신경 조직의 재생을위한 가용성 및 불용성 바이오틴 단백질의 발현, 분리 및 정제

요약

biotinylatable 융합 단백질을 개발하는 연구의 다양한 분야에서 많은 잠재적 인 응용 프로그램이 있습니다. 재조합 단백질 공학은 맞춤 설계된 단백질의 높은 수율을 제공하는 비용 효율적인 정직 절차입니다.

초록

재조합 단백질 공학은 대장균에게 (대장균) 식으로 거의 4 수십 년 동안 시스템, 오늘을 활용했다 E. 대장균은 여전히 가장 널리 사용되는 숙주이다. 시스템의 유연성은 (스트렙 트 아비딘 상호 작용을위한) 비오틴 태그와 같은 잔기 및 녹색 형광 단백질 또는 체리 적색 단백질과 같은보다 큰 단백질의 기능성 또한 허용한다. 또한, 번역 후 변형을 부여하는 금속 이온의 킬레이트 고유 반응성 작용기, 분광 프로브, 분자와 같은 부 자연스러운 아미노산의 통합은 단백질의 특성과 기능을 더 잘 조작을 가능하게했다. 따라서이 기술은 연구의 다양한 분야에 대한 중요한 유틸리티를 제공하는 사용자 정의 융합 단백질을 생성합니다. 보다 구체적으로, biotinylatable 단백질 서열 때문에 아비딘 및 스트렙 타비 딘과 비오틴 사이의 높은 친 화성 상호 작용의 다양한 표적 단백질에 통합 된. 이 추가 태그 단백질의 검출 및 정제를 강화뿐만 아니라 세포의 정렬과 같은 보조 응용 프로그램을위한 길을 열어 주었있다. 따라서, 비오틴 표지 분자는 바이오 산업 및 생명 의학 분야에서 증가하고 광범위한 영향을 보여줍니다. 우리의 연구의 목적을 위해 우리는 신경 성장 인자 (NGF) 및 semaphorin3A (Sema3A) 기능 영역을 포함하는 비 오티 닐화 재조합 융합 단백질을 설계했다. 우리는 이러한 비오틴 융합 단백질은 다른 활성 단백질 서열과 함께, 조직 공학 및 재생을 위해 생체 적합 물질에 닿는 할 수있는 방법을 이전에보고했다. 이 프로토콜은 T7의 락의 유도 성 벡터와 E를 활용하여, 밀리그램 규모 엔지니어링 biotinylatable 단백질의 기본 사항을 설명합니다 변환하는 스케일 업 (scale-up) 및 정화부터 대장균 발현 호스트.

서문

단백질은 궁극적으로 적절한 조직 형성과 조직에 이르는 많은 생물학적 기능에 대한 책임은 생체 분자의 넓은 범위를 커버. 이 분자는 인체 내에서 평형을 유지, 규제 업 및 / 또는 아래로 조절 유전자와 다른 단백질의 제어 신호 전달 경로의 수천을 시작합니다. 하나의 단백질의 중단은 치명적인 장애 또는 질병의 발병으로 이어질 수있는 신호의이 웹 전체에 영향을 미칩니다. 실험실에서 각각의 단백질을 설계하는 것은 이러한 부작용을 퇴치하기위한 하나의 솔루션을 제공하고 작은 분자 약물에 대한 대안을 제공합니다. 1977 년 14 아미노산 소마토스타틴 서열을 코딩하는 유전자가 E.을 사용하여 만든 제 설계 폴리펩티드 중 하나였다 대장균 ^1. 곧 1979 년, 인슐린, 플라스미드 나 pBR322에 복제 변형, 표현, ² 정제 하였다. 그 이후로, 재조합 단백질은 입술의 여러 필드에 자신의 영향력을 확대earch 등 생체 적합 물질, 약물 전달, 조직 공학, 바이오 의약품, 농업, 산업 효소, 바이오 연료 등 (리뷰를 참조에게 ^3-8 참조). 이 기술을 포함한 목적 주문형 화학 잔기 또는 단백질 서열의 첨가를 통해 제공하고 있지만, 표적 단백질 식별, 안정화 및 정제에 한정하지 않는 것이 범용성 크게 때문이다.

재조합 DNA 기술을 통해, 재조합 단백질은 포유 동물, 식물, 곤충, 효모, 균류 또는 박테리아 등의 진핵 및 원핵 숙주 다양한 시스템에서 발현 될 수있다. 각 호스트는 서로 다른 장점을 제공하며, 일반적으로 가장 좋은 시스템은 단백질 기능, 수율, 안정성, 전반적인 비용 및 확장 성을 기준으로 결정됩니다. 박테리아 세포는 종종 진핵 호스트 (즉, 당화, 디설파이드 브리지, E에게 제공하는 번역 후 변형 메커니즘을 결여 TC.) ^5. 그러나 이러한 호스트는 일반적으로 더 많은 비용과 시간이 많이 ^구를 수 있으며 결과적으로, 포유 동물 및 곤충 시스템은 보통 진핵 단백질의 더 나은 호환성 및 식 초래한다. 따라서, E. 세포가 저렴 성장 조건에서 급속하게 확장하고 유전자 발현 메커니즘이 잘 ^{5,9 이해하고} 있기 때문에 대장균은 우리의 발현 시스템에 대한 선호 호스트입니다. 또한,이 시스템은 번역 후 변형 ^(10)의 부족에도 불구하고 생산의 목적과 기능 단백질의 결과에 대한 최대 크기를 조절하기 쉽다. E. 이 변형이 높은 변환 효율에 따라 우수한 플라스미드 수율을 제공하기 때문에 대장균 K12 균주 복제에 대해이 프로토콜에서 선택된다. 또한, E. 이 호스트의 변형을 제어 단백질 발현과 안정성 ^11를 제공하는 T7의 RNA 중합 효소 유전자를 포함하고 있기 때문에 대장균 BL21 균주 발현에 이용된다.

십t "> 호스트를 선택하면, 추가 치료는 재조합 단백질을 합성하는 박테리오파지 T7의 전사 및 번역 신호의 지시에 따라 복제 된 대상의 DNA 시퀀스를 시작합니다. 선택 및 조절 단백질 발현을 촉진하는 최적의 발현 벡터를 선택하는 촬영되어야합니다 식 T7의 RNA 중합 효소 유전자 ¹² 염색체 사본을 포함하는 숙주 세포에서 유도된다. 플라스미드 벡터 인 pBR322에서 파생 된이 벡터는 (검토를 위해 참조 ¹³ 참조), 단단히 처음 Studier 및 동료 ^(14)에 의해 개발 된 T7 프로모터에 의해 제어 및 추가를 제공하고 있습니다 락 오퍼레이터와의 lac 리프레 서 (lac1)의 포함을 통해 제어 ^15,16. 재조합 단백질 공학의 경우,이 발현 계는 상이한 타겟 DNA 서열을 삽입하여 목적 단백질의 특정 아미노산 서열을 짓기 위해 또는 융합 단백질을 생성하는 기능을 구비 결합 도메인으로 구성하나의 단백질에서의. 또한, 일부 벡터 시리즈는 N 또는 C 말단에 배치되는 펩타이드 태그 수정이 (가) 있습니다. 우리의 설계 목적을 위해, 히스티딘 (그의) 태그는 정제 DNA 표적 서열에 첨가하고, 15의 아미노산 서열은 바이오 티 닐화 biotinylatable ^17,18 위해 포함되었다. 이 프로토콜에서 암피실린 내성 유전자를 포함하는 플라스미드를, 우리 biotinylatable 융합 단백질 서열을 운반하도록 선택되었다. 표정은 T7의 lac 프로모터를 통해이 벡터 제어되어 쉽게 이소 프로필 β-D-1-티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)로 유도된다.

시험 식 (소량 배양) 정제 과정을 공식화하거나 수용성 또는 불용성 인 형태로 표현 될 수있는 표적 단백질의 존재 및 용해도를 결정하기 위해 사용된다. 박테리아 세포 내에서 발현 수용성 단백질의 기본 구조 ^(19)를 유지하기 위해 자연 폴딩을 받게 될 것이다. 일반적으로 기본구조는 열역학적으로 바람직하다. 많은 경우에 숙주의 대사 활동은 불용성 단백질 생산 및 불용성 단백질 응집체 이루어지는 봉입체의 형성에 이르게 시스템에 응력을 배치, 표적 단백질에 공헌하지 않다. 따라서 표적 단백질은 일반적으로 ²⁰ 생물학적 비활성들을 렌더링 변성. 두 시험 식은 업 스케일링하고, 분리 과정은 표적 단백질의 용해도에 의해 결정된다. 추가 탈 변성 또는 단계 폴딩은 불용성 단백질이 필요합니다. 얻어진 재조합 단백질을 더욱 크기 배제 크로마토 그래피를 이용하여 정제 할 수있다.

집에서 재조합 단백질 생산을 목적 단백질의 밀리그램의 주요 문화 리터당 고립 될 수 있기 때문에 상용 제품을 통해 비용 이점을 제공합니다. 필요한 장비의 대부분은 일반적인 생물 또는 화학 실험실에서 사용할 수 있습니다. 단백질 공학은 생성 가능항상 상업적으로 사용할 수없는 추가 기능과 사용자 지정 융합 단백질. 1 공학 재조합 단백질과 관련된 주요 절차를 묘사 그림. 이 식 시스템을 통해 우리는 인터페론 - 감마, 혈소판 유래 성장 인자 및 뼈 형태 형성 단백질 ^{21 ~ 23} 많은 biotinylatable 단백질을 생성했다, 그러나 우리는 우리가 축삭지도, NGF (29 kDa의를 위해 디자인이 단백질에 초점을 맞출 것이다 ) 및 Sema3A (91 kDa의) ¹⁰ (검토) ^24을 참조를 참조하십시오. 바이오 티 닐화 식별, 고정 및 잘 알려진 비오틴 - 스트렙 타비 딘의 상호 ^작용을 이용하여 ^{25 ~ 27라는} 단백질의 분리에 대한 일반적인 기술입니다. 생물 물리학 프로브 ^{(28, 29)은 30} 바이오 센서, 양자 도트 ^(31)는 10 ^-15 M ^(27)의 순서에 K _d의 비오틴 - 스트렙 타비 딘 활용의 높은 선호도를 활용 시스템의 몇 가지 예입니다. E. 대장균 바이오주석 리가, 피라는, 비오틴에서 발견 라이신 사이드 체인에 비오틴의 공유 결합에 에이즈 순서 ^{18,32 태그.} 재료 및 생체 분자에 테 더링 비오틴은 여러 조직 공학 응용 프로그램 ^21,33-35에 대한 세포에 성장 인자의 지속적인 전달을 생산하고있다. 따라서 이러한 맞춤 설계 biotinylatable 단백질을 설계하는 것은 여러 연구 분야를 초월 할 수있는 강력한 도구입니다.

프로토콜

1. 대상 단백질의 설계

1. 생명 공학 정보를 웹 사이트에 대한 국립 센터를 사용하면 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 계정으로 관심 및 스플 라이스 변종의 종류를 복용 표적 단백질에 대한 아미노산 서열을 얻을 수 있습니다. 또한 단백질의 활성 영역에 해당하는 아미노산 서열을 선택한다.
   참고 : Sema3A를 들어, 아미노산 21-747가 선택되었다. 융합 단백질 barstar, 아미노산 1-90의 서열, NGF 아미노산 122-241에 첨가 NGF로 설계 하였다.
2. N-말단은 다음 시퀀스에 추가하려면 : 정화 6X - 그의 태그 (HHHHHH), 담배 식각 바이러스 그의 태그의 제거 (TEV) 단백 분해 효소 절단 사이트 (ENLYFQG을), 비오틴은 K (GLNDIFEAQKIEWHE)에서 단백질의 바이오 티 닐화에 대한 일련의 태그 적절한 단백질 접힘 (EFPKPSTPPGSSGGAP)를위한 공간을 허용 할 틈 유연한 힌지.
   참고 :이 시퀀스는 원하는 융합 제자에 따라 달라질 수 있습니다EIN.
3. 원하는 호스트 종과 합성 유전자 설계 / 최적화를 위해 회사 전체 아미노산 서열을 보냅니다. 키트를 사용하여 효소 BamHI-NotI을 사이트를 선택하여 벡터에 또는 상용 서비스를 이용하여 서브 클론.

2. 한천 플레이트를 만들기

참고 : 등 항생제, 접시, 버퍼의 모든 주식은 (온도 및 시간)가 제대로 저장되는 것이 매우 중요하다 (살균) 단백질 분해 효소의 무료 남아있다.

1. 유리 미디어 병에 20g / L 및 장소에서 1.5 중량 % 및 lysogeny 국물 (LB)에서 한천을 달다. 500 ㎖ 병은 약 15 판을 만든다.
2. 용적 측정, 초순수 물을 잘 혼합하고, 오토 클레이브.
3. 터치에 병이 식도록하고 적절한 항생제를 추가합니다. 병이 너무 냉각 및 솔루션이 응고하기 시작하면 그러나, 전자 레인지에 데워, 한천의 조기 응고를 피하십시오.
   주 : 우리의 플라스미드는 암피실린 저항 세대를 포함전자. 따라서 모든 단계는 100 ㎍ / ml로 암피실린을 포함해야합니다. E. 대장균 복제 K12 균주는 테트라 사이클린 (12.5 ㎍ / ml)에 항생제가 필요합니다. BL21 박테리아 세포는 추가 항생 물질을 필요로하지 않는다.
4. 90mm 배양 접시에 용액을 25 ~ 30 ㎖를 붓고 건조 시간이 필요합니다.
5. 적절한 항생제와 파라 필름 4 ° C, 또는 다시 봉합 할 수있는 봉투에 보관 거꾸로와 라벨 요리.
   주 : 플레이트는 약 1 개월에 좋다.

3. 비오틴 태그가 플라스미드의 클로닝

참고 : 조건이 무균 적으로 수행됩니다.

1. 펠렛하기 위해 3 분 6,000 XG에서 플라스미드 벡터를 스핀 다운, 살균 초순수의 10 μl를 추가합니다.
2. 화학적으로 유능한 E.의 50 μl를 제거 -80 ° C에서 즉시 대장균 높은 변환 효율 세포는 5 ~ 10 분 동안 얼음에 배치합니다.
3. 0.5 ng/50에서 벡터 솔루션 1 μl를 추가56, 50 μL E.에 L 세포 콜라이 세포와 C. -80 °에서 잔존 플라스미드를 배치
4. 5 분 동안 얼음에 벡터를 포함하는 박테리아 세포를 놓습니다.
5. 열 충격 다시 2 분 동안 얼음에 42 ° C의 물을 욕조 및 장소 세포의 30 ~ 45 초 동안 세포와 벡터 혼합물.
6. 이화 탄압 (SOC) 배지 (2 % V의 효모 추출물 / W, 0.5 % W / V 박토 효모 추출물, 8.56 mM의 염화나트륨, 2.5 밀리미터의 KCl, 20 mM의 _망초, 20 mM의 포도당 슈퍼 최적의 국물 250 μl를 추가합니다 , 초순수, 산도 = 7.0) 및 30 분 동안 37 ° C에서 250 rpm으로 흔들.
   참고 : SOC가 멸균하지 않아야하지만, 필터는 0.22 μm의 필터를 통해 살균 될 수있다.
7. 건판 이전에 세포를 도금에 10-15 분.
8. 피펫 25, 50 및 암피실린 (100 ㎍ / ㎖) 및 테트라 사이클린 (12.5 ㎍ / ㎖)을 함유하는 항생제 별도 한​​천 플레이트 상 세포 용액 100 μL. 한천 플레이트에 균일하게 솔루션을 배포하는 유리 구슬을 사용합니다.
<리> 15 ~ 18 시간 동안 37 ° C에서 접시에게 거꾸로 품어.
9. 접시에 작은 개별 박테리아의 식민지를 확인하고 추가 사용 (그림 2A)까지 4 ° C에서 거꾸로 저장합니다.
   1. 더 콜로니가 존재하지 않는 경우 :
      1. 버퍼와 공급의 신선함과 불임을 확인합니다.
      2. E. 추가 플라스미드의 양을 증가 대장균 K12 균주.
   2. 큰 식민지가 존재 또는 식민지 (그림 2B 및 2C)의 전면에 자라 난이있는 경우, 낮은 볼륨에서 멸균 접종 루프 또는 플레이트의 세포를 사용하여 새로운 한천 플레이트를 restreak.
10. 접종 5 ㎖ 변형 E.의 단일 콜로니로 암피실린 (100 ㎍ / ㎖) 및 테트라 사이클린 (12.5 ㎍ / ㎖) 항균제를 함유하는 LB 대장균 세포. 성장 - 업 셀 하룻밤 250 ~ 300 rpm에서 37 ° C에서.
11. 다음날, 밤새 GRO로부터 타겟 벡터를 분리하기 위하여, 플라스미드 아이솔레이션 키트를 사용W 업 더 사용할 때까지 -80 ° C에서 저장할 정제 플라스미드.
    1. 선택 사항 : 260, 280 nm에서 얻은 흡광도 수치를 사용하여 플라스미드의 순도와 농도를 확인합니다.

4. 식 호스트에 플라스미드의 변환

참고 : 조건이 무균 적으로 수행됩니다.

1. 반복 E. 위해 3.2-3.10 단계 다음과 같은 변경 사항과 대장균 BL21 세포 :
   참고 : BL21 세포 따라서 만 암피실린 변환을위한 한천 플레이트에 추가, 추가 항생제가 필요하지 않습니다.
   1. 50 μL E.에 단계 3.12에서 0.5 ng/50 ㎕의 세포에 고립 된 플라스미드의 2-5 μl를 추가 대장균 발현 숙주 세포.
   2. 60 ~ 90 초 동안 열 충격 세포.
   3. 60 분 대신 30 분 동안 250 rpm에서 솔루션을 포함하는 SOC 매체를 흔들어.
2. 아이돌 마스터와 페트리 접시에서 변형 박테리아 세포의 단일 식민지를 뽑아일 주걱 스틱과 장소 암피실린의 적절한 농도 (100 ㎍ / mL)로 5 ㎖ LB 배양액을 포함하는 테스트 튜브.
3. 250 rpm으로 37 ° C에서 하룻밤 진탕에서 테스트 튜브를 놓습니다.
4. 다음날 아침, 밤새 성장까지 200 μL을 100 ㎍ / ml로 암피실린을 포함하는 5 ㎖의 LB에 추가합니다.
5. 750 μL의 문화 (멸균) 250 ㎕의 50 % 글리세롤 나머지 세포를 동결 -80 ° C에 보관
   참고 : 새로운 테스트 식 및 규모 확대 절차 냉동 세포의 스크 레이 핑을 얻기 위해 멸균 주걱 스틱을 사용하고 적절한 항생제로 LB를 접종하여 수행 할 수 있습니다.
6. 광학 밀도 (OD)를 600 ㎚의 흡광도에서 0.7 ~ 0.8 사이에서 측정 될 때까지 37 ° C에서 250 ~ 300 rpm에서 진탕 테스트 튜브를 놓습니다.
7. 최종 농도 1mM IPTG로 세포를 유도한다.
8. 300 rpm에서 37 ° C에서 추가로 4 시간 동안 흔들어. 또는 세포는 또한 수250 ~ 300 rpm으로 18 ° C에서 하룻밤 흔들릴 수. 이것은 표적 단백질에 따라 플라스미드의 높은 수율을 생산할 수있다.
9. 테스트 식의 나트륨 황산 도데 실 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE) 분석
   1. 1.5 ML 튜브에 문화와 장소 500 μl를 가져 가라. 5 분 동안 13 ~ 15 XG에 스핀 다운. 상층 액을 붓고 레이블 "가용성을." 로딩 염료 (50 μL 2 - 머 캅토 에탄올, 950 ㎕의 램리 샘플 버퍼)의 200 μL의 소용돌이로 교반과를 Resuspend 펠릿.
      참고 : 용해 박테리아 펠릿은 재조합 단백질은 박테리아 세포의 세포질 영역에 있는지 결정하기 위하여 사용될 것이다. 펠렛은 필요할 때까지 염료를로드하지 않고 -80 ° C에 저장 될 수있다. 변형 또는 유도되지 않은 제어 박테리아 문화 가용성뿐만 아니라 비교를 처리 할 수있다.
   2. 1.5 ML 튜브에 문화와 장소의 1,000 μL를 가져 가라. 5 분 동안 13 ~ 15 XG에 스핀 다운.상층 액을 붓고 레이블 "불용을."
      참고 : 불용성 펠렛 박테리아 세포의 봉입체에있는 단백질을 방출하기 위하여 아래 변성 절차를 거칠 것이다. 필요할 때까지 펠릿을 -80 ° C에 저장 될 수있다. 변형 또는 유도되지 않은 제어 박테리아 문화 불용성뿐만 아니라 비교를 처리 할 수있다.
      1. 200 μL Bugbuster에 불용성 펠렛을 재현 탁하고 실온에서 30 분 동안 남겨.
      2. 5 분 동안 13 ~ 15 XG에 다시 샘플을 스핀 다운 및 뜨는의 50 μl를 가지고 새로운 "불용"1.5 ML 튜브에 추가합니다.
      3. 그런 다음이 새로운 샘플을 로딩 염료의 50 μl를 추가합니다.
   3. SDS-PAGE 분석을위한 단백질을 변성 5 분 동안 모두 수용성과 불용성 샘플을 끓인다.
   4. 표준 사다리와 전기 영동 젤에 각각의 샘플을로드합니다.
   5. 시각화하기 위해 단백질 시료는 stainin를 사용G 시약 회사의 프로토콜을 따르십시오.
   6. 단백질은 SDS-PAGE 겔 (그림에서 (참고 4.9.1과 4.9.2)이 두 차선을 비교뿐만 아니라 수용성과 불용성 제어 차선으로 차선을 비교하여 가용성 및 / 또는 불용의 표현 여부를 결정 2). 어두운 밴드는 가용성 또는 불용성 차선에있는 단백질의 분자량 주위에 나타납니다. 이것은 어떤 분리 절차는 프로토콜 6에서 사용하는 결정합니다.
      참고 : 밴드 분리 방법은 재조합 단백질의 높은 수율 (도 3)를 생성하는 결정하기 위해 프로토콜 6에서 사용한 절연 아래 수행 될 수 있거나, 단백질이 두 가지를 단리 할 수있다 하나보다 이들 영역의 양쪽에있는 경우에 .
   7. 4 시간 밤새 유도가 실시 된 경우, 스케일 - 업 (scale-up)의 가장 높은 단백질 생산 (그림 2)가 유도하는 방법을 결정합니다.

5. 스케일 업 절차 및 주요 문화

1. 좋아요 국물의 85.7 g, 1.8 초순수의 L과 1 시간 동안 액체 사이클에 오토 클레이브의 50 % 글리세롤의 28.8 ㎖로 성장 미디어를 준비합니다.
2. 4.5 단계에서 만든 냉동 세포 주식에서 하룻밤 문화를 시작합니다.
   참고 : 조건이 무균 적으로 수행됩니다.
   1. 멸균 된 125 ㎖의 삼각 플라스크에 100 ㎍ / ml로 20 LB의 ML 암피실린의 최종 농도로 혼합.
   2. 멸균 주걱 스틱을 사용하면 변형 E.의 폐차을 대장균 세포와 플라스크에 드롭 도포. 거품 스토퍼면에 도포 스틱 및 플러그 플라스크를 제거하고 불임을 유지하기 위해 알루미늄 호일로 커버합니다.
   3. 37 ℃에서 250 rpm으로 밤새 흔들어
3. 주 문화
   참고 : 조건이 무균 적으로 수행됩니다.
   1. 멸균 성장 매체의 1.8 L에 하룻밤 문화를 붓고 10에서 암피실린을 추가0 ㎍ / ㎖의 파스퇴르 피펫을 사용하여 멸균 소포제 (204)의 6 ~ 8 방울.
   2. 폭기 돌을 통해 문화에 압축 공기 버블을 여과 0.2 mm와 37 ° C의 물을 욕조에 넣고 문화.
   3. 외경 _{600 ㎚가} 0.7 ~ 0.8에 도달하면, IPTG (1 ㎜)로 유도하고 유도 단계 4.9 SDS-PAGE에서 수용성 / 불용성 결과에 따라 18 ° C에서 37 ° C 또는 야간 4 시간 인해 발생할 수 있습니다.
4. E. 수집 대장균 세포
   1. 4 ℃에서 14,000 XG에 15 분 동안 1 L의 원심 분리기 병 (2 병 / 문화)에서 세포 배양을 스핀 다운
   2. 상청액을 따르고 얇은 주걱을 이용하여,이 박테리아는 50 ㎖ 튜브에 펠렛 국자. 세포는 몇 분 동안 원심 분리에 의해 다시 펠렛 화 될 수있다.
      참고 : 각 1.8 L의 문화는 두 가지 박테리아 펠렛, 각 50 ㎖의 원심 분리 관에 하나 발생합니다.
   3. 단백질 분리 될 때까지 -80 C에 보관 펠렛.

6. 분리 및 재조합 단백질의 정제

단백질이 단계 4.9 SDS-PAGE 분석을 기반으로 가용성 영역에있는 경우 다음 "기본 절연은"사용됩니다 만, 불용성 단백질 "비 고유 분리"절차를 수행합니다 : 참고.

1. 세포 용해
   1. 비 고유
      1. 제거 E.에게 전환 대장균 펠렛 -80 ° C 냉동고에서, 각각의 원심 분리 관에 20 ㎖ 용해 / 워시 버퍼 (표 1)를 추가합니다.
      2. 소용돌이하고 해동하고 큰 덩어리없이 완충 용액에 가용화 될 때까지 고정 된 펠렛을 흔들. 하룻밤 nutator에 품어. 다음날 아침, 펠릿 이제 버퍼로부터의 단백질 변성으로 인한 점성 슬러리이어야한다.
      3. 실온에서 30 분 동안 20,500 XG에 슬러리를 원심 분리기. 격리를위한 새로운 튜브에 뜨는을 전송하고 펠렛을 폐기합니다.
   2. 기본
      1. 확보 변형 E. -80 ° C 냉동고에서 대장균 펠렛.
      2. 30 ML의 최종 볼륨에 도달하기 위해 원심 분리 관에 용해 버퍼 (표 1)를 추가하고 텍싱 엄격 흔들어 냉동 펠렛을 제거. 얼음에 펠렛을 놓습니다.
      3. 1 ~ 2 분 동안 100 %의 진폭에서 70 % 에탄올로 초음파 분쇄기 프로브를 씻으십시오. 그 후 초순수로 반복합니다.
      4. 초음파 처리 세균은 5 분 (10 분의 총 경과 시간) 얼음에있는 동안 펠렛.
         1. 초 Off on/30 30 초 펄스로 30 % 진폭에서 초음파기를 설정합니다.
         2. 밥 원심 분리기 튜브까지 완전히 세포 펠렛을 분쇄하기 위해 초음파 간격 동안 다운. 총 경과 시간의 끝에서 눈에 보이는 박테리아가 힘줄, 점성 슬러리를 떠나 펠렛 없을 것.
         3. 다른 단백질 절연 부 사이의 초음파기 프로브를 청소뿐만 아니라 단계 6.1.2.3에 설명 된대로 70 % 에탄올 및 초순수를 사용하여 저장.
      5. 30 분 동안 4 ° C에서 20,500 XG에 슬러리를 원심 분리기. 격리를위한 새로운 튜브에 뜨는을 전송하고 펠렛을 폐기합니다.
2. 니켈 - NTA 친 화성 크로마토 그래피
   1. 비 고유
      1. 추가 1 ㎖의 Ni ^{2 +-NTA} 각 원심 분리 관 (1.8 L의 문화에 대한 2 ㎖ 수지 전체)에 수지 용액 및 nutator에 적어도 1 시간 동안 실온에서 배양한다.
      2. 친 화성 컬럼에 슬러리를 붓고 솔루션 폐기물 비커에 완전히 코크 밸브를 통해 똑똑 떨어지는 것을 허용한다.
      3. 각 세척을위한 용해 / 워시 버퍼 10 ㎖로 10 세척을 수행합니다.
         1. 처음 두 세척의 경우, 추가로 수지를 제거한 다음 컬럼에 부어 원심 분리 관에 10 ㎖를 추가합니다. 추가적인 세척 컬럼에 직접 첨가 될 수있다.
         2. 각 세척 후, 유리 교반 막대를 가진 수지를 교반 하였다. 세척 폐기물 비이커에 적하되면, 다음 10 ㎖를 첨가 할 수있다.
      4. 후 완전히 박사를 씻어를 통해 인 IP 가까운 콕 밸브, 폐기물 비커를 제거하고 단백질 수집을위한 50 ㎖ 원심 분리 관으로 교체합니다.
      5. 용출 버퍼 (표 1) 15 mL를 넣고 저어 업 수지를, 용액을 5 분 동안 앉아있게. 오픈 스톱 콕 밸브 및 수집 용출. 추가로 15 ㎖로 다시 반복합니다.
   2. 원주민
      1. 다음 매개 변수를 조정을 제외하고 (단계 6.2.1.1-6.2.1.4) 위의 비 고유 친 화성 크로마토 그래피를 수행
         1. 니켈 ^2를 nutator에 적어도 1 시간 동안 4 ° C에서 ^+-NTA 수지 용액을 품어.
         2. 적절한 세척 버퍼 (표 1)를 사용합니다.
      2. 용출 버퍼 (표 1) 5 mL를 넣고 5 분 동안 수지를 품어.
         1. 오픈 스톱 콕 밸브 및 솔루션의 가장 때까지 용출를 수집 통해 떨어 뜨린.
         2. 96 - 웰 플레이트를 취소 90 μL / 잘 브래드 포드 시약을 추가합니다. 각 용출 허용 한 후 지금의 10 μL물론 90 μL 브래드 포드 시약을 포함에 열에서 똑똑 떨어지는 것을 lution.
         3. 브래드 분석이 더 이상 단백질 (색 취소 연한 파랑으로 어두운 파란색에서 진행) 감지 할 때까지 한 번에 5 ㎖의 용출 버퍼를 계속 추가합니다. 이것은 보통 4-5 용출 볼륨을합니다.
3. 투석 / 탈 변성
   1. 4 ° C에서 비 고유 (탈 변성) 및 기본 투석 버퍼 (표 1) 및 저장을
      참고 : 투석 버퍼의 pH는 목적 단백질의 등전점 (PI)에 의해 결정된다. 엄지 손가락 단백질의 규칙은 파이 값의 위 또는 아래에 적어도 하나의 전체 포인트를 버퍼링해야으로.
   2. 적절한 분획 분자량 (Sema3A에 대한 NGF 50,000 MWCO 25,000 MWCO)으로 투석 튜브에 네이티브 및 비 고유 용리를 전송합니다. 4 ° C에서 4 시간 동안 각각의 투석 버퍼 1에 각각의 단백질 샘플을 위치하게 한 후, 각각의 버퍼 2 이상으로 교체4 ° C. 밤
      참고 : 단백질이 적절한 접힘과 자리를 차지할 버퍼 교환을위한 최소 4 시간 동안 각 버퍼에 투석해야합니다.
   3. 원심 회전 농축기를 사용하여보다 5 ㎖에 투석 단백질 용리을 집중한다.
      주 : 단백질이 더 빠른 단백질 액체 크로마토 그래피 (FPLC)를 사용하여 정제하고 다시 농축 할 수있다.
4. 동결 preweighed microcentrifuge 관에 10 ~ 50 ㎖의 시료를 건조하여 단백질 농도 (㎎ / ㎖)을 결정합니다.
   1. 선택적 : C는 L은 경로 길이 인 _{280 ㎚} / εl을 = 흡광 계수를 결정하는, ε, 단백질의 농도가 맥주 램버트의 법칙을 이용하여 280 nm에서 샘플의 흡광도를 측정함으로써 향후 아이솔레이션에서 결정될 수있다.

7. 정제 된 단백질의 바이오 티 닐화

1. 10,000 MWCO 투석 카세트 AG에서 단백질을 Dialyze10 mM 트리스 ainst (산도 = 8.0), 6 변화의 총 버퍼마다 4 시간을 변경.
2. 바이오 티 닐화 2 ML 마이크로 원심 분리기 튜브에 (지금은 10 mM 트리스 버퍼) 재조합 단백질을 전송합니다.
3. 바이오틴 단백질 리가 제 키트를 사용 Biotinylate 단백질.
4. 3 버퍼 10,000 MWCO 투석 카세트를 사용하여 PBS (산도 = 7.4)에 대한 단백질을 Dialyze 2 일간 하루를 변경합니다.
5. 정량 키트를 사용하여 단백질의 %의 바이오 티 닐화를 결정합니다.
6. 4 ° C에서 또는 장기 저장을 위해 -20 ° C에서 나누어지는 및 저장에 6.4 및 저장에 설명 된대로 다시 농도를 결정합니다.

결과

복제 및 테스트 식

도금이 정상적으로 수행 될 때, 하나의 고립 된 콜로니를 형질 전환 박테리아 클론 세포 (도 2A)를 버릴 가능성을 증가시키기 위해 형성한다. 너무 많은 세포를 도금하는 경우에는, 플레이트는 37 ° C의 또는 변환에 너무 오래 배양 식민지는 한천 플레이트를 덮거나 세포의 큰 집계 (그림 2B 및 2C)를 형성...

토론

재조합 단백질 공학은 여러 분야에 걸쳐있는 매우 강력한 기술이다. 이것은 맞춤 설계 단백질의 높은 수율의 생산을 허용하고 경제적 동조하고 비교적 간단한 절차이다. 이는 설계 및 표적 단백질을 발현하는 것은 항상 간단 아니라는 것을주의하는 것이 중요하다. 기초 표현 및 재조합 단백질의 안정성은 벡터, E.의 특정 선택에 따라 달라집니다 대장균 세포주, 펩타이드 태그 추가 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5%	Chem-Impex International	127	100 g
2-Hydroxyethylmercaptan β-Mercaptoethanol	Chem-Impex International	642	250 ml
Acetic acid, glacial	EMD	AX0073-9	2.5 L
Agar	Bioshop	AGR001.500	500 g
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A9518	25 g
Antifoam 204	Sigma-Aldrich	A6426	500 g
Barstar-NGF pET-21a(+)	GenScript USA Inc.		4 µg
BL21(DE3) Competent Cells	Novagen	69450	1 ml; Expression Host
Bradford reagent	Sigma-Aldrich	B6916	500 ml
BugBuster	Novagen	70922-3	100 ml
Gel filtration standard	Bio-Rad	151-1901	6 vials
Glycerol	Bioshop	GLY001.1	1 L
Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride	Chem-Impex International	152	1 kg
His-Pur Ni-NTA Resin	Thermo Scientific	88222	100 ml
Hydrochloric acid	EMD	HX0603-3	2.5 L
Imidazole	Chem-Impex International	418	250 g
IPTG	Chem-Impex International	194	100 g
Laemmli sample buffer	Bio-Rad	161-0737	30 ml
Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface	Chem-Impex International	270	500 g
LB Broth	Sigma-Aldrich	L3022	1 kg
NovaBlue Competent Cells	Novagen	69825	1 ml; Cloning Host
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK	10 pack
Potassium Chloride	Chem-Impex International	01247	1 kg
Sema3A-pET-21a(+)	GenScript USA Inc.		4 µg
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	1 L
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886-1KG	1 kg
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S318-500	500 g
Sodium phosphate diabasic	Sigma-Aldrich	S5136-500G	500 g
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011	500 g
Terrific Broth	Bioshop	TER409.5	5 kg
Tetracycline hydrochloride	Chem-Impex International	667	25 g
Tris/Glycine/SDS Buffer, 10x	Bio-Rad	1610732	1 L
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503	1 kg
Tryptone, pancreatic	EMD	1.07213.1000	1 kg
Yeast extract, granulated	EMD	1.03753.0500	500 g
ÄKTApurifier10	GE Healthcare	28-4062-64	Includes kits and accessories
Benchtop Orbital Shaker	Thermo Scientific	SHKE4000	MAXQ 4000
BirA500	Avidity	BirA500	Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution
Dialysis Casette	Thermo Scientific	66380	Slide-A-Lyzer (Extra Strength)
Dialysis Tubing	Spectrum Laboratories	132127, 132129	MWCO: 25,000 and 50,000
Flow Diversion Valve FV-923	GE Healthcare	11-0011-70
FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit	Invitrogen	1094598
Frac-950 Tube Racks, Rack C	GE Healthcare	18-6083-13
Fraction Collector Frac-950	GE Healthcare	18-6083-00	Includes kits and accessories
Heated/Refrigerated Circulator	VWR	13271-102	Model 1156D
Heating Oven FD Series	Binder		Model FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pg	GE Healthcare	17-1069-01	Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI Avanti Centrifuge	Beckman Coulter	393126
JA 25.50 Rotor	Beckman Coulter	363055
JLA 8.1 Rotor	Beckman Coulter	969329	Includes 1 L polyporpylene bottles
JS 5.3 Rotor	Beckman Coulter	368690
Laminar Flow Hood	Themo Scientific	1849	Forma 1800 Series Clean Bench
Microplate Reader	TECAN		infinite M200
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	165-8004	4-gel vertical electrophoresis system
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels	Bio-Rad	456-9036	Any kDa, 15-well comb
Ni-NTA Column	Bio-Rad	737-2512	49 ml volume ECONO-Column
Plasmid Miniprep Kit	Omega Bio-Tek	D6943-01
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	164-5052	250 V, 3 A, 300 W
Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes	VWR	3119-0050	50 ml tubes for JA 25.50 rotor
Spin-X UF Concentrators	Corning	431488, 431483	20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da
Subcloning Service	GenScript USA Inc.		Protein Services
Ultrasonic Processor	Cole-Parmer	18910445A	Model CV18
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Model G560