E. quimicamente competente células de alta eficiência de transformação de E. coli a partir de -80 ° C e colocar imediatamente em gelo durante 5-10 min.
  3. Adicionar 1 ml de solução de vetor em 0,5-1 ng/50Células L para a 50 ul E.; 56 coli células e colocar o plasmídeo restante em -80 ° C.
  4. Colocar as células de bactérias que contêm o vector em gelo durante 5 min.
  5. Choque térmico da célula e mistura vetor para 30-45 seg em 42 ° C banho de água e coloque as células de volta no gelo por 2 min.
  6. Adicionar 250 mL de caldo de super óptima com repressão catabólica (SOC) média (2% w / v de bacto-triptona, 0,5% w / v de extracto de bacto-levedura, NaCl a 8,56 mM, KCl 2,5 mM, 20 mM de MgSO 4, 20 mM de glucose , água ultrapura, pH = 7,0) e agitar a 250 rpm a 37 ° C durante 30 min.
    Nota: SOC não deve ser autoclavado, mas ser esterilizado por filtração através de um filtro de 0,22 um.
  7. Secar as placas de 10-15 min antes do plaqueamento das células.
  8. Pipetar 25, 50, e 100 ul de solução de células em placas de agar contendo ampicilina separadas (100 ug / ml) e tetraciclina (12,5 ug / ml) antibióticos. Use contas de vidro para distribuir solução uniformemente sobre placas de ágar.
  9. Incubar as placas de cabeça para baixo, a 37 ° C durante 15-18 horas.
  10. Entrada para pequenas colónias de bactérias individuais em placas e armazenar de cabeça para baixo a 4 ° C até à sua utilização (Figura 2A).
    1. Se não houver colônias estão presentes:
      1. Confira o frescor ea esterilidade de buffers e suprimentos.
      2. Aumentar a quantidade de plasmídeo adicionado a E. coli K12 tensão.
    2. Se grandes colônias estão presentes ou se houver um crescimento excessivo de colônias (Figura 2B e 2C), restreak uma nova placa de ágar usando um loop de inoculação estéril ou células da placa com menor volume.
  11. Inocular 5 ml de LB contendo ampicilina (100 ug / ml) e tetraciclina (12,5 ug / ml) Os antibióticos com uma única colónia de E. transformado células de E. coli. As células crescem-se durante a noite a 37 ° C a 250-300 rpm.
  12. No dia seguinte, utilizar um kit de isolamento de plasmídeo, a fim de isolar o vector alvo de gro overnightw-se e armazenar plasmídeo purificado a -80 ° C até à sua utilização.
    1. Opcional: Verifique a pureza e concentração de plasmídeo usando leitura de absorbância obtidos a 260 e 280 nm.

4. Transformação de plasmídeo para expressão do host

Nota: As condições são realizadas de forma asséptica.

  1. Repita os passos 3,2-3,10 para E. células de E. coli BL21 com as seguintes alterações:
    Nota: as células BL21 não requerem quaisquer antibióticos adicionais, por conseguinte, apenas ampicilina é adicionada às placas de agar para a transformação.
    1. Adicione 2-5 mL de plasmídeo isolado em 0,5-2 ng/50 células ul da etapa 3,12-50 mL E. As células hospedeiras de expressão de E. coli.
    2. Células de choque térmico para 60-90 seg.
    3. Agitar solução contendo meio SOC a 250 rpm durante 60 minutos em vez de 30 minutos.
  2. Arrancar uma única colônia de células de bactérias transformadas a partir da placa de Petri com um sterile aplicador vara e colocar num tubo de ensaio contendo 5 ml de caldo de LB com a concentração adequada de ampicilina (100 ug / ml).
  3. Colocar os tubos de ensaio no agitador durante a noite a 37 ° C a 250 rpm.
  4. Na manhã seguinte, 200 mL de ter a durante a noite a crescer-se e adicioná-lo ao 5 ml de LB contendo ampicilina a 100 ug / ml.
  5. Congelar as células restantes com 250 mL de 50% de glicerol (estéril) para 750 mL da cultura e se manter em -80 ° C.
    Nota: Novo teste de expressão e procedimentos de aumento de escala pode ser feito por meio de uma vareta aplicadora estéril para obter uma raspagem de células congeladas e inoculando LB com os antibióticos apropriados.
  6. Coloque o tubo de ensaio no agitador a 250-300 rpm, a 37 ° C, até a densidade óptica (OD) é medida entre 0,7-0,8 a uma absorvância de 600 nm.
  7. Induzem as células com IPTG a uma concentração final de 1 mM.
  8. Agita-se durante 4 horas adicionais a 37 ° C a 300 rpm. Alternativamente células podem tambémser agitada durante a noite a 18 ° C a 250-300 rpm. Isto pode produzir um elevado rendimento de plasmídeo de acordo com a proteína alvo.
  9. Dodecilsulfato de sódio em gel de poliacrilamida de electroforese (SDS-PAGE) Análise de expressão de teste
    1. Tome 500 mL de cultura e colocar em um tubo de 1,5 ml. Gire para baixo em 13-15 g durante 5 min. Deitar fora o líquido sobrenadante e rotular "solúvel". Ressuspender o granulado com vórtex em 200 ul de corante de carregamento (50 ul de 2-mercaptoetanol, o tampão de amostra de Laemmli 950 ul).
      Nota: bactérias solúveis peletes será utilizada para determinar se a proteína recombinante é das regiões citoplasmática das células das bactérias. Os peletes podem ser armazenadas em -80 ° C, sem o carregamento de corante até que seja necessário. Uma cultura de bactérias de controlo que não tenha sido transformada ou induzida pode ser tratada como solúvel, bem como para a comparação.
    2. Tome 1.000 l de cultura e colocar em um tubo de 1,5 ml. Gire para baixo em 13-15 g durante 5 min.Deitar fora o líquido sobrenadante e rotular "insolúvel".
      Nota: pelotas insolúveis passará por procedimentos de desnaturação abaixo, a fim de liberar as proteínas encontradas em corpos de inclusão de células de bactérias. Os peletes podem ser armazenadas em -80 ° C até ser necessário. Uma cultura de bactérias de controlo que não tenha sido transformada ou induzida pode ser tratada como insolúvel, bem como para a comparação.
      1. Ressuspender o sedimento insolúvel em 200 ul Bugbuster e deixar à temperatura ambiente durante 30 min.
      2. Girar amostra novamente em 13-15 g durante 5 min e tomar 50 ul de sobrenadante e adicioná-lo à nova "Insolúvel" 1,5 ml tubo.
      3. Em seguida, adicionar 50 ul de corante de carga a esta nova amostra.
    3. Ferver as duas amostras solúveis e insolúveis por 5 min para desnaturar proteínas para análise de SDS-PAGE.
    4. Coloque cada amostra em gel de eletroforese com escada padrão.
    5. A fim de visualizar as amostras de proteína usar um staining reagente e seguir o protocolo da empresa.
    6. Determinar se a proteína expressa nas fracções solúveis e / ou insolúveis, comparando estas duas faixas, bem como a comparação das faixas para as pistas de controlo solúveis e insolúveis (ver Nota 4.9.1 e 4.9.2) em gel de SDS-PAGE (Figura 2). Uma banda escura deve aparecer em torno do peso molecular da proteína nas pistas solúveis ou insolúveis. Isto irá determinar qual o procedimento de isolamento para usar no Protocolo 6.
      Nota: Se existir uma banda em ambas as regiões do que qualquer um de isolamento utilizado no protocolo 6 abaixo pode ser realizado, ou a proteína pode ser isolado em ambos os sentidos, a fim de determinar qual o método de isolamento produz um maior rendimento de proteína recombinante (Figura 3) .
    7. Se um 4 hr e durante a noite a indução foi realizada, determinar qual o método de indução tem a maior produção de proteínas para o processo de aumento de escala (Figura 2).

5. Scale-up Procedimento e Cultura Principal

  1. Preparar o meio de crescimento com 85,7 g de Terrific Broth e 28,8 ml de glicerol a 50% em 1,8 L de água ultrapura e autoclave em ciclo líquido durante 1 hora.
  2. Iniciar uma cultura durante a noite a partir de estoque de células congeladas criado no passo 4.5.
    Nota: As condições são realizadas de forma asséptica.
    1. Misturar 20 ml de LB e com uma concentração final de ampicilina a 100 ug / ml em 125 ml de um frasco de Erlenmeyer esterilizado.
    2. Usando uma vara aplicador estéril dar uma demolição de transformar E. coli e células aplicador gota para o balão. Remover aplicador e frasco ficha com rolha de espuma ou algodão e cubra com papel alumínio para manter a esterilidade.
    3. Agitar durante a noite a 250 rpm a 37 ° C.
  3. Cultura Principal
    Nota: As condições são realizadas de forma asséptica.
    1. Despeje cultura durante a noite em 1,8 L de meio de crescimento estéreis e adicionar ampicilina em 100 ug / ml e 6-8 gotas de anti-espuma esterilizado 204, utilizando uma pipeta Pasteur.
    2. Coloque culturas em um C banho de água 37 ° com 0,2 milímetros filtrados borbulhamento de ar comprimido em culturas através pedras de aeração.
    3. Uma vez que o OD 600 nm alcança 0,7-0,8, induzir com IPTG (1 mM) e permitir a indução de ocorrer um 4 horas a 37 ° C ou durante a noite a 18 ° C, dependendo dos resultados da solúveis / insolúveis a partir de SDS-PAGE no passo 4.9.
  4. Coleta E. As células de E. coli
    1. Girar a cultura de células em frascos de 1 L centrífuga (2 garrafas / cultura) durante 15 min a 14.000 xg, a 4 ° C.
    2. Deitar fora o sobrenadante e usando uma espátula fina, colher as bactérias da pelota em dois tubos de 50 ml. As células podem ser sedimentadas de novo por centrifugação, durante alguns minutos.
      Nota: Cada cultura de 1,8 L resultará em dois pelotas de bactérias, uma em cada um dos tubos de centrífuga de 50 ml.
    3. Pelotas Armazene em -80 C até o isolamento das proteínas.

6. Isolamento e Purificação da Proteína Recombinante

Nota: Se a proteína está localizada na região solúvel com base da análise de SDS-PAGE do passo 4.9, em seguida, "Isolation nativo" irá ser utilizado, mas para as proteínas insolúveis "isolamento" não nativos procedimentos serão realizados.

  1. A lise celular
    1. Não nativos
      1. Remover transformado E. coli sedimento de -80 ° C congelador, e adiciona-se 20 ml de Lise / Wash Buffer (Quadro 1) para cada tubo de centrífuga.
      2. Vortex e agitar o sedimento congelado até que ele derrete e solubiliza na solução-tampão sem pedaços grandes. Incubar em nutator durante a noite. Na manhã seguinte, o sedimento deve ser agora uma massa viscosa, devido à desnaturação da proteína a partir do tampão.
      3. Centrifugar a suspensão a 20.500 x g à temperatura ambiente durante 30 min. Transferir o sobrenadante para um tubo novo para o isolamento e descarte do sedimento.
    2. Native
      1. Obter transformado E. coli a partir de sedimento de -80 ° C congelador.
      2. Adicionar tampão de lise (Tabela 1) para o tubo de centrífuga para atingir um volume final de 30 ml, e desalojar sedimento congelado em vortex e agitação rigorosa. Coloque pellet no gelo.
      3. Lavar sonda de ultra-sons com etanol a 70% a 100% da amplitude de 1-2 min. Em seguida, repita com água ultrapura.
      4. Sonicar sedimentar as bactérias enquanto em gelo durante 5 min (tempo total de 10 min).
        1. Definir sonicador em 30% da amplitude com pulso de 30 seg on/30 seg off.
        2. Bob tubo de centrífuga para cima e para baixo durante o intervalo de ultra-sons, a fim de romper completamente o sedimento celular. No final do tempo total transcorrido deve haver nenhuma bactéria visíveis sedimentar deixando um fibroso lama viscosa.
        3. Limpar a sonda de ultra-sons entre os diferentes isolamentos de proteínas, assim como para armazenamento, utilizando etanol a 70% e água pura como descrito no passo 6.1.2.3.
      5. Centrifugar a suspensão a 20.500 xg, a 4 ° C durante 30 min. Transferir o sobrenadante para um tubo novo para o isolamento e descarte do sedimento.
  2. A cromatografia de afinidade de Ni-NTA
    1. Não nativos
      1. Adicionar 1 ml de Ni 2 +-NTA de solução de resina de cada tubo de ensaio (2 ml no total de resina para uma cultura de 1,8 L) e incubar a temperatura ambiente durante pelo menos 1 hora em nutator.
      2. Despeje suspensão na coluna de afinidade e permitir solução para escorrer através da válvula torneira completamente em copo de resíduos.
      3. Realize 10 lavagens com 10 ml de lise / tampão de lavagem para cada lavagem.
        1. Para as primeiras duas lavagens, adicionar 10 ml de o tubo de centrifugação para remover a resina adicional e, em seguida, verter em coluna. As lavagens adicionais podem ser adicionados directamente à coluna.
        2. Depois de cada lavagem, agita-se a resina com uma vareta de agitação de vidro. Uma vez que a lavagem de pinga dentro do copo de resíduos, podem ser adicionados nos próximos 10 ml.
      4. Depois de lavar completamente drips através, válvula torneira perto, retire copo de resíduos e substituir com 50 ml tubo de centrífuga para a coleta de proteína.
      5. Adicionar 15 ml de tampão de eluição (Tabela 1) e agitar-se resina, permitindo solução para sentar-se por 5 min. Válvula torneira aberta e eluição a cobrar. Repita novamente com um adicional de 15 ml.
    2. Nativo
      1. Siga a cromatografia de afinidade não nativos acima (Passos 6.2.1.1-6.2.1.4), exceto ajustar os seguintes parâmetros:
        1. Incubar Ni 2 + solução de resina-NTA, a 4 ° C durante pelo menos 1 hora em nutator.
        2. Use o tampão de lavagem apropriado (Tabela 1).
      2. Adicionar 5 ml de tampão de eluição (Quadro 1) e incuba-se com a resina, durante 5 min.
        1. Válvula de torneira aberta e recolher eluição até que a maioria da solução foi gotejada através de.
        2. Adicionar 90 ul / poço de reagente de Bradford para limpar placa de 96 poços. Depois de cada eluição permitem 10 ul de modolução a pingar a partir da coluna em poços contendo 90 ul de reagente de Bradford.
        3. Continue adicionando 5 ml tampão de eluição de cada vez até ensaio de Bradford já não detecta proteína (cor vai do azul escuro para azul claro para limpar). Isso normalmente leva 4-5 volumes de eluição.
  3. Diálise / Renaturação
    1. Faça nonnative (renaturalização) e buffers de diálise nativas (Tabela 1) e armazenar em 4 ° C.
      Nota: O pH dos tampões de diálise são determinadas pelo ponto isoeléctrico da proteína alvo (pi). Como uma regra de polegar proteínas devem ser tamponadas, pelo menos, um ponto imediatamente acima ou abaixo dos valores de pi.
    2. Transferir eluições nativas e não-nativas para tubos de diálise com corte de peso molecular apropriado (25.000 MWCO para NGF e 50.000 MWCO para SEMA3A). Colocar cada amostra de proteína no respectivo tampão de diálise 1, durante 4 horas a 4 ° C e, em seguida, substituir com o respectivo tampão 2 ao longonoite a 4 ° C.
      Nota: A proteína tem de ser dialisada em cada tampão durante pelo menos 4 horas, para a re-enrolamento correcto e troca de tampão para ter lugar.
    3. Concentrar as eluições de proteína dialisada a menos de 5 ml, utilizando concentradores de rotação centrífuga.
      Nota: As proteínas podem ser ainda purificado por cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) e concentrou-se novamente.
  4. Determinar a concentração de proteína (mg / ml) por liofilização de uma amostra de 10-50 ml num tubo de microcentrífuga de pré-pesado.
    1. Opcional: determinar o coeficiente de extinção, ε, de modo que a concentração de proteína pode ser determinada em isolamentos futuros medindo a absorvância de uma amostra a 280 nm, utilizando a Lei de Beer-Lambert: c = A 280nm / εl, onde L é o comprimento do percurso.

7. Biotinilação de proteína purificada

  1. Dializar proteínas em 10.000 MWCO cassetes de diálise against 10 mM Tris (pH = 8,0), alterando o tampão a cada 4 horas, com um total de 6 alterações.
  2. Transferir as proteínas recombinantes (agora em tampão Tris 10 mM) a 2 ml de tubos de micro-centrífuga para biotinilação.
  3. Biotinilar proteínas utilizando um kit de biotina ligase de proteína.
  4. Dializar contra proteínas de PBS (pH = 7,4) utilizando 10.000 MWCO cassetes de diálise com três mudanças de tampão por dia, durante 2 dias.
  5. Determinar a percentagem de biotinilação de proteínas, utilizando um kit de quantificação.
  6. Determinar a concentração de novo, como descrito em 6.4 e armazenar a 4 ° C ou alíquota e armazenar a -20 ° C para armazenamento a longo prazo.

Resultados

Clonagem e Expressão de teste

Quando chapeamento é realizado corretamente, único colônias isoladas devem formar a aumentar as chances de arrancar bactérias clonal transformaram células (Figura 2A). No entanto, se demasiadas células são plaqueadas, as placas são incubadas por muito tempo, a 37 ° C ou a transformação é questionável, as colónias podem cobrir a placa de ágar ou de formar agregados maiores de células (Figuras 2B

Discussão

Engenharia de proteínas recombinantes é uma técnica muito poderosa que se estende por muitas disciplinas. É rentável, sintonizável e um procedimento relativamente simples, permitindo a produção de altos rendimentos de proteínas personalizados. É importante notar que a concepção e expressão de proteínas-alvo nem sempre é directa. Expressão basal e estabilidade da proteína recombinante depender de escolhas específicas de vetoriais, E. estirpes de E. coli, células de adições marca pep...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Universidade de Akron para o financiamento que apoiaram este trabalho.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5%Chem-Impex International127100 g
2-Hydroxyethylmercaptan β-MercaptoethanolChem-Impex International642250 ml
Acetic acid, glacialEMDAX0073-92.5 L
AgarBioshopAGR001.500500 g
Ampicillin sodium salt Sigma-AldrichA951825 g
Antifoam 204Sigma-AldrichA6426500 g
Barstar-NGF pET-21a(+)GenScript USA Inc.4 µg
BL21(DE3) Competent CellsNovagen694501 ml; Expression Host
Bradford reagentSigma-AldrichB6916500 ml
BugBusterNovagen70922-3100 ml
Gel filtration standardBio-Rad151-19016 vials
GlycerolBioshopGLY001.11 L
Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochlorideChem-Impex International1521 kg
His-Pur Ni-NTA ResinThermo Scientific88222100 ml
Hydrochloric acidEMDHX0603-32.5 L
Imidazole Chem-Impex International418250 g
IPTGChem-Impex International194100 g
Laemmli sample bufferBio-Rad161-073730 ml
Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surfaceChem-Impex International270500 g
LB Broth  Sigma-AldrichL30221 kg
NovaBlue Competent CellsNovagen698251 ml; Cloning Host
Phosphate buffered salineSigma-AldrichP5368-10PAK10 pack
Potassium ChlorideChem-Impex International012471 kg
Sema3A-pET-21a(+)GenScript USA Inc.4 µg
SimplyBlue SafeStainInvitrogenLC60601 L
Sodium chlorideSigma-AldrichS5886-1KG1 kg
Sodium hydroxideFisher ScientificS318-500500 g
Sodium phosphate diabasicSigma-AldrichS5136-500G500 g
Sodium phosphate monobasicSigma-AldrichS5011500 g
Terrific BrothBioshopTER409.55 kg
Tetracycline hydrochlorideChem-Impex International66725 g
Tris/Glycine/SDS Buffer, 10xBio-Rad16107321 L
Trizma BaseSigma-AldrichT15031 kg
Tryptone, pancreaticEMD1.07213.10001 kg
Yeast extract, granulatedEMD1.03753.0500500 g
 ÄKTApurifier10GE Healthcare28-4062-64Includes kits and accessories
Benchtop Orbital ShakerThermo ScientificSHKE4000MAXQ 4000
BirA500AvidityBirA500Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution
Dialysis CasetteThermo Scientific66380Slide-A-Lyzer (Extra Strength)
Dialysis TubingSpectrum Laboratories132127, 132129MWCO: 25,000 and 50,000
Flow Diversion Valve FV-923GE Healthcare11-0011-70
FluoReporter Biotin Quantification Assay KitInvitrogen1094598
Frac-950 Tube Racks, Rack CGE Healthcare18-6083-13
Fraction Collector Frac-950GE Healthcare18-6083-00Includes kits and accessories
Heated/Refrigerated Circulator VWR13271-102Model 1156D
Heating Oven FD SeriesBinderModel FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pgGE Healthcare17-1069-01Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI Avanti CentrifugeBeckman Coulter393126
JA 25.50 RotorBeckman Coulter363055
JLA 8.1 RotorBeckman Coulter969329Includes 1 L polyporpylene bottles
JS 5.3 RotorBeckman Coulter368690
Laminar Flow HoodThemo Scientific1849Forma 1800 Series Clean Bench
Microplate ReaderTECANinfinite M200
Mini-PROTEAN Tetra CellBio-Rad165-80044-gel vertical electrophoresis system
Mini-PROTEAN TGX Precast GelsBio-Rad456-9036Any kDa, 15-well comb
Ni-NTA ColumnBio-Rad737-251249 ml volume ECONO-Column
Plasmid Miniprep KitOmega Bio-TekD6943-01
PowerPac HC Power SupplyBio-Rad164-5052250 V, 3 A, 300 W
Round Bottom Polypropylene Copolymer TubesVWR3119-005050 ml tubes for JA 25.50 rotor
Spin-X UF ConcentratorsCorning431488, 431483 20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da
Subcloning ServiceGenScript USA Inc.Protein Services
Ultrasonic Processor Cole-Parmer18910445AModel CV18
Vortex-Genie 2Scientific IndustriesSI-0236Model G560

Referências

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