Femoral Aspiración de médula ósea en ratones vivos

Resumen

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Resumen

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

Introducción

All blood cells are derived from hematopoietic stem cells (HSCs). Procedures which allow access to the bone marrow (BM), the site of the vast majority of HSC’s in mice and men, without requiring sacrifice of animals, provide a resource to monitor the source of hematopoiesis serially. The overall goal of the procedure described here is to provide a detailed protocol for the sampling of BM cells from the femur of live mice which provides material representative of the cells which would be retrieved by conventional harvest of BM cells through sacrifice of the mice. The advantage of this procedure over conventional harvest of BM cells is that this procedure does not require the sacrifice of mice and therefore allows for longitudinal study of the bone marrow compartment of mice over time.

Although this murine bone marrow aspiration procedure has been used in a number of studies and described previously (see Sundberg et al. for a historical review¹), formal step-by-step procedures illustrating this technique have not been previously published. This protocol enables routine serial sampling of the BM for purposes such as assessing engraftment in the BM of cells exogenously introduced into the mouse (as would be done in xenograft studies for instance^2,3), analysis of chimerism in the BM for comparison with that of the peripheral blood (where results are not necessarily congruent), monitoring the abundance of specific cell types normally enriched in the marrow such as hematopoietic stem and progenitor cells, and retrieval of BM cells for ex vivo culture and/or transplantation. In addition, evaluation of marrow contents may be very useful in murine models of hematological disease as aspiration is helpful in assessing hematological disease burden at time points when disease may not be evident in the peripheral blood^3-5. Moreover, this technique may be used to evaluate response of hematologic disease in the marrow to drugs administered in therapeutic studies. Thus, the procedure described here is ideal for investigators wishing to obtain access to bone marrow hematopoietic cells from mice for cytological analysis, flow cytometric analysis, in vitro culturing, and/or in vivo transplantation studies without requiring sacrifice or harm to the mice.

The protocol for sampling of BM described here is quite similar to the technique used for intra-femoral injection of material directly into the marrow cavity^3,6. The key difference being that this protocol details the procedure for removal of cells from the marrow as opposed to instilling material directly into the marrow cavity space as is done with intrafemoral injection.

Protocolo

Todos los animales procedimientos descritos en este protocolo se realizaron de conformidad con las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC) en el Centro de Cáncer Memorial Sloan-Kettering.

1. Aspiración de médula ósea (MO) Las células del Fémur

1. Se anestesia el ratón que se someterá a la aspiración de médula ósea femoral con isoflurano (1-4%), administrado con un vaporizador de precisión. Profundidad de la anestesia debe ser monitoreado cada 5-10 minutos durante todo el procedimiento por la observación de que no hay ningún cambio en la frecuencia respiratoria asociada con la manipulación quirúrgica y / o la oreja, dedo del pie, y de pinzamiento del rabo. La anestesia se indujo con isoflurano y también mantiene durante todo el procedimiento con isoflurano. Una dosis previa al procedimiento preventivo de la buprenorfina a una dosis de 0,05-0,1 mg / kg por vía subcutánea cada 6-12 h se puede utilizar para prevenir el dolor asociado con el procedimiento como un adjUNCT al Carprofeno.
2. Aplicar pomada oftálmica a los ojos del ratón después de la inducción de la anestesia para evitar el secado de la córnea.
3. La piel es cuidadosamente cortados por un área de piel de aproximadamente 150% mayor que el área de la zona de la aspiración previsto. Piel floja se elimina con una gasa húmeda. Por favor, mantenga el ratón sobre un relleno aislante de agua caliente que circula u otra superficie con control termostático de seguridad para prevenir la hipotermia durante el procedimiento.
4. Desinfectar la pierna entera que contiene el fémur, que se someterá a la aspiración con tres conjuntos de matorrales alterna (alternando con ya sea un povidona-yodo (Betadine) o una de clorhexidina (Nolvasan) de fregado y 70% de alcohol isopropílico o 70% de etanol empapado esponjas de gasa).
5. Moje un 0,5 ml de tuberculina jeringa (volumen: 0,5 cc; calibre: 27,5 G) con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS), antes de aspirar el BM. Llene la jeringa con 200-500 l de PBS y expulsar inmediatamente a la PBS. Repita este procedimiento 2-3 times.
6. Mantenga la inclinación de la tibia del fémur empujando la tibia, ya sea con el dedo anular o el dedo meñique. Confirme que un plano anestésico adecuado se ha alcanzado. La jeringa se lleva a cabo utilizando el pulgar y el dedo índice. Esto permite que los cóndilos a estar expuestos y facilita la inserción de la aguja.
7. Después de humedecer la jeringa, insertar la aguja a través del tendón rotuliano de manera que la aguja está alojada de forma segura entre los dos cóndilos del fémur. Por la celebración de la diáfisis cerca de la epífisis del fémur con el pulgar y el dedo índice, la aguja se inserta en el eje del fémur fácilmente.
8. Girar la aguja hacia fuera y hacia arriba de manera que es paralelo con el eje del fémur. Esta acción facilita la recuperación de los contenidos de la médula ósea del eje del fémur.
9. Gire la aguja hacia la derecha y hacia la izquierda mientras empuja lentamente en la cavidad medular femoral. Confirmar la colocación correcta de la aguja moviendo suavemente el SYRinge lateralmente.
10. Tire suavemente el émbolo de la aguja hacia atrás, creando una presión negativa, mientras se mueve la aguja de un lado a otro dentro de la cavidad del BM. Nota: El volumen de aspirado de BM será de aproximadamente 5 l que típicamente corresponde a 0,4-0,8 x 10 ⁶ células mononucleares. El éxito de aspiración será confirmada visualmente por la aparición de sangre en la parte superior de la aguja en la base de la jeringa. Si no hay sangre se ve en la jeringa es probable que un fragmento de hueso o tejido pequeña se ha quedado atascado en la aguja. Esto puede ser retirado de la aguja moviendo el émbolo hacia arriba y hacia abajo en PBS (esta es una razón por la jeringa debe ser previamente llenada con PBS antes de aspirar el BM). Si el tejido no puede ser desalojado de la jeringa, use una nueva aguja y jeringa (de nuevo mojar la jeringa con 200-500 l de PBS).
11. Una vez que BM se aspira con éxito del fémur, retire la aguja y la jeringa del fémur y el ratón.
12. Mueva aspirado BM a un pr tubo de microcentrífugaefilled con 500 l de PBS. Para la mayoría de las aplicaciones, las células de la MO entonces deben mantenerse en hielo hasta su procesamiento posterior, si es posible.
13. Tras la finalización del procedimiento, administrar analgésico con carprofeno 5 mg / kg por vía subcutánea. A continuación, retire del ratón de la anestesia y colocar en un cojín calentado hasta que se recupere completamente. NOTA: No debe haber ninguna complicación o sufrimiento experimentado tras el procedimiento de aspiración si se hace correctamente.
14. Antes de devolver los ratones con el área de vivienda, aseguran que son capaces de deambular y llegar a los alimentos y el agua. Observar los ratones en busca de signos de malestar o procedimiento después de la infección en la siguiente 24 horas. Las señales incluyen: sangrado constante, anemia, letargo. Si alguno de estos síntomas son vistos después del procedimiento, el animal (s) debe ser sacrificado. Nota: la aspiración BM / muestreo se puede repetir, pero la repetición del procedimiento se debe realizar en el fémur opuesto para evitar traumatismos repetidos en la misma pierna. Hay poca información disponible sobre la frequency que la aspiración BM se puede realizar. Aspiración de médula ósea femoral generalmente se repite con más frecuencia de cada 2 semanas.

2. Evaluación del contenido celular en células de aspirado BM

1. Precipitar las células recuperadas de BM aspiración y colocar en un tubo de microcentrífuga por centrifugación a 300 g durante 5 min a ^{4 °} C o RT.
2. Aspirar el sobrenadante y luego resuspender el sedimento en 500 l de ACK sangre roja tampón de lisis celular ("amonio-cloruro de potasio" tampón de lisis).
3. Se incuban las células en tampón de lisis de glóbulos rojos durante 10 min y a continuación, añadir 1 ml de PBS y centrifugar la mezcla de nuevo a 300 xg durante 5 min a 4 ^º C ^o temperatura ambiente. Nota: El pellet lisado de glóbulos rojos ahora consiste en células mononucleares de BM. Estos pueden ser resuspendidas para la tinción de FACS, el recuento de células, trasplante, análisis de citospina y / o cualquier otro uso (tal como se utilizarían las células BM recogidas de ratones sacrificados).

Resultados

Femoral BM aspiración de un ratón C57/B6 vivo se utilizó para obtener células mononucleares de BM seguido de la cosecha BM convencional del mismo ratón después del sacrificio. Células mononucleares BM obtenidos por los dos métodos fueron analizadas mediante (1) el análisis citológico de células de la MO, (2) determinar la frecuencia relativa de células madre / progenitoras hematopoyéticas (HSPCs), y (3) el cultivo ex vivo de HSPCs ordenados. En el experimento, Sca1 de linaje negativo últi...

Discusión

De serie aspiración BM es un procedimiento de rutina crítica para investigación clínica de los trastornos hematológicos en seres humanos. La capacidad de realizar un muestreo en serie análoga de BM en ratones para la caracterización de la composición celular y componentes de la BM a lo largo de largos experimentos es también muy valiosa. Este procedimiento es útil para la caracterización de HSPC de sin sacrificar el ratón, sino también para detectar la presencia de tipos de células adicionales en el BM en ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	PAA	H15-002
Bovine serum albumin	PAA	K41-001
ACK lysis buffer	Homemade		in 1 L. Adjust pH 7.2 ~ 7.4 and filter sterile with 0.22 μm vacuum filter.
8.3 g Ammonium chloride	Fisher Scientific	A661-500
1 g Potassium bicarbonate	Fisher Scientific	P184-500
200 μl 0.5 M EDTA pH 8	Gibco	15575-038
RPMI 1640	PAA	E15-842
0.5 ml Tuberculin syringe 27.5 G	Becton Dickinson	305620
Sterile cell strainer 70 μm	Fisher Scientific	22363548
Isoflurane, USP	Attane	NDC:66794-014-25
Blunt-end needle	Stemcell Technologies	28110
PrecisionGlide needle 23 G	Becton Dickinson	305193
3 ml Syringe Luer-Lok tip	Becton Dickinson	309657
Non-tissue culture treated plate, 6 Well	Becton Dickinson	351146
12 x 75 mm 5 ml tubes	Becton Dickinson	352054	FACS staining
12 x 75 mm 5 ml tubes with cell-strainer cap	Becton Dickinson	352235	FACS staining
NK1.1 APC-Cy7	Biolegend	108723
CD11b APC-Cy7	Biolegend	101225
CD45R (B220) APC-Cy7	Biolegend	103223
CD3 APC-Cy7	Biolegend	100222
Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7	Biolegend	108423
Ter119 APC-Cy7	Biolegend	116223
CD19 APC-Cy7	Biolegend	302217
CD4 APC-Cy7	BioLegend	317417
CD117 (c-KIT) PE	BioLegend	105808
Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7	Biolegend	122513
CD34 APC	Biolegend	128612
CD16/32 e450	eBioscience	48-0161-82
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	32670
MethoCult GF M3434	STEMCELLTECHNOLOGIES	3434	For methocellulose culture
Carprofen	Crescent Chemical Company	C11045850	1 dose (5mg/kg)
Flow cytometer, LSRFortessa	Becton Dickinson
Puralube vet ointment (sterile petrolatum ophthalmic ointment)	Dechra-US	17033-211-38