Sinir doku rejenerasyonu için Çözünür ve Çözünmeyen Biyotinile Proteinlerin ifade, izolasyon ve saflaştırılması

Özet

Biyotinile füzyon proteinleri geliştirerek araştırma çeşitli alanlarda birçok potansiyel uygulamalar vardır. Yeniden birleştirici protein mühendisliği özel olarak tasarlanmış proteinlerin yüksek verim sağlayan, düşük maliyetli olan bir düz ön işlemdir.

Özet

Yeniden birleştirici protein mühendisliği Escherichia coli (E. coli) sentezleme yaklaşık 4 yıldır sistemleri ve bugün kullanmıştır E. coli halen en yaygın olarak kullanılan konak organizmadır. Sistemin esneklik, (streptavidin etkileşimler için) bir biyotin etiketi olarak yarımlar ve yeşil fluoresan protein ya da kiraz, kırmızı proteini gibi daha büyük fonksiyonel proteinlerin eklenmesi için izin verir. Ayrıca, post-translasyonel modifikasyonlar kazandıran metal iyonu kenetleyiciler, eşsiz bir biçimde reaktif fonksiyonel grup, spektroskopik sondaları ve moleküller gibi doğal olmayan amino asitlerin protein entegrasyon özelliklerine sahiptir, daha iyi bir manipülasyon sağladı. Sonuç olarak, bu teknik, bir araştırma çeşitli alanları için anlamlı bir yarar sunan özelleştirilebilir füzyon proteinleri oluşturur. Daha özel olarak, biyotinile protein dizisi için avidin ve biotin streptavidin ile arasındaki yüksek afiniteli bir etkileşim çok hedef proteinler dahil edilmiştir. Bu ek etiketli proteinlerin tespiti ve arıtılmasını artırılması yanı sıra hücre sıralama gibi ikincil uygulamalar için önünü açarak destekli vardır. Bu nedenle, biyotin-etiketli moleküller bioindustrial ve biyomedikal alanlarda artan bir ve yaygın etkisini göstermektedir. Araştırmamız amaçla, sinir büyüme faktörünü (NGF) ve semaphorin3A (Sema3A) fonksiyonel bölgeler ihtiva eden yeniden birleştirici füzyon proteinleri biyotinile tasarladık. Bunların biyotinile füzyon proteinleri, diğer aktif protein dizileri ile birlikte, doku mühendisliği ve rejeneratif amacıyla Biyomalzemelere gergin nasıl daha önce bildirilmiştir. Bu protokol bir T7 lak uyarılabilir vektör ve E. kullanan miligram ölçeğinde mühendislik biyotinile proteinlerin temel özetliyor dönüşüm şekilde büyütülebilir-up ve arıtma için başlangıç ​​coli sentezleme ana.

Giriş

Proteinler sonuçta uygun doku oluşumu ve organizasyon açan, birçok biyolojik fonksiyon için sorumlu biyomoleküllerin geniş bir yelpazeyi kapsamaktadır. Bu moleküller, insan vücudu içinde bir denge sağlamak, düzenleme-yukarı ve / veya aşağı-regülasyonu gen ve proteinlerin kontrol sinyal yollarının binlerce başlatır. Tek bir protein bozulması yıkıcı bozukluklar ya da hastalıkların başlangıcı yol açabilir sinyallerin tüm bu ağ-etkiler. Laboratuarda bireysel protein mühendislik bu olumsuz etkileri ile mücadele için tek bir çözüm sunar ve küçük moleküllü ilaçlar için bir alternatif sunuyor. 1977 yılında, 14 amino asit sekansını kodlayan bir somatostatin gen E. kullanılarak oluşturulan birinci işlenmiş polipeptitlerin biri coli ^1. Kısa bir süre sonra, 1979 yılında, insülin, plasmid pBR322 klonlanmıştır dönüştürülmüş, ifade edildi ve ² saflaştırılmıştır. O zamandan beri, rekombinant proteinleri res birden alanlara nüfuzlarını genişlettikearch vb biyomalzeme, ilaç dağıtım, doku mühendisliği, biyofarmösetiklerinin, tarım, endüstriyel enzimler, biyoyakıt gibi (yorumlar için başvuruları ^3-8). Bu durum da dahil olmak üzere teknik amaçlı uygulamaya özel kimyasal kısımların ve protein dizilerinin eklenmesi ile içerir, ancak, hedef protein tanımlama, stabilizasyon ve arıtma için bunlarla sınırlı olmamak kaydıyla çok yönlülüğünü ölçüde kaynaklanmaktadır.

Rekombinant DNA teknolojisi ile, memeli rekombinant proteinleri, bitki, böcek, maya, mantar veya bakteriler dahil olmak üzere ökaryotik ve prokaryotik konak sistemleri çeşitli ifade edilebilir. Her ev sahibi farklı avantajlar sunar ve genellikle iyi sistem protein fonksiyonu, verim, stabilite, genel maliyet ve ölçeklenebilirlik göre belirlenir. Bakteriler ökaryot hücreleri genellikle ana (yani glikosilasyonu disülfit köprü, e sağlamak sonrası modifikasyon mekanizmaları eksikliği tc). ^5.. Ancak, bu ana genellikle daha pahalı ve zaman alıcı ⁹ olan, bir sonucu olarak, memeli ve böcek sistemleri genellikle, ökaryotik proteinlerin daha iyi uyum ve tanımına neden olur. Bu nedenle, E. Hücreler ucuz büyüme koşulları hızla genişletmek ve genetik mekanizmaları ifade de ^5,9 anlaşılmıştır çünkü coli ekspresyon sistemi için tercih ev sahipliği yapmaktadır. Buna ek olarak, bu sistem, post-translasyonel modifikasyonlar ¹⁰ olmamasına rağmen üretim amaçları ve fonksiyonel proteinleri sonuç için büyütüleceği kolaydır. E. Bu suş yüksek dönüşüm verimleri dayalı mükemmel plazmid verim sağlar, çünkü coli K12 suşu klonlama için bu protokol seçilir. Ayrıca, bir E. Bu konakçı suşu kontrol protein ifadesini ve kararlılığını ¹¹ içerir T7 RNA polimeraz genini içerdiği için coli suşu BL21 ifade için kullanılır.

çadır "> ana seçimden sonra, daha fazla bakım rekombinant proteinleri sentezleyen bakteryofaj T7 transkripsiyon ve çeviri sinyallerinin yönlendirmesi altında klonlanır hedef bir DNA dizisi ile başlar. seçilir ve kontrollü bir protein ekspresyonunu kolaylaştırmak için ideal bir ekspresyon vektörü seçiminde de büyük dikkat olmalıdır ve ifadesi T7 RNA polimeraz geninin kromozom kopyasını ¹² arasında ihtiva eden konakçı hücrelerde endüklenir. plazmid vektörü pBR322 türetilen Bu vektörler, (inceleme için bkz ¹³ referans), sıkı bir şekilde, başlangıçta ¹⁴ Studier ve arkadaşları tarafından geliştirilen T7 promoter tarafından kontrol edilir ve ek sağlamaktadır lac operatörü ve lac represör (lac1) dahil edilmesi yoluyla kontrol ^15,16. yeniden birleştirici protein mühendisliği için, bu ifade sistemi, farklı hedef DNA dizileri sokulmasıyla istenen bir proteinin belirli bir amino asit sekansı ya da uyarlamak için füzyon proteinlerini oluşturmak için olanağı sunar Kombine etki oluşurTek proteinlerden s. Buna ek olarak, bir dizi çizim N veya C terminaline yerleştirilmesi için peptit etiketi modifikasyonlarını içerir. Tasarım amaçları için, bir histidin (His) etiketi saflaştırma için DNA hedef dizisine ilave edildi ve bir 15 amino asit sekansı, biyotinile biyotinilasyon ^17,18 için dahil edilmiştir. Bu protokol, bir ampisilin direnç genini ihtiva eden bir plasmid, bizim biyotinile füzyon protein dizileri taşımak için seçildi. Expression T7 lac promotörü, bu vektör ile kontrol edilir ve kolay bir şekilde, izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ile endüklenir.

Deney ifadeler (küçük ölçekli kültürler), saflaştırma işlemleri formüle ya çözünebilir ya da çözünmez formda ifade edilebilir hedef proteinin varlığını ve çözünürlüğünü belirlemek için kullanılır. Bakteri hücre içinde ifade edilen çözünür bir protein kendi doğal yapısı ¹⁹ korumak için kendiliğinden katlama uğrayacaktır. Tipik olarak, doğalyapı termodinamik olarak tercih edilir. Birçok durumda ana metabolik aktivitesi çözünmeyen protein üretimi ve çözünmez agregaların oluşan protein inklüzyon cisimciklerinin oluşumuna yol açar sistemde stres yerleştirerek, hedef proteine ​​elverişli değildir. Bu durumda, hedef protein ²⁰ genel olarak, biyolojik olarak aktif olmayan hale getirilerek, denatüre. Her iki test ifadeler-up ölçeklendirilir ve izolasyon prosedürleri hedef proteinin çözünürlükleri tarafından belirlenir. Ek bir renatürasyon adımı yeniden katlama ya da çözünmeyen proteinler için gereklidir. Meydana gelen rekombinant proteinler, bundan başka, boyut dışlama kromatografisi kullanılarak saflaştırılabilir.

Evde rekombinant protein üretim hedef proteinin miligramı Ana kültürün her bir litresi için izole edilebilir çünkü ticari ürünlere kıyasla maliyet avantajı sunmaktadır. Gerekli ekipman çoğu, tipik bir biyolojik ya da kimyasal laboratuar mevcuttur. Protein mühendisliği oluşturulması için sağlar:her zaman ticari olarak geçerli değildir ilave fonksiyonlarını özel füzyon proteinlerinin. 1 rekombinant protein mühendisliği ile ilgili olan temel prosedürleri tasvir etmektedir. Bu ekspresyon sistemi ile, örneğin, interferon-gama, trombosit türevli büyüme faktörü, kemik morfojenik ^{proteini-21-23} gibi pek çok biyotinile protein, oluşturduk, ama biz akson rehberlik, NGF (29 kDa için tasarlanmış iki protein üzerinde durulacak ) ve Sema3A (91 kDa) ¹⁰ (inceleme için) ²⁴ başvuru bkz. Biyotinilasyon tanımlanması, hareketsizleştirme ve iyi bilinen bir biotin-streptavidin etkileşimini kullanan ^25-27 etiketli proteinlerinin izole edilmesi için yaygın bir tekniktir. Biyofizik sondalar ^{28,29, 30} biyosensörler, ve kuantum noktaları ³¹ 10 ^-15 M ²⁷ sipariş üzerine bir K _d ile biotin-streptavidin konjugasyon yüksek afinite kullanan sistemler bazı örnekler vardır. E. coli biokalay ligazı, BirA, biyotin içinde bulunan lizin yan zincire biyotin kovalent ekinde yardımcı dizisi ^18,32 etiketlendi. Malzeme ve biyomoleküllere Tethering biyotin çoklu doku mühendisliği uygulamaları ^21,33-35 için hücre büyüme faktörlerinin sürekli teslim üretti. Bu nedenle, bu özel tasarımlı biyotinile proteinleri mühendislik çoklu araştırma çıkarlarını aşabiliriz güçlü bir araçtır.

Protokol

1.. Hedef Protein Tasarımı

1. Biyoteknoloji Bilgi sitesi için Ulusal Merkezi'ni kullanma (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) dikkate ilgi ve herhangi bir ek yeri varyantları tür alarak hedef protein için bir amino dizisini elde. Proteinin ilgi aktif bölgesine karşılık gelen amino asit dizisini seçin.
   Not: Sema3A için, amino asitler 21-747 seçilmiştir. Bir füzyon proteini barstarın, bir amino asit, 1-90 dizisi, NGF amino asitler 122-241 'e eklendi NGF ile tasarlanmıştır.
2. N-terminal dizileri takip eklemek için: arıtma için 6X His etiketi (HHHHHH), Tütün Etch Virüsü His etiketinin çıkarılması için (TEV) proteaz kesme bölgesi (ENLYFQG), biotin K (GLNDIFEAQKIEWHE) de protein biyotinilasyon için dizisi etiketli ve uygun protein refolding (EFPKPSTPPGSSGGAP) için oda sağlayacak boşluklar esnek menteşe.
   Not: Bu sekanslar, arzu edilen füzyon prot bağlı olarak değişebilirein.
3. , Arzu edilen alıcı türleri ve sentezi için gen tasarım / optimizasyonu için bir şirket için tam bir amino asit sekansı gönder. Bir kit kullanılarak BamHI-Notl ile tercih edilen bir vektör içine veya ticari hizmetleri kullanılarak alt-klonlanmıştır.

2. Agar Tabaklar Yapımı

Not: Bu antibiyotiklerin, levhalar, tamponlar, tüm hisse senetleri (sıcaklık ve süre) düzgün saklanan çok önemli olduğunu ve (steril) Proteazların serbest kalır.

1. Bir cam şişe içinde ortam, 20 g / L ve yerde 1,5 ağırlık% ve lizojeni suyu (LB) agar tartılır. Bir 500 ml şişe yaklaşık 15 plakaları hale getirir.
2. Hacimsel, ultra saf su ekleyin, iyice karıştırın, ve otoklav.
3. Dokunmak şişe soğuması ve uygun antibiyotik ekleyin. Şişe çok soğur ve çözelti donmak başlarsa, ancak, mikrodalga içinde tekrar ısıtılmakta, agar erken katılaşmasını önlemek.
   Not: Bizim plazmid bir ampisilin direnç gen içerire. Bu nedenle, tüm adımlar 100 ug / ml 'de ampisilin içermelidir. E. E. coli K12 suşu klonlama tetrasiklin (12.5 ug / ml) antibiyotik gerektirir. BL21 bakteri hücreleri herhangi bir ek antibiyotik gerekmez.
4. 90 mm Petri kapları içine solüsyonu 25-30 ml dökün ve kurumasını zaman tanıyın.
5. Uygun antibiyotik ve Parafilm ile 4 ° C, veya sıkıca kapanabilen bir torbada mağaza baş aşağı ile etiket çanak.
   Not: Tabaklar yaklaşık bir ay boyunca iyi.

3. Biotin Tagged Plazmid klonlanması

Not: Koşullar aseptik yapılır.

1. Pelet etmek için 3 dakika boyunca 6,000 x g de plazmid vektörü Spin ve steril aşırı saf su içinde 10 ul ekle.
2. Kimyasal olarak, yetkili E. 50 ul kaldır -80 ° C ve hemen coli hücreleri, yüksek dönüşüm etkinliği 5-10 dakika için buz üzerine yerleştirin.
3. 0,5-1 ng/50 vektörü çözeltisi 1 ul ekle56, 50 ul E. l hücrelerin coli hücreleri ve -80 ° C 'de kalan plazmid yerleştirin
4. 5 dakika boyunca buz üzerinde vektör içeren bakteri hücreleri yerleştirin.
5. Isı şok geri 2 dakika boyunca buz üzerinde 42 ° C su banyosu ve yer hücrelerde 30-45 saniye boyunca hücre ve vektör karışım.
6. Katabolik baskı (SOC) ortamı (% 2 v bakto-tripton / w,% 0.5 w / v bakto-maya ekstresi, 8.56 mM NaCl, 2.5 mM KCI, 20 mM MgSO _4, 20 mM glukoz ile süper uygun suyu 250 ul ekle , ultra saf su, pH = 7.0) ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de 250 rpm'de çalkalanır.
   Not: SOC otoklava olmamalı, filtre, bir 0.22 um filtre ile sterilize edilebilir.
7. Kuru plakalar önce hücreleri kaplama için 10-15 dk.
8. Pipet 25, 50, ve ampisilin (100 ug / ml) ve tetrasiklin (12.5 ug / ml) ihtiva eden antibiyotikler ayrı agar plakaları üzerine hücre çözeltisinin 100 ul. Ağar plakalar üzerinde eşit çözümü dağıtmak için cam boncuk kullanın.
9. 15-18 saat boyunca 37 ° C'de plakaları baş aşağı inkübe edin.
10. Tabakalarına küçük bireysel koloniler bakteri için kontrol ve kullanım (Şekil 2A) kadar 4 ° C de ters olarak depolar.
    1. Koloniler varsa:
       1. Tamponlar ve malzemelerin tazeliği ve sterilite kontrol edin.
       2. E 'e eklendi plazmid miktarını artırmak coli K12 suşu.
    2. Büyük koloniler mevcut olan ya da koloniler (Şekil 2B ve 2C) bir büyüme varsa, düşük ses steril bir aşılama döngü veya tabak hücreleri kullanarak yeni bir agar plaka restreak.
11. Inoküle 5 ml dönüştürülmüş E. tek bir koloni ile ampisilin (100 ug / ml) ve tetrasiklin (12.5 ug / ml) ihtiva eden LB antibiyotikler coli hücreleri. Büyüme-up hücreler gece boyunca 250-300 rpm'de 37 ° C'de.
12. Sonraki gün, bir gece boyunca Gro gelen hedef vektör izole etmek için bir plazmid izolasyon kiti kullanmakw-up sonraki kullanıma kadar -80 ° C 'de ve mağaza plazmid saflaştırılmıştır.
    1. İsteğe bağlı: 260 ve 280 nm 'de elde edilen absorbans ölçümleri kullanılarak plazmid saflık ve konsantrasyon kontrol edin.

4. İfade Plazmidi konakçıya transformasyonu

Not: Koşullar aseptik yapılır.

1. Tekrar E. için 3,2-3,10 adımları aşağıdaki değişikliklerle coli BL21 hücreleri:
   Not: BL21 hücreleri, bu nedenle sadece ampisilin dönüşüm için agar plakalarına ilave edilir, herhangi bir ek antibiyotik gerekmez.
   1. 50 ul E. adım 3.12 den 0,5-2 ng/50 ul hücre olacak şekilde izole edilmiş plazmid 2-5 ul ekle E. coli ekspresyon konakçı hücreler.
   2. 60-90 saniye ısıl şok hücreler.
   3. 60 dakika yerine 30 dakika boyunca 250 rpm'de çözelti ihtiva eden SOC ortam çalkalayın.
2. Ster ile bir Petri kabı dönüştürülmüş bakteri hücrelerinin tek bir koloni PluckIle uygulama çubuk ve yeri ampisilin uygun konsantrasyona (100 ug / ml) ile birlikte 5 ml LB et suyu ihtiva eden bir deney tüpü içinde.
3. 250 rpm'de 37 ° C'de gece boyunca çalkalayıcıda test tüpleri yerleştirin.
4. Ertesi sabah, gece boyunca büyümeye-up 200 ul almak ve 100 ug / ml ampisilin içeren 5 ml LB ekleyin.
5. 750 ul kültür (steril) 250 ul% 50 gliserol ile kalan hücreleri aşağı dondurma ve -80 ° C'de tutmak
   Not: Yeni bir test ifade ve ölçek-up işlemleri donmuş hücrelerin bir kazıma elde etmek için steril bir aplikatör çubuk kullanarak ve uygun antibiyotik ile LB aşılayarak yapılabilir.
6. Optik yoğunluk (OD) 600 nm 'lik bir emişteki 0,7-0,8 arasında ölçülmektedir kadar 37 ° C' de 250-300 rpm'de çalkalayıcı test tüpü yerleştirin.
7. 1 mM nihai konsantrasyonunda IPTG ile hücrelerin neden.
8. 300 rpm'de 37 ° C'de ek bir 4 saat boyunca çalkalanır. Alternatif hücreler de yapabilirsiniz250-300 rpm'de 18 ° C'de gece boyunca çalkalanır. Bu, hedef proteine ​​bağlı olarak plazmid daha yüksek bir verim üretebilir.
9. Testi İfade Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) Analizi
   1. 1.5 ml tüp içinde kültür ve yerin 500 ul alır. 5 dakika boyunca 13-15 xg'de aşağı spin. Üstteki likit dökün ve etiket "çözünür." Yükleme boyası (50 ul 2-merkaptoetanol, 950 ul Laemmli numune tampon maddesi) 200 ul vorteks ile süspanse pelet.
      Not: Çözünür bakteri granül birleştirici protein bakteri hücrelerinin sitoplazmik bölgelerinde olup olmadığını belirlemek için kullanılacaktır. Peletler, gerekli olana kadar bir boya yükleme olmadan -80 ° C'de saklanabilir. Dönüştürülmüş ya da neden olmamıştır bir kontrol bakteri kültürü çözünür hem de karşılaştırma için tedavi edilebilir.
   2. 1.5 ml tüp içinde kültür ve yerin 1.000 ul alır. 5 dakika boyunca 13-15 xg'de aşağı spin.Üstteki likit dökün ve etiket "çözünmez."
      Not: Çözülmez pelet bakteri hücrelerinin dahil vücutlarında bulunan proteinlerin serbest bırakmak için aşağıda denaturasyonu prosedür uygulanır. Peletler, gerekli olana kadar -80 ° C'de saklanabilir. Dönüştürülmüş ya da neden olmamıştır bir kontrol bakteri kültürü çözünmeyen hem de karşılaştırma için tedavi edilebilir.
      1. 200 ul BugBuster içinde çözünmeyen pelet yeniden süspanse edin ve 30 dakika için oda sıcaklığında bırakın.
      2. 5 dakika boyunca 13-15 xg'de tekrar numune aşağı Spin ve üstte 50 ul alır ve yeni "Çözünmeyen" 1.5 ml tüp ekleyin.
      3. Sonra bu yeni örneğe yükleme boyası 50 ul ekleyin.
   3. SDS-PAGE analizi için proteinleri denatüre etmek için 5 dakika boyunca hem de çözünür ve çözünmez örnekleri kaynatın.
   4. Standart merdiven ile elektroforez jel halinde her bir numune yükleyin.
   5. Görselleştirmek amacıyla protein numuneler bir lekelenme kullanımıg reaktif ve şirketin protokolünü uygulayın.
   6. Protein, SDS-PAGE jel (Şekil on (Not 4.9.1 ve 4.9.2), bu iki şerit karşılaştırma hem de çözünür ve çözünür olmayan kontrol şeride şerit karşılaştırarak çözünür ve / veya çözünmez fraksiyonlar içinde eksprese edip etmediğini belirlemek 2). Koyu bant çözünür veya çözünmez şeritlerde proteinin molekül ağırlığı yaklaşık görünmelidir. Bu, izolasyon prosedürü Protokol 6 kullanılacak belirleyecektir.
      Not: bir grup izolasyon yöntemi rekombinant proteinin daha yüksek bir verim (Şekil 3) üretir belirlemek için Protokol 6 da kullanılan izolasyon altında gerçekleştirilebilir, ya da her iki yönde protein izole edilebilir, ya da çok bu bölgelerin her ikisinde de varsa .
   7. 4 saat ve gece boyunca indüksiyon yapıldı ise, ölçek-up işlemi için yüksek protein üretimini (Şekil 2) sahip olan tümevarım metodu belirler.

5. Ölçek-up Usul ve Ana Kültür

1. Terrific Broth 85.7 g ve 1.8 L saf su ve 1 saat süre ile sıvı döngüsünde otoklav içinde% 50 gliserol, 28.8 ml büyüme ortamı hazırlayın.
2. Adım 4.5 oluşturulan donmuş hücre stok kültürü bir gece boyunca başlatın.
   Not: Koşullar aseptik yapılır.
   1. Steril bir 125 ml Erlenmeyer şişesi içinde 100 ug / ml 'de 20 ml LB ve ampisilin bir son konsantrasyon ile karıştırın.
   2. Steril bir aplikatör kullanarak dönüştürülmüş E. bir hurdaya almak coli hücreleri ve şişeye damla aplikatörü. Köpük stoper ya da pamuk ile aplikatör sopa ve fiş şişeyi çıkarın ve sterilite korumak için alüminyum folyo ile kaplayın.
   3. 37 ° C'de 250 rpm'de gece boyunca çalkalayın
3. Ana Kültür
   Not: Koşullar aseptik yapılır.
   1. Steril büyüme ortamı içinde 1.8 L kültür içine dökün ve bir gece boyunca 10 ° ampisilin eklemek0 ug / ml ve bir Pasteur pipeti kullanılarak steril köpük önleyici 204 6-8 damla.
   2. Havalandırma taş aracılığıyla kültürler içine sıkıştırılmış hava kabarcıkları, süzüldü 0,2 mm olan bir 37 ° C su banyosu içinde yer kültürler.
   3. OD _{600 nm} 0,7-0,8 ulaştığında, IPTG (1 mM) ile teşvik ve indüksiyon aşama 4.9 SDS-PAGE çözünür / çözünmeyen sonuçlarına bağlı olarak 18 ° C 'de 37 ° C'de ya da gece boyunca 4 saat için ya da oluşmasına izin verir.
4. E. Toplama Hücreler coli
   1. 4 ° C'de 14,000 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj 1 L şişe (2 şişe / kültür) hücre kültürü aşağı Spin
   2. Süpernatantı dökün ve ince bir spatula kullanılarak, bakterilerin iki adet 50 ml tüplere pelet kepçe. Hücreler, bir kaç dakika için santrifüjleme ile tane haline tekrar edilebilir.
      Not: her bir 1.8 L kültür iki bakteri topaklar, her bir 50 ml santrifüj tüpüne bir neden olur.
   3. Protein izolasyonu kadar -80 ° saklayın peletler.

6. Rekombinant Protein izolasyonu ve saflaştırılması

Protein aşama 4.9 SDS-PAGE Analizi göre çözünür bölgesinde yer almaktadır, o zaman "yerel yalıtım" olarak kullanılacaktır, ancak çözünmeyen proteinler "Özgün olmayan Isolation" işlemleri için gerçekleştirilir: edin.

1. Cell Lysis
   1. Özgün olmayan
      1. Kaldır E. dönüştürdü coli topak -80 ° C dondurucu ve her bir santrifüj tüpüne 20 ml Lysis / Wash Buffer (Tablo 1) ekleyin.
      2. Vortex ve özer ve herhangi bir büyük boyutta olmadan tampon çözeltisi içine çözen kadar donmuş pelet sallayın. Gecede nutator kuluçkaya yatmaktadır. Ertesi sabah, topak artık tamponundan proteinin denatürasyon nedeniyle yapışkan bir harç madde olmalıdır.
      3. 30 dakika boyunca, oda sıcaklığında 20,500 x g'de santrifüje bulamacı. Izolasyon için, yeni bir tüpe transfer süpernatan ve topak atın.
   2. Yerli
      1. Elde transforme edilmiş E. -80 ° C dondurucu coli pelet.
      2. 30 ml'lik bir son hacme ulaşmak için santrifüj tüpüne Lysis Buffer (Tablo 1) ekleyin ve karıştırın ve sıkı bir şekilde çalkalanarak dondurulmuş pelet çıkarmak. Buz üzerinde pelet yerleştirin.
      3. 1-2 dakika boyunca% 100 genliğinde% 70 etanol ile sonikatör probu yıkayın. Sonra saf su ile tekrarlayın.
      4. Sonicate bakteriler 5 dakika (10 dakika toplam geçen süre) için buz üzerinde ise pelet.
         1. Sn kapalı on/30 30 saniye darbesi ile% 30 genlikte selenleyicisi ayarlayın.
         2. Bob santrifüj tüpü ve tamamen hücre pelet kadar kırmak için Sonication aralıkta aşağı. Toplam sürenin sonunda görünür bir bakteri, bir tel, viskoz bir bulamaç kaldı pelet olmalıdır.
         3. Farklı protein izolasyonların arasındaki sonikatör probu temizleme hem de aşama 6.1.2.3 de tarif edildiği gibi% 70 etanol ve ultra saf su ile depolama için.
      5. 30 dakika boyunca 4 ° C'de 20,500 x g'de santrifüjleyin bulamacı. Izolasyon için, yeni bir tüpe transfer süpernatan ve topak atın.
2. Ni-NTA Afinite Kromatografisi
   1. Özgün olmayan
      1. 1 ekleyin ml ^{Ni2 +-NTA} her santrifüj tüpünün (1.8 L kültür boyunca 2 ml reçine toplam) hazırlandı reçine çözeltisi ve nutator en az 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
      2. Afinite sütuna şerbeti dökün ve çözüm atık behere tamamen musluk vana aracılığıyla akmasına izin.
      3. Her bir yıkama için Lizis / Yıkama Tamponu 10 ml ile 10 yıkama yapın.
         1. İlk iki yıkama, ek reçine kaldırmak ve daha sonra kolon içine dökmek için santrifüj tüpüne 10 ml. Ek yıkama kolonuna doğrudan ilave edilebilir.
         2. Her yıkamadan sonra, cam bir çubuk ile karıştırma, reçineyi karıştırın. Yıkama atık beher içine damlar, bir sonraki 10 mi ilave edilebilir.
      4. Sonra tamamen dr yıkayınyoluyla ips, valfli yakın vana, atık beher kaldırmak ve protein toplama için 50 ml santrifüj tüpü ile değiştirin.
      5. Seyreltme Tampon maddesi (Tablo 1) 15 ml eklenir ve karışmaya-up reçine, solüsyon 5 dakika boyunca oturmak için izin verir. Açık musluk vana ve toplamak yıkama. Ilave bir 15 ml 'si ile tekrar tekrar edin.
   2. Yerli
      1. Aşağıdaki parametreleri ayarlamak dışında (Adımda 6.2.1.1-6.2.1.4) Yukarıdaki Özgün olmayan Affinity Kromatografisi izleyin:
         1. Ni ² nutator en az 1 saat boyunca 4 ° C 'de ^+-NTA reçine solüsyonu inkübe edin.
         2. Uygun Wash Buffer (Tablo 1) kullanarak.
      2. Elüsyon Tamponu (Tablo 1) 5 ml ve 5 dakika için reçine ile inkübe edin.
         1. Açık musluk vanası ve çözeltinin çok kadar elüsyonu toplanması yoluyla damlatılır gelmiştir.
         2. 96 oyuklu plaka temizlemek için 90 ul / oyuk Bradford reaktifı ilave edin. Her yıkama izin sonra yani 10 ulde 90 ul Bradford reaktifi içeren içine sütundan damla devrim sisi.
         3. Bradford tahlil artık protein (renk temizlemek için açık mavi, koyu mavi gider) tespit kadar bir seferde 5 ml sıyrılması Tampon eklemeye devam edin. Bu genellikle 4-5 elüsyon hacimleri alır.
3. Diyaliz / Renatürasyon
   1. 4 ° C. Özgün olmayan (renatürasyonunu) ve yerli diyaliz tamponlar (Tablo 1) ve mağaza olun
      Not: diyaliz tampon pH'ı, hedef proteinin izoelektrik noktasının (pl) ile tespit edilir. Başparmak proteinlerin bir kural kendi pl değerlerin üstünde veya altında en az bir tam nokta tamponlu gerektiği gibi.
   2. Uygun molekül ağırlığı kesme (Sema3A için NGF ve 50,000 MWCO için 25,000 MWCO) ile diyaliz boru yerli ve yerli olmayan elüsyonları aktarın. 4 ° C'de 4 saat boyunca, ilgili diyaliz tampon maddesi içinde 1 her bir protein numunesi yerleştirin ve daha sonra söz konusu tampon 2 fazla ile değiştirin4 ° C'de gece
      Not: Protein doğru ve tekrar katlanmadan gerçekleşmesi için tampon değişimi için en az 4 saat süreyle her bir tampon içinde diyaliz edilmiş olması gerekir.
   3. Santrifüj sıkma konsantre edici kullanılarak en az 5 ml diyaliz edilmiş protein elüsyonları konsantre edin.
      Not: Proteinler daha hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) kullanılarak saflaştırılabilir ve yeniden konsantre edildi olabilir.
4. Dondurularak önceden tartılmış bir mikrosantrifüj tüpü içinde bir 10-50 ml bir numuneyi kurutmak suretiyle protein konsantrasyonu (mg / ml) belirler.
   1. Isteğe bağlı c: l yol uzunluğu olan bir _280nm / εl,: = sönüm katsayısı belirlemek, ε, protein yoğunlaşma Beer-Lambert Yasasına kullanılarak 280 nm 'de bir numunenin absorbansı ölçülerek gelecek izolasyon belirlenebilir, böylece.

7. Saflaştırılmış protein Biyotinilasyon

1. 10,000 MWCO diyaliz kaseti ag proteinleri Dialyze10 mM Tris ainst (pH = 8.0), 6 değişikliklerin toplam tampon her 4 saat değiştirilmesi.
2. Biyotinilasyon için 2 ml mikro santrifüj tüplerine (şimdi 10 mM Tris tamponu içinde) yeniden birleştirici proteinleri aktarın.
3. Bir biotin protein ligaz kiti kullanılarak Biotinylate proteinleri.
4. 3 tamponu ile 10,000 MWCO diyaliz kaseti kullanılarak PBS (pH = 7.4) karşı proteinleri Dialyze 2 gün boyunca bir gün değişir.
5. Bir miktar analiz kiti kullanılarak protein yüzde biyotinilasyonunu belirler.
6. 4 ° C'de veya uzun süreli depolama için -20 ° C'de alikot ve mağazada 6.4 ve mağaza de tarif edildiği gibi yeniden konsantrasyonunun belirlenmesi.

Sonuçlar

Klonlama ve ifade Testi

Kaplama düzgün yapıldığında, tek bir izole koloniler klonal transforme bakteriler hücreleri (Şekil 2A) koparma şansını artırmak için oluşturmalıdır. Çok sayıda hücre plakalanır, ancak plakalar 37 ° C ya da dönüşüm çok uzun inkübe edilir koloniler agar plaka kapak veya hücre daha büyük agregalar (Şekil 2B ve 2C) oluşturabilmektedir, sorgulanabilir. Test ifade sıra...

Tartışmalar

Rekombinant protein mühendisliği birçok disiplinin yayılan çok güçlü bir tekniktir. Bu, özel olarak tasarlanmış proteinlerin yüksek verimle üretimini sağlayan, düşük maliyetli, ayarlanabilir ve nispeten basit bir işlemdir. Bu tasarımı ve hedef proteinleri ifade her zaman kolay değildir dikkat etmek önemlidir. Bazal ve rekombinant protein ekspresyon vektörü kararlılık, E. belirli seçenekler bağlıdır coli hücre suşları, peptit etiketi eklemeler ve yetiştirme parametreler...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5%	Chem-Impex International	127	100 g
2-Hydroxyethylmercaptan β-Mercaptoethanol	Chem-Impex International	642	250 ml
Acetic acid, glacial	EMD	AX0073-9	2.5 L
Agar	Bioshop	AGR001.500	500 g
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A9518	25 g
Antifoam 204	Sigma-Aldrich	A6426	500 g
Barstar-NGF pET-21a(+)	GenScript USA Inc.		4 µg
BL21(DE3) Competent Cells	Novagen	69450	1 ml; Expression Host
Bradford reagent	Sigma-Aldrich	B6916	500 ml
BugBuster	Novagen	70922-3	100 ml
Gel filtration standard	Bio-Rad	151-1901	6 vials
Glycerol	Bioshop	GLY001.1	1 L
Guanidine hydrodioride amioformamidine hydrochloride	Chem-Impex International	152	1 kg
His-Pur Ni-NTA Resin	Thermo Scientific	88222	100 ml
Hydrochloric acid	EMD	HX0603-3	2.5 L
Imidazole	Chem-Impex International	418	250 g
IPTG	Chem-Impex International	194	100 g
Laemmli sample buffer	Bio-Rad	161-0737	30 ml
Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface	Chem-Impex International	270	500 g
LB Broth	Sigma-Aldrich	L3022	1 kg
NovaBlue Competent Cells	Novagen	69825	1 ml; Cloning Host
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK	10 pack
Potassium Chloride	Chem-Impex International	01247	1 kg
Sema3A-pET-21a(+)	GenScript USA Inc.		4 µg
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	1 L
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886-1KG	1 kg
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S318-500	500 g
Sodium phosphate diabasic	Sigma-Aldrich	S5136-500G	500 g
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011	500 g
Terrific Broth	Bioshop	TER409.5	5 kg
Tetracycline hydrochloride	Chem-Impex International	667	25 g
Tris/Glycine/SDS Buffer, 10x	Bio-Rad	1610732	1 L
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503	1 kg
Tryptone, pancreatic	EMD	1.07213.1000	1 kg
Yeast extract, granulated	EMD	1.03753.0500	500 g
ÄKTApurifier10	GE Healthcare	28-4062-64	Includes kits and accessories
Benchtop Orbital Shaker	Thermo Scientific	SHKE4000	MAXQ 4000
BirA500	Avidity	BirA500	Enzyme comes with reaction buffers and biotin solution
Dialysis Casette	Thermo Scientific	66380	Slide-A-Lyzer (Extra Strength)
Dialysis Tubing	Spectrum Laboratories	132127, 132129	MWCO: 25,000 and 50,000
Flow Diversion Valve FV-923	GE Healthcare	11-0011-70
FluoReporter Biotin Quantification Assay Kit	Invitrogen	1094598
Frac-950 Tube Racks, Rack C	GE Healthcare	18-6083-13
Fraction Collector Frac-950	GE Healthcare	18-6083-00	Includes kits and accessories
Heated/Refrigerated Circulator	VWR	13271-102	Model 1156D
Heating Oven FD Series	Binder		Model FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pg	GE Healthcare	17-1069-01	Discontinued--Replacement Product: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI Avanti Centrifuge	Beckman Coulter	393126
JA 25.50 Rotor	Beckman Coulter	363055
JLA 8.1 Rotor	Beckman Coulter	969329	Includes 1 L polyporpylene bottles
JS 5.3 Rotor	Beckman Coulter	368690
Laminar Flow Hood	Themo Scientific	1849	Forma 1800 Series Clean Bench
Microplate Reader	TECAN		infinite M200
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	165-8004	4-gel vertical electrophoresis system
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels	Bio-Rad	456-9036	Any kDa, 15-well comb
Ni-NTA Column	Bio-Rad	737-2512	49 ml volume ECONO-Column
Plasmid Miniprep Kit	Omega Bio-Tek	D6943-01
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	164-5052	250 V, 3 A, 300 W
Round Bottom Polypropylene Copolymer Tubes	VWR	3119-0050	50 ml tubes for JA 25.50 rotor
Spin-X UF Concentrators	Corning	431488, 431483	20 and 6 ml; MWCO: 10,000 Da
Subcloning Service	GenScript USA Inc.		Protein Services
Ultrasonic Processor	Cole-Parmer	18910445A	Model CV18
Vortex-Genie 2	Scientific Industries	SI-0236	Model G560