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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Sviluppo di proteine ​​di fusione biotinylatable ha molte potenziali applicazioni in diversi campi di ricerca. Ingegneria proteina ricombinante è una procedura dritto in avanti che è costo-efficace, che fornisce alte rese di proteine ​​personalizzati.

Abstract

Ingegneria proteica ricombinante ha utilizzato Escherichia coli (E. coli) sistemi di espressione per quasi 4 decenni, e oggi E. coli è ancora dell'organismo ospite più utilizzato. La flessibilità del sistema consente l'aggiunta di frazioni come per esempio un tag biotina (per interazioni streptavidina) e proteine ​​funzionali più grandi come proteina fluorescente verde o ciliegio proteina rosso. Inoltre, l'integrazione di amminoacidi innaturali come chelanti di ioni metallici, gruppi funzionali reattivi univoco, sonde spettroscopiche, e molecole che impartiscono modificazioni post-traduzionali ha permesso una migliore manipolazione delle proprietà proteiche e funzionalità. Di conseguenza questa tecnica crea proteine ​​di fusione personalizzabili che offrono utilità significativa per vari campi di ricerca. Più specificamente, la sequenza proteica biotinylatable è stato incorporato in molte proteine ​​bersaglio a causa della elevata interazione affinità tra biotina con avidina e streptavidina. Questa aggiunta ha aiutato a migliorare la rilevazione e purificazione di proteine ​​nella categoria oltre ad aprire la strada ad applicazioni secondarie, come l'ordinamento delle cellule. Così, molecole di biotina marcata mostrano una crescente influenza e diffusa nei campi bioindustriale e biomedica. Ai fini della nostra ricerca abbiamo ingegnerizzato proteine ​​di fusione biotinilato ricombinanti contenenti il ​​fattore di crescita nervoso (NGF) e semaphorin3A (Sema3A) regioni funzionali. Abbiamo precedentemente riportato come queste proteine ​​di fusione biotinilato, insieme ad altre sequenze proteiche attive, possono essere legati a biomateriali per l'ingegneria tissutale e scopi rigenerativi. Questo protocollo delinea le basi delle proteine ​​ingegneria biotinylatable alla scala milligrammo, utilizzando un T7 lac inducibile vettoriale e E. padroni di espressione coli, a partire da trasformazione di scale-up e di purificazione.

Introduzione

Proteine ​​coprono una vasta gamma di biomolecole che sono responsabili di molte funzioni biologiche, portando in definitiva a formazione di tessuto corretto e organizzazione. Queste molecole iniziano migliaia di vie di segnalazione che controllano up-regulation e / o down-regolazione dei geni e delle altre proteine, mantenendo l'equilibrio all'interno del corpo umano. Rottura di una singola proteina colpisce tutta questa rete di segnali, che può portare alla comparsa di disturbi o malattie devastanti. Ingegneria singole proteine ​​in laboratorio offre una soluzione per la lotta contro questi effetti collaterali e offre un'alternativa ai farmaci a piccole molecole. Nel 1977, un gene che codifica la sequenza amminoacidica somatostatina 14 è stato uno dei primi polipeptidi ingegnerizzati creati utilizzando E. coli 1. Poco dopo, nel 1979, l'insulina è stato clonato in plasmide pBR322, trasformato, espresso e purificato 2. Da allora, proteine ​​ricombinanti hanno esteso la loro influenza per più campi di research come biomateriali, drug delivery, l'ingegneria dei tessuti, prodotti biofarmaceutici, agricoltura, enzimi industriali, biocarburanti, ecc (per una rassegna vedi riferimenti 3-8). Ciò è dovuto alla versatilità che la tecnica offre tramite l'aggiunta di applicazioni porzioni chimiche specifiche o sequenze proteiche per scopi che includono, ma non limitato a, l'identificazione delle proteine ​​bersaglio, stabilizzazione e purificazione.

Tramite la tecnologia del DNA ricombinante, proteine ​​ricombinanti possono essere espressi in una varietà di sistemi ospite eucariotiche e procariotiche inclusi mammiferi, insetti, piante, lieviti, funghi o batteri. Ogni host offre diversi vantaggi e tipicamente il miglior sistema è determinato sulla base della funzione della proteina, resa, stabilità, costi complessivi e scalabilità. Cellule dei batteri spesso mancano i meccanismi di modificazione post-traslazionale che ospita eucariotiche forniscono (ad esempio la glicosilazione, disolfuro di transizione, e tc.) 5. Di conseguenza, i sistemi di mammiferi e insetti solito risultato migliore compatibilità e l'espressione di proteine ​​eucariotiche, tuttavia questi host sono generalmente più costosi e 9 richiede tempo. Pertanto, E. coli è l'ospite privilegiato per il nostro sistema di espressione perché le cellule si espandono rapidamente in condizioni di crescita economici ed i meccanismi di espressione genetica sono ben compresi 5,9. Inoltre, questo sistema è facile da scalare, per scopi produttivi e dei risultati in proteine ​​funzionali nonostante la mancanza di modificazioni post-traslazionali 10. Il E. coli K12 è scelto in questo protocollo per la clonazione, perché questo ceppo offre ottimi rendimenti plasmide basato su alte efficienze di trasformazione. Inoltre, un E. coli BL21 è utilizzato per l'espressione perché questo ceppo ospite contiene il gene della polimerasi T7 RNA che fornisce l'espressione proteica controllata e stabilità 11.

tenda "> Dopo la selezione ospitante, inoltre bisogna fare attenzione nella scelta del vettore di espressione ideale per facilitare l'espressione della proteina selezionata e controllata. Sintetizzando proteine ​​ricombinanti inizia con una sequenza di DNA bersaglio che è clonato sotto la direzione del batteriofago T7 trascrizione e traduzione segnali, e espressione viene indotta in cellule ospiti contenenti copie cromosomiche del gene T7 RNA polimerasi 12. Questi vettori derivati ​​da pBR322 plasmide vettore (per una rassegna vedi riferimento 13), sono strettamente controllato dal promotore T7 sviluppato inizialmente da Studier e colleghi 14 e fornire ulteriori controllo attraverso l'inclusione dell'operatore lac e repressore lac (lac1) 15,16. Per ingegneria proteica ricombinante, questo sistema di espressione offre la possibilità di personalizzare una specifica sequenza amminoacidica di una proteina desiderata inserendo diverse sequenze di DNA bersaglio o per creare proteine ​​di fusione costituiti di dominio combinatos da singole proteine. Inoltre, alcune serie vettore comprendono peptide modifiche tag per essere immessi sul N o C terminus. Per i nostri scopi di progettazione, una istidina (His) tag è stato aggiunto alla sequenza bersaglio di DNA per la purificazione e una sequenza amminoacidica biotinylatable 15 è stato incluso per biotinylation 17,18. In questo protocollo un plasmide contenente un gene di resistenza all'ampicillina, è stato scelto per portare le sequenze di proteine ​​di fusione biotinylatable. Espressione è controllata in questo vettore tramite il T7 promotore lac ed è facilmente indotta con isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG).

Espressioni di prova (colture su piccola scala) vengono utilizzati per determinare la presenza e la solubilità della proteina bersaglio, che può essere espresso sia in una forma solubile o insolubile formulare procedure di purificazione. Una proteina solubile espressa all'interno della cellula batterica subirà pieghevole spontanea di mantenere la sua struttura nativa 19. Tipicamente il nativostruttura è termodinamicamente favorevole. In molti casi l'attività metabolica dell'ospite non è favorevole alla proteina bersaglio, ponendo sollecitazioni al sistema che porta alla produzione di proteine ​​insolubili e la formazione di corpi di inclusione composti di aggregati proteici insolubili. Così la proteina bersaglio denatura, rendendoli generalmente biologicamente inattivo 20. Entrambe le espressioni di prova sono scalati-up, e procedure di isolamento sono determinate dalla solubilità della proteina bersaglio. È necessaria una rinaturazione supplementare o ripiegamento passo per le proteine ​​insolubili. Le proteine ​​ricombinanti risultanti possono essere ulteriormente purificati mediante cromatografia ad esclusione dimensionale.

In casa produzione di proteine ​​ricombinanti offre vantaggi economici rispetto ai prodotti commerciali dal milligrammi di proteina bersaglio possono essere isolati per litro di coltura principale. La maggior parte delle attrezzature necessarie è disponibile in un tipico laboratorio biologico o chimico. Ingegneria proteica consente la creazionedi proteine ​​di fusione personalizzato con ulteriori funzionalità che non sempre sono disponibili in commercio. figura 1 illustra i principali procedure necessarie proteine ​​ricombinanti ingegneria. Con questo sistema di espressione abbiamo creato molte proteine ​​biotinylatable, come l'interferone-gamma, fattore di crescita derivato dalle piastrine, e la proteina morfogenetica dell'osso, 21-23, ma ci concentreremo su due proteine ​​che abbiamo progettato per la guida degli assoni, NGF (29 kDa ) e Sema3A (91 kDa) 10 (per una rassegna vedi riferimento 24). Biotinylation è una tecnica comune per l'identificazione, immobilizzazione e l'isolamento di proteine ​​marcate utilizzando il noto interazione biotina-streptavidina 25-27. Sonde biofisiche 28,29, biosensori 30 e 31 punti quantici sono alcuni esempi di sistemi che utilizzano l'alta affinità della biotina-streptavidina coniugazione con una K d dell'ordine di 10 -15 M 27. Il E. bio coliligasi stagno, Bira, aiuti nel legame covalente di biotina alla catena laterale di lisina trovati all'interno della biotina etichettato sequenza di 18,32. Tethering biotina ai materiali e biomolecole ha prodotto la consegna sostenuto di fattori di crescita per cellulare per molteplici applicazioni di ingegneria tissutale 21,33-35. Pertanto, ingegneria queste proteine ​​biotinylatable progettati su misura è un potente strumento che può trascendere molteplici interessi di ricerca.

Protocollo

1. Progettazione di proteina bersaglio

  1. Utilizzo del Centro Nazionale per il sito web Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ottenere una sequenza ammino per la proteina bersaglio, tenendo conto delle specie di interesse e le eventuali varianti di splicing. Selezionare la sequenza amminoacidica corrispondente alla zona attiva di interesse della proteina.
    Nota: Per Sema3A, aminoacidi 21-747 sono stati scelti. Una proteina di fusione è stato progettato con NGF in cui la sequenza di barstar, aminoacidi 1-90, è stato aggiunto al NGF aminoacidi 122-241.
  2. Per l'N-terminale aggiungono le sequenze seguenti: 6X-His tag per la purificazione (HHHHHH), Tobacco Etch Virus (TEV) Sito taglio della proteasi per la rimozione del suo tag (ENLYFQG), biotina etichettato sequenza biotinilazione di proteine ​​a K (GLNDIFEAQKIEWHE) e cerniera flessibile con le lacune che permettono sala per il corretto ripiegamento delle proteine ​​(EFPKPSTPPGSSGGAP).
    Nota: Queste sequenze possono variare a seconda delle prot fusione desiderataEin.
  3. Il testo completo sequenza aminoacidica di una società per gene progettazione / ottimizzazione per specie ospiti desiderati e sintesi. Subclone in un vettore di scelta utilizzare il sito BamHI-NotI utilizzando un kit o utilizzando servizi commerciali.

2. Fare piastre di agar

Nota: E 'molto importante che tutte le scorte di antibiotici, piatti, tamponi, ecc, sono memorizzati correttamente (temperatura e durata) e restano liberi di proteasi (sterilizzato).

  1. Pesare agar al 1,5% in peso e lisogenia brodo (LB) a 20 g / L e posto in una bottiglia di vetro dei media. Una bottiglia da 500 ml rende circa 15 piatti.
  2. Volumetricamente aggiungere acqua ultrapura, mescolare bene e autoclave.
  3. Lasciate bottiglia fredda al tatto e aggiungere gli antibiotici appropriati. Evitare la solidificazione prematura di agar, tuttavia, se la bottiglia si raffredda troppo e la soluzione comincia a congelare, riscaldare in forno a microonde.
    Nota: Il nostro plasmide contiene una resistenza ampicillina gene. Pertanto, tutti i passaggi devono contenere ampicillina a 100 mg / ml. Il E. coli ceppo K12 clonazione richiede tetraciclina (12,5 mcg / ml) antibiotico. Cellule di batteri BL21 non richiedono alcuna ulteriore antibiotico.
  4. Versare 25-30 ml di soluzione in 90 millimetri piastre di Petri e lasciare il tempo di asciugare.
  5. Piatto Etichetta con antibiotici appropriati e negozio a testa in giù in 4 ° C, con Parafilm o in un sacchetto richiudibile.
    Nota: Le piastre sono buoni per circa un mese.

3. Clonazione della biotina Tagged plasmidi

Nota: le condizioni sono fatti in modo asettico.

  1. Spin down vettore plasmidico a 6.000 xg per 3 minuti, al fine di pellet, e aggiungere 10 ml di acqua ultrapura sterile.
  2. Rimuovere 50 ml di chimica competente E. celle ad alta efficienza di trasformazione coli da -80 ° C ed immediatamente posto in ghiaccio per 5-10 min.
  3. Aggiungere 1 ml di soluzione di vettore a 0,5-1 ng/50Cellule l al 50 microlitri E.; 56 coli celle e collocare il plasmide restante -80 ° C.
  4. Collocare le cellule batteriche contenenti il ​​vettore in ghiaccio per 5 min.
  5. Shock termico della cellula e miscela vettoriale per 30-45 secondi a 42 ° C a bagnomaria e Consiglio cellule posteriori in ghiaccio per 2 min.
  6. Aggiungere 250 ml di brodo super-ottimali con catabolite repressione (SOC) medio (2% w / v bacto-tryptone, 0,5% w / v estratto bacto lievito, 8.56 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM MgSO 4, 20 mM glucosio , acqua ultrapura, pH = 7.0) e agitare a 250 rpm a 37 ° C per 30 min.
    Nota: SOC non deve essere sterilizzato in autoclave ma essere sterilizzato per filtrazione attraverso un filtro di 0,22 micron.
  7. Lastre secche 10-15 minuti prima di placcatura cellule.
  8. Pipettare 25, 50, e 100 ml di soluzione di cellule su piastre di agar separate contenenti ampicillina (100 ug / ml) e tetraciclina (12,5 mcg / ml) antibiotici. Utilizzare perle di vetro per distribuire la soluzione in modo uniforme su piastre di agar.
  9. Incubare le piastre a testa in giù a 37 ° C per 15-18 ore.
  10. Controllare accessibili alle piccole colonie di batteri su piastre e memorizzare capovolta a 4 ° C fino all'utilizzo (Figura 2A).
    1. Se non colonie sono presenti:
      1. Controllare la freschezza e la sterilità di buffer e forniture.
      2. Aumentare la quantità di plasmide inserito in E. coli K12.
    2. Se grandi colonie sono presenti o vi è una crescita eccessiva di colonie (Figura 2B e 2C), restreak una nuova piastra di agar con un'ansa sterile inoculazione o le celle a piastre a basso volume.
  11. Inoculare 5 ml LB contenente ampicillina (100 ug / ml) e tetraciclina (12,5 mcg / ml) antibiotici con una singola colonia di trasformata E. coli. Cellule crescono-up durante la notte a 37 ° C a 250-300 rpm.
  12. Il giorno seguente, utilizzare un kit di isolamento plasmide per isolare il vettore di destinazione dal gro overnightw-up e conservare plasmide purificato a -80 ° C fino all'utilizzo.
    1. Facoltativo: Controllare purezza e la concentrazione di plasmide utilizzando la lettura di assorbanza ottenuto a 260 e 280 nm.

4. Trasformazione di plasmidi in Expression Host

Nota: le condizioni sono fatti in modo asettico.

  1. Ripetere i passaggi 3,2-3,10 per E. cellule coli BL21 con le seguenti modifiche:
    Nota: cellule BL21 non richiedono antibiotici aggiuntivi, quindi solo ampicillina viene aggiunta a piastre di agar per la trasformazione.
    1. Aggiungere 2-5 ml di isolato plasmide a 0,5-2 ng/50 cellule microlitri dal punto 3,12-50 microlitri E. cellule ospiti espressione coli.
    2. Celle di shock termico per 60-90 sec.
    3. Agitare soluzione contenente mezzo SOC a 250 rpm per 60 minuti invece di 30 min.
  2. Cogliere una singola colonia di cellule batteriche trasformate dalla piastra di Petri con un sterbastoncino applicatore ile e posto in una provetta contenente 5 ml di brodo LB con la concentrazione appropriata di ampicillina (100 ug / ml).
  3. Posizionare provette in shaker notte a 37 ° C a 250 rpm.
  4. La mattina seguente, prendere 200 ml di pernottamento crescono-up e aggiungerlo al 5 ml di LB contenente ampicillina a 100 pg / ml.
  5. Congelare le cellule rimanenti con 250 microlitri 50% di glicerolo (sterile) a 750 microlitri cultura e tenere a -80 ° C.
    Nota: espressione di test Nuovo e procedure di scale-up può essere fatto utilizzando un bastoncino applicatore sterile per ottenere un raschiamento di cellule congelate e inoculando LB con gli antibiotici appropriati.
  6. Porre la provetta in agitatore a 250-300 rpm a 37 ° C fino viene misurata la densità ottica (OD) tra 0,7-0,8 in assorbanza a 600 nm.
  7. Indurre le cellule con IPTG ad una concentrazione finale di 1 mM.
  8. Agitare per altre 4 ore a 37 ° C a 300 rpm. In alternativa, le cellule possono ancheessere scosso tutta la notte a 18 ° C a 250-300 rpm. Questo può produrre una maggiore resa di plasmide seconda della proteina bersaglio.
  9. Dodecil solfato di sodio poliacrilammide gel elettroforesi (SDS-PAGE) Analisi dei test Expression
    1. Prendete 500 ml di cultura e di inserirli in una provetta da 1,5 ml. Centrifugare a 13-15 xg per 5 min. Versare il liquido surnatante e l'etichetta "solubile". Risospendere il pellet con vortex in 200 ml di loading dye (50 microlitri 2-mercaptoetanolo, 950 microlitri tampone campione Laemmli).
      Nota: batteri solubili pellets saranno utilizzati per determinare se la proteina ricombinante è nelle regioni citoplasmatici delle cellule batteriche. I pellet possono essere conservati in -80 ° C senza caricare colorante fino a quando necessario. Una coltura batterica di controllo che non è stata trasformata o indotta può essere trattata come solubile e per il confronto.
    2. Prendere 1.000 ml di cultura e di inserirli in una provetta da 1,5 ml. Centrifugare a 13-15 xg per 5 min.Versare il liquido surnatante e l'etichetta "insolubile".
      Nota: pellet insolubili saranno sottoposti a procedure di denaturazione di seguito al fine di rilasciare proteine ​​che si trovano in corpi di inclusione delle cellule batteriche. I pellet possono essere conservati in -80 ° C fino al momento dell'uso. Una coltura batterica di controllo che non è stata trasformata o indotta può essere trattata come insolubile pure per il confronto.
      1. Risospendere il pellet insolubili in 200 microlitri BugBuster e lasciare a temperatura ambiente per 30 min.
      2. Spin down esemplare ancora a 13-15 xg per 5 minuti e prendere 50 ml di surnatante e aggiungere al nuovo "insolubile" provetta da 1,5 ml.
      3. Aggiungere quindi 50 ml di colorante di caricamento a questo nuovo campione.
    3. Bollire entrambi i campioni solubili e insolubili per 5 minuti per denaturare le proteine ​​per l'analisi SDS-PAGE.
    4. Caricare ciascun campione in gel elettroforesi con scaletta standard.
    5. Per visualizzare i campioni proteici utilizzano un staining reagenti e seguire il protocollo della società.
    6. Determinare se la proteina esprime nelle frazioni solubili e / o insolubili confrontando questi due corsie e confrontare le corsie per le corsie di controllo solubili e insolubili (vedi nota 4.9.1 e 4.9.2) sul gel SDS-PAGE (Figura 2). Una banda scura dovrebbe apparire intorno al peso molecolare della proteina nelle corsie solubili o insolubili. Questo determinerà quale procedura di isolamento da utilizzare nel protocollo 6.
      Nota: Se è presente una banda in entrambe queste regioni rispetto sia isolamento utilizzato nel protocollo 6 qui sotto riportata, o la proteina può essere isolato in entrambi i modi per determinare quale metodo di isolamento produce una maggiore resa di proteina ricombinante (Figura 3) .
    7. Se è stato condotto un hr e pernottamento induzione 4, determinare quale metodo di induzione ha la più alta produzione di proteine ​​per il processo di scale-up (Figura 2).

5. Scale-up Procedura e Cultura principale

  1. Preparare mezzi di crescita con 85,7 g di Terrific Broth e 28,8 ml di glicerolo al 50% in 1,8 L di acqua ultrapura e autoclave a ciclo liquido per 1 ora.
  2. Avviare una cultura overnight da congelato magazzino cella creata nel passaggio 4.5.
    Nota: le condizioni sono fatti in modo asettico.
    1. Mescolare 20 ml di LB e con una concentrazione finale di ampicillina a 100 pg / ml in una sterile 125 ml beuta.
    2. Utilizzando un bastoncino applicatore sterile prendere una demolizione della trasformata E. coli cellule e goccia applicatore nel pallone. Rimuovere bastoncino applicatore e pallone spina con schiuma tappo o cotone e coprire con un foglio di alluminio per mantenere la sterilità.
    3. Agitare per una notte a 250 rpm a 37 ° C.
  3. Cultura principale
    Nota: le condizioni sono fatti in modo asettico.
    1. Versare cultura durante la notte in 1,8 L di supporti di crescita sterile e aggiungere ampicillina a 100 mg / ml e da 6 a 8 gocce di antischiuma sterile 204 con una pipetta Pasteur.
    2. Culture posto in un bagno d'acqua a 37 ° con 0,2 millimetri filtrata spumeggiante aria compressa nelle culture attraverso le pietre di aerazione.
    3. Una volta che l'OD 600nm raggiunge 0,7-0,8, indurre con IPTG (1 mM) e permette l'induzione a verificare per una 4 ore a 37 ° C o per una notte a 18 ° C a seconda solubili / insolubili risultati da SDS-PAGE al punto 4.9.
  4. Raccolta E. coli
    1. Centrifugare la coltura cellulare in 1 L bottiglie da centrifuga (2 bottiglie / cultura) per 15 min a 14.000 xga 4 ° C.
    2. Versare il surnatante e usando una spatola sottile, paletta i batteri pellet in due provette da 50 ml. Le cellule possono essere nuovamente pellet per centrifugazione per alcuni minuti.
      Nota: Ogni cultura 1.8 L si tradurrà in due batteri pellets, uno per ogni 50 ml provetta da centrifuga.
    3. Il negozio di pellets in -80 C fino isolamento delle proteine.

6. Isolamento e purificazione della proteina ricombinante

Nota: Se la proteina si trova nella regione solubile a base di SDS-PAGE analisi dal punto 4.9 verrà utilizzato "Isolation Native", ma per le proteine ​​insolubili procedure di "isolamento non nativi" verrà eseguita.

  1. Lisi cellulare
    1. Non nativi
      1. Rimuovere trasformato E. coli pellet da -80 ° C freezer, e aggiungere 20 ml Lysis / tampone di lavaggio (Tabella 1) a ciascuna provetta per centrifuga.
      2. Vortex e scuotere il pellet congelato fino a quando non si scioglie e solubilizza nella soluzione tampone senza grandi blocchi. Incubare su nutator durante la notte. Il mattino seguente, il pellet dovrebbe essere un impasto viscoso a causa della denaturazione della proteina dal buffer.
      3. Centrifugare l'impasto a 20.500 xg a temperatura ambiente per 30 min. Trasferire il surnatante in una nuova provetta per l'isolamento e scartare il pellet.
    2. Native
      1. Ottenere trasformato E. pellet coli da -80 ° C freezer.
      2. Aggiungi Lysis Buffer (Tabella 1) per tubo da centrifuga a raggiungere un volume finale di 30 ml, e sloggiare pellet congelato vortex e scuotendo rigore. Mettere pellet su ghiaccio.
      3. Lavare sonicatore sonda con il 70% di etanolo al 100% di ampiezza per 1-2 min. Quindi ripetere con acqua ultrapura.
      4. Batteri Sonicare pellet mentre in ghiaccio per 5 min (tempo totale di 10 min).
        1. Impostare sonicatore al 30% di ampiezza con impulsi di 30 sec on/30 sec off.
        2. Bob provetta da centrifuga su e giù durante l'intervallo di sonicazione per rompere completamente il pellet di cellule. Al termine del tempo totale trascorso ci dovrebbero essere visibili batteri pellet lasciando una filante, impasto viscoso.
        3. Pulire la sonda del sonicatore tra diversi isolamenti proteiche nonché per storage utilizzando 70% di etanolo e acqua ultrapura come descritto al punto 6.1.2.3.
      5. Centrifugare l'impasto a 20.500 xga 4 ° C per 30 min. Trasferire il surnatante in una nuova provetta per l'isolamento e scartare il pellet.
  2. Ni-NTA affinità e cromatografia
    1. Non nativi
      1. Aggiungere 1 ml Ni 2 +-NTA soluzione di resina per ogni provetta da centrifuga (2 ml totale resina per una cultura 1,8 L) e incubare a temperatura ambiente per almeno 1 ora su nutator.
      2. Versare liquami nella colonna di affinità e lasciare la soluzione goccioli attraverso la valvola rubinetto completamente nel bicchiere rifiuti.
      3. Eseguire 10 lavaggi con 10 ml di Lysis / tampone di lavaggio per ogni lavaggio.
        1. Per i primi due lavaggi, aggiungere 10 ml al tubo da centrifuga per rimuovere la resina supplementare e poi versare in colonna. I lavaggi supplementari possono essere aggiunti direttamente alla colonna.
        2. Dopo ogni lavaggio, mescolare la resina con una bacchetta di vetro. Dopo il lavaggio gocciola nel becher rifiuti, entro 10 ml possono essere aggiunti.
      4. Dopo lavare completamente drips attraverso, chiudere la valvola rubinetto, rimuovere bicchiere rifiuti e sostituire con 50 ml provetta per la raccolta delle proteine.
      5. Aggiungere 15 ml di tampone di eluizione (Tabella 1) e mescolare-up resina, consentendo la soluzione di riposare per 5 minuti. La valvola rubinetto aperto e eluizione raccogliere. Ripetere con altri 15 ml.
    2. Nativo
      1. Seguire la non nativi affinità e cromatografia sopra (Piazza di 6.2.1.1-6.2.1.4) tranne regolare i seguenti parametri:
        1. Incubare Ni 2 soluzione di resina +-NTA a 4 ° C per almeno 1 ora a nutator.
        2. Utilizzare il tampone di lavaggio appropriato (Tabella 1).
      2. Aggiungere 5 ml di tampone di eluizione (Tabella 1) e incubare con resina per 5 min.
        1. La valvola rubinetto aperto e raccogliere eluizione finché la maggior parte della soluzione ha gocciolato attraverso.
        2. Aggiungere 90 ml / pozzetto di reagente di Bradford a respingere piastra da 96 pozzetti. Dopo ogni eluizione lasciare 10 ml di cosìluzione a gocciolare dalla colonna in pozzetto contenente 90 microlitri di reagente Bradford.
        3. Continuare ad aggiungere 5 ml di tampone di eluizione alla volta fino a saggio di Bradford non rileva più proteine ​​(colore va dal blu scuro al blu chiaro per cancellare). Questo richiede di solito 4-5 volumi di eluizione.
  3. Dialisi / rinaturalizzazione
    1. Marca non nativi (rinaturazione) e buffer di dialisi nativi (Tabella 1) e conservare a 4 ° C.
      Nota: Il pH dei tamponi dialisi sono determinati dal punto isoelettrico della proteina bersaglio (pI). Come regola del pollice proteine ​​può essere tamponata almeno un punto pieno sopra o sotto i loro valori IP.
    2. Trasferire eluizioni nativi e non nativi di tubi di dialisi adeguata taglio di peso molecolare (25.000 MWCO per NGF e 50.000 MWCO per Sema3A). Collocare ogni campione in proteina rispettivo tampone di dialisi 1 per 4 ore a 4 ° C e quindi sostituire con il rispettivo tampone 2 sopranotte a 4 ° C.
      Nota: Proteina deve essere dializzato in ogni buffer per almeno 4 ore per il corretto ripiegamento e scambio di tamponi avvenire.
    3. Concentrare le eluizioni proteina dializzati a meno di 5 ml utilizzando concentratori di spin centrifughe.
      Nota: Le proteine ​​possono essere ulteriormente purificato utilizzando proteine ​​veloce cromatografia liquida (FPLC) e concentrati di nuovo.
  4. Determinare la concentrazione di proteine ​​(mg / ml) mediante liofilizzazione un campione 10-50 ml in una provetta pre-pesate.
    1. Facoltativo: determinare il coefficiente di estinzione, ε, in modo che la concentrazione di proteina può essere determinata in isolamenti futuri misurando l'assorbanza del campione a 280 nm usando la legge di Beer-Lambert: C = A 280nm / εl, dove L è la lunghezza del percorso.

7. Biotinilazione di proteina purificata

  1. Dializzare proteine ​​in 10.000 MWCO cassette dialisi against Tris 10 mM (pH = 8,0), cambiando il tampone ogni 4 ore per un totale di 6 modifiche.
  2. Trasferire le proteine ​​ricombinanti (adesso in tampone Tris 10 mM) a 2 ml provette micro-centrifuga per biotinilazione.
  3. Proteine ​​Biotinylate utilizzando un kit proteina ligasi biotina.
  4. Dializzare proteine ​​contro PBS (pH = 7,4) utilizzando 10.000 MWCO cassette dialisi con tampone 3 cambia al giorno per 2 giorni.
  5. Determinare la percentuale biotinylation di proteine ​​utilizzando un kit di quantificazione.
  6. Determinare nuovamente la concentrazione come descritto in 6.4 e conservare a 4 ° C o aliquota e conservare a -20 ° C per una conservazione a lungo termine.

Risultati

Cloning and Test Expression

Quando placcatura viene eseguita correttamente, singole colonie isolate dovrebbero costituire per aumentare le possibilità di spennare clonale trasformati batteri cellule (Figura 2A). Tuttavia, se troppe cellule vengono piastrate, piastre vengono incubate troppo tempo a 37 ° C o trasformazione è discutibile, le colonie possono coprire la piastra di agar o formare grandi aggregati di cellule (figure 2b e <...

Discussione

Ingegneria proteina ricombinante è una tecnica molto potente che abbraccia molte discipline. Si è costo-efficace, regolabile e una procedura relativamente semplice, consentendo la produzione di alte rese di proteine ​​personalizzati. È importante notare che la progettazione ed esprimere proteine ​​bersaglio non è sempre semplice. Espressione basale e la stabilità della proteina ricombinante dipendono da specifiche scelte di vettore, E. coli cellulari, peptide tag aggiunte e parametri colturali. Il ...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori desiderano ringraziare l'Università di Akron per il finanziamento che ha sostenuto questo lavoro.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5%Chem-Impex International127100 g
2-Hydroxyethylmercaptan β-MercaptoethanolChem-Impex International642250 ml
Acetic acid, glacialEMDAX0073-92.5 L
AgarBioshopAGR001.500500 g
Ampicillin sodium salt Sigma-AldrichA951825 g
Antifoam 204Sigma-AldrichA6426500 g
Barstar-NGF pET-21a(+)GenScript USA Inc.4 µg
BL21(DE3) Competent CellsNovagen694501 ml; Expression Host
Bradford reagentSigma-AldrichB6916500 ml
BugBusterNovagen70922-3100 ml
Gel filtration standardBio-Rad151-19016 vials
GlycerolBioshopGLY001.11 L
Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochlorideChem-Impex International1521 kg
His-Pur Ni-NTA ResinThermo Scientific88222100 ml
Hydrochloric acidEMDHX0603-32.5 L
Imidazole Chem-Impex International418250 g
IPTGChem-Impex International194100 g
Laemmli sample bufferBio-Rad161-073730 ml
Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surfaceChem-Impex International270500 g
LB Broth  Sigma-AldrichL30221 kg
NovaBlue Competent CellsNovagen698251 ml; Cloning Host
Phosphate buffered salineSigma-AldrichP5368-10PAK10 pack
Potassium ChlorideChem-Impex International012471 kg
Sema3A-pET-21a(+)GenScript USA Inc.4 µg
SimplyBlue SafeStainInvitrogenLC60601 L
Sodium chlorideSigma-AldrichS5886-1KG1 kg
Sodium hydroxideFisher ScientificS318-500500 g
Sodium phosphate diabasicSigma-AldrichS5136-500G500 g
Sodium phosphate monobasicSigma-AldrichS5011500 g
Terrific BrothBioshopTER409.55 kg
Tetracycline hydrochlorideChem-Impex International66725 g
Tris/Glycine/SDS Buffer, 10xBio-Rad16107321 L
Trizma BaseSigma-AldrichT15031 kg
Tryptone, pancreaticEMD1.07213.10001 kg
Yeast extract, granulatedEMD1.03753.0500500 g
 ÄKTApurifier10GE Healthcare28-4062-64Includes kits and accessories
Benchtop Orbital ShakerThermo ScientificSHKE4000MAXQ 4000
BirA500AvidityBirA500Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution
Dialysis CasetteThermo Scientific66380Slide-A-Lyzer (Extra Strength)
Dialysis TubingSpectrum Laboratories132127, 132129MWCO: 25,000 and 50,000
Flow Diversion Valve FV-923GE Healthcare11-0011-70
FluoReporter Biotin Quantification Assay KitInvitrogen1094598
Frac-950 Tube Racks, Rack CGE Healthcare18-6083-13
Fraction Collector Frac-950GE Healthcare18-6083-00Includes kits and accessories
Heated/Refrigerated Circulator VWR13271-102Model 1156D
Heating Oven FD SeriesBinderModel FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pgGE Healthcare17-1069-01Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI Avanti CentrifugeBeckman Coulter393126
JA 25.50 RotorBeckman Coulter363055
JLA 8.1 RotorBeckman Coulter969329Includes 1 L polyporpylene bottles
JS 5.3 RotorBeckman Coulter368690
Laminar Flow HoodThemo Scientific1849Forma 1800 Series Clean Bench
Microplate ReaderTECANinfinite M200
Mini-PROTEAN Tetra CellBio-Rad165-80044-gel vertical electrophoresis system
Mini-PROTEAN TGX Precast GelsBio-Rad456-9036Any kDa, 15-well comb
Ni-NTA ColumnBio-Rad737-251249 ml volume ECONO-Column
Plasmid Miniprep KitOmega Bio-TekD6943-01
PowerPac HC Power SupplyBio-Rad164-5052250 V, 3 A, 300 W
Round Bottom Polypropylene Copolymer TubesVWR3119-005050 ml tubes for JA 25.50 rotor
Spin-X UF ConcentratorsCorning431488, 431483 20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da
Subcloning ServiceGenScript USA Inc.Protein Services
Ultrasonic Processor Cole-Parmer18910445AModel CV18
Vortex-Genie 2Scientific IndustriesSI-0236Model G560

Riferimenti

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