生きたマウスにおける大腿骨髄吸引

要約

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

要約

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

概要

All blood cells are derived from hematopoietic stem cells (HSCs). Procedures which allow access to the bone marrow (BM), the site of the vast majority of HSC’s in mice and men, without requiring sacrifice of animals, provide a resource to monitor the source of hematopoiesis serially. The overall goal of the procedure described here is to provide a detailed protocol for the sampling of BM cells from the femur of live mice which provides material representative of the cells which would be retrieved by conventional harvest of BM cells through sacrifice of the mice. The advantage of this procedure over conventional harvest of BM cells is that this procedure does not require the sacrifice of mice and therefore allows for longitudinal study of the bone marrow compartment of mice over time.

Although this murine bone marrow aspiration procedure has been used in a number of studies and described previously (see Sundberg et al. for a historical review¹), formal step-by-step procedures illustrating this technique have not been previously published. This protocol enables routine serial sampling of the BM for purposes such as assessing engraftment in the BM of cells exogenously introduced into the mouse (as would be done in xenograft studies for instance^2,3), analysis of chimerism in the BM for comparison with that of the peripheral blood (where results are not necessarily congruent), monitoring the abundance of specific cell types normally enriched in the marrow such as hematopoietic stem and progenitor cells, and retrieval of BM cells for ex vivo culture and/or transplantation. In addition, evaluation of marrow contents may be very useful in murine models of hematological disease as aspiration is helpful in assessing hematological disease burden at time points when disease may not be evident in the peripheral blood^3-5. Moreover, this technique may be used to evaluate response of hematologic disease in the marrow to drugs administered in therapeutic studies. Thus, the procedure described here is ideal for investigators wishing to obtain access to bone marrow hematopoietic cells from mice for cytological analysis, flow cytometric analysis, in vitro culturing, and/or in vivo transplantation studies without requiring sacrifice or harm to the mice.

The protocol for sampling of BM described here is quite similar to the technique used for intra-femoral injection of material directly into the marrow cavity^3,6. The key difference being that this protocol details the procedure for removal of cells from the marrow as opposed to instilling material directly into the marrow cavity space as is done with intrafemoral injection.

プロトコル

このプロトコルで説明されているすべての動物の手順は、実験動物の管理と使用に関する指針に従って実施された、メモリアルスローンケタリングがんセンターの施設内動物管理使用委員会（IACUCs）により承認された。

大腿骨から骨髄の1。吸引（BM）細胞

1. 精密気化器を用いて投与イソフルラン（1-4％）で大腿骨髄穿刺を受けるマウスを麻酔。麻酔の深さは、外科的処置および/または耳、足指、および尾部ピンチに関連付けられた呼吸数に変化がないことを観察することによって、プロシージャ中のあらゆる5〜10分を監視すべきである。麻酔はイソフルランで誘導し、また、イソフルランによる手順を通して維持されている。 0.05〜0.1ミリグラムの用量でブプレノルフィンの先制事前手続き線量は/ kgを皮下に、すべての6から12時間は、ADJのような手順に関連する痛みを防止するために使用することができますカルプロフェンにUNCT。
2. 角膜の乾燥を防ぐために、麻酔の導入後のマウスの眼に眼軟膏を適用します。
3. 毛皮を慎重に意図された吸引部位の面積よりも約150％大きく皮膚の領域から切り取られます。緩い毛皮は、湿ったガーゼパッドを用いて除去する。手順の間に低体温症を防ぐために、循環温水パッドまたは他の安全なサーモスタット制御された表面上でマウスを保管してください。
4. （ポビドンヨード（ベタジン）またはクロルヘキシジン（Nolvasan）スクラブと70％イソプロピルアルコール、70％エタノールに浸したガーゼスポンジのいずれかと交互に）スクラブが交互に3組の吸引を受ける大腿骨を含む足全体を消毒する。
5. BMを吸引する前に、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄：;：0.5ミリリットルツベルクリンシリンジ（27.5 Gゲージ0.5ccの体積）を濡らす。のPBS 200〜500μlの注射器を記入し、すぐに、PBSを追放。 2〜3トンにこの手順を繰り返しますのIME。
6. 薬指や小指のいずれかで脛骨を押すことによって大腿骨から脛骨を曲げておく。適切な麻酔面が達成されたことを確認してください。シリンジを親指と人差し指を使用して保持される。これは、顆を露出させることを可能にし、針の挿入を容易にする。
7. 針が大腿骨の2顆の間でセキュアに提出されるように、注射器を湿らせた後、膝蓋腱を通して針を挿入します。親指と人​​差し指で、大腿骨の骨端に近い骨幹を保持することによって、針は簡単に大腿骨のシャフトに挿入されている。
8. それは大腿骨の軸に平行になるように外向き、上向き針を旋回さ。このアクションは、大腿骨シャフトからの骨髄の内容の検索を容易にします。
9. 大腿骨髄腔にゆっくりと押しながら、針を時計回りと反時計回りに回します。優しくSYを移動して、針の正確な位置決めを確認横方向にringe。
10. BMキャビティ内に前後に針を移動させながら、優しく、負圧にする、後針プランジャーを引く。注：BM吸引量は、一般的に0.4〜0.8×10 ⁶の単核細胞に相当し、約5μLになります。成功吸引は注射器の基部に針の上での血液の出現によって、視覚的に確認される。まだ血液がシリンジ内に見られない場合、それは小さな骨または組織片が針に貼り付けられている可能性がある。これは、（これはシリンジBM吸引する前にPBSで予め充填されるべきである1つの理由で）PBSで上下プランジャを移動させることにより、針から除去することができる。組織がシリンジから外れできない場合は、新しい針と注射器を（再びのPBS 200〜500μlの注射器を濡らし）を使用します。
11. BMが正常大腿骨から吸引された後、大腿骨やマウスから針と注射器を取り外します。
12. マイクロチューブPRに吸引BMを移動500μlのPBSでefilled。ほとんどのアプリケーションでは、BM細胞を、可能であればさらなる処理まで氷上で保存する。
13. 手続きの完了に続いて、5 mg / kgの皮下カルプロフェンと鎮痛剤を投与し。その後、麻酔からマウスを削除し、完全に回復するまで加熱パッドの上に置きます。注記：正しく行われれば吸引手順に従って経験しない合併症や苦痛があってはならない。
14. 住宅エリアにマウスを返す前に、彼らが歩き回ると食料や水に到達できることを確認してください。次の24時間での苦痛や感染後の手続きの兆候マウスを観察します。兆候としては、以下が挙げられる：定数出血、貧血、無気力を。これらの徴候のいずれかが後の手順を見ている場合は、動物（S）は、安楽死させなければならない。注：BM吸引/サンプリングを繰り返すことができるが、反復手順は同じ脚に繰り返される外傷を防ぐために反対側の大腿骨に対して行われるべきである。 FRに関する入手可能な情報はほとんどないBM吸引を行うことができるequency。大腿骨髄穿刺は、一般的にこれ以上の頻度で2週間ごとよりも繰り返される。

吸引しBM細胞における細胞含有量の2。評価

1. 4 ^O Cまたは室温で5分間300×gで遠心分離することによりマイクロチューブ内のBM吸引や場所から検索された細胞をペレット化。
2. 上清を吸引してから、ACK赤血球細胞溶解バッファー（「塩化アンモニウムカリウム「溶解バッファー）500μl中にペレットを再懸濁します。
3. 10分間、赤血球溶解緩衝液中で細胞をインキュベートし、次いで1mlのPBSを添加し^、4°Cの 、またはRTで5分間300×gで再び混合物をスピンダウンする。注意：赤血球を溶解ペレットは現在のBM単核細胞で構成されています。これらは、（屠殺したマウスから採取BM細胞が使用されるのと同様に）FACS染色、細胞計数、移植、サイトスピン分析および/または任意の他の使用のために再懸濁させることができる。

結果

ライブC57/B6マウスの大腿BM吸引犠牲後の同じマウスのBM従来の収穫に続くBM単核細胞を得るために利用された。 2つの方法によって得られたBM単核細胞を、次いで、BM細胞（1）細胞学的分析によって分析し、（2）造血幹/前駆細胞の相対頻度（HSPCs）を決定し、ソートHSPCs（3）ex vivoで培養した。後者の実験では、系統陰性のSca1 + C-KIT +（LSK）細胞は、骨髄吸引によってだけでなく、従来のBM...

ディスカッション

シリアルのBM吸引は、ヒトの血液疾患の臨床研究に不可欠な日常的な手順である。長時間の実験を通して、BMの細胞組成および成分の特徴付けマウスでは、BMの類似シリアルサンプリングを実行する能力は、同様に非常に貴重なものです。この手順では、マウスを犠牲にせずにも、末梢血の内容はBMに存在する細胞が反射性でなくてもよい場合においてBM中の追加の細胞型の存在を検出するため...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	PAA	H15-002
Bovine serum albumin	PAA	K41-001
ACK lysis buffer	Homemade		in 1 L. Adjust pH 7.2 ~ 7.4 and filter sterile with 0.22 μm vacuum filter.
8.3 g Ammonium chloride	Fisher Scientific	A661-500
1 g Potassium bicarbonate	Fisher Scientific	P184-500
200 μl 0.5 M EDTA pH 8	Gibco	15575-038
RPMI 1640	PAA	E15-842
0.5 ml Tuberculin syringe 27.5 G	Becton Dickinson	305620
Sterile cell strainer 70 μm	Fisher Scientific	22363548
Isoflurane, USP	Attane	NDC:66794-014-25
Blunt-end needle	Stemcell Technologies	28110
PrecisionGlide needle 23 G	Becton Dickinson	305193
3 ml Syringe Luer-Lok tip	Becton Dickinson	309657
Non-tissue culture treated plate, 6 Well	Becton Dickinson	351146
12 x 75 mm 5 ml tubes	Becton Dickinson	352054	FACS staining
12 x 75 mm 5 ml tubes with cell-strainer cap	Becton Dickinson	352235	FACS staining
NK1.1 APC-Cy7	Biolegend	108723
CD11b APC-Cy7	Biolegend	101225
CD45R (B220) APC-Cy7	Biolegend	103223
CD3 APC-Cy7	Biolegend	100222
Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7	Biolegend	108423
Ter119 APC-Cy7	Biolegend	116223
CD19 APC-Cy7	Biolegend	302217
CD4 APC-Cy7	BioLegend	317417
CD117 (c-KIT) PE	BioLegend	105808
Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7	Biolegend	122513
CD34 APC	Biolegend	128612
CD16/32 e450	eBioscience	48-0161-82
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	32670
MethoCult GF M3434	STEMCELLTECHNOLOGIES	3434	For methocellulose culture
Carprofen	Crescent Chemical Company	C11045850	1 dose (5mg/kg)
Flow cytometer, LSRFortessa	Becton Dickinson
Puralube vet ointment (sterile petrolatum ophthalmic ointment)	Dechra-US	17033-211-38