라이브 쥐의 대퇴부 골수 흡인

요약

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

초록

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

서문

All blood cells are derived from hematopoietic stem cells (HSCs). Procedures which allow access to the bone marrow (BM), the site of the vast majority of HSC’s in mice and men, without requiring sacrifice of animals, provide a resource to monitor the source of hematopoiesis serially. The overall goal of the procedure described here is to provide a detailed protocol for the sampling of BM cells from the femur of live mice which provides material representative of the cells which would be retrieved by conventional harvest of BM cells through sacrifice of the mice. The advantage of this procedure over conventional harvest of BM cells is that this procedure does not require the sacrifice of mice and therefore allows for longitudinal study of the bone marrow compartment of mice over time.

Although this murine bone marrow aspiration procedure has been used in a number of studies and described previously (see Sundberg et al. for a historical review¹), formal step-by-step procedures illustrating this technique have not been previously published. This protocol enables routine serial sampling of the BM for purposes such as assessing engraftment in the BM of cells exogenously introduced into the mouse (as would be done in xenograft studies for instance^2,3), analysis of chimerism in the BM for comparison with that of the peripheral blood (where results are not necessarily congruent), monitoring the abundance of specific cell types normally enriched in the marrow such as hematopoietic stem and progenitor cells, and retrieval of BM cells for ex vivo culture and/or transplantation. In addition, evaluation of marrow contents may be very useful in murine models of hematological disease as aspiration is helpful in assessing hematological disease burden at time points when disease may not be evident in the peripheral blood^3-5. Moreover, this technique may be used to evaluate response of hematologic disease in the marrow to drugs administered in therapeutic studies. Thus, the procedure described here is ideal for investigators wishing to obtain access to bone marrow hematopoietic cells from mice for cytological analysis, flow cytometric analysis, in vitro culturing, and/or in vivo transplantation studies without requiring sacrifice or harm to the mice.

The protocol for sampling of BM described here is quite similar to the technique used for intra-femoral injection of material directly into the marrow cavity^3,6. The key difference being that this protocol details the procedure for removal of cells from the marrow as opposed to instilling material directly into the marrow cavity space as is done with intrafemoral injection.

프로토콜

이 프로토콜에 설명 된 모든 동물의 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 실시하고, 메모 리얼 슬로안 - 케터링 암 센터의 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUCs)에 의해 승인되었다.

대퇴골에서 골수의 1. 흡인 (BM) 세포

1. 정밀 기화기 투여 이소 플루 란 (1-4 %)과 대퇴 골수 흡인을 받게 될 것이다 마우스를 마취. 마취 심도가 수술 조작 및 / 또는 귀, 발가락, 테일 핀치와 관련된 호흡에 변화가없는 것을 관찰함으로써 절차 내내 매 50-10 분을 모니터해야한다. 마취는 이소 플루 란으로 유도하고 또한 이소 플루 란과 절차를 통해 유지된다. 0.05-0.1 밀리그램의 부 프레 노르 핀 투여 량의 선제 사전 절차 용량 / kg 피하 매 6-12 시간은 ADJ로 절차와 관련된 통증을 방지하는데 사용될 수있다Carprofen에 unct.
2. 각막 건조를 방지하기 위해 마취의 마우스 다음 유도의 눈 안과 연고를 적용합니다.
3. 모피는 신중하게 의도 열망 사이트의 면적보다 약 150 % 더 큰 피부의 영역에서 잘립니다. 느슨한 모피는 촉촉한 거즈 패드로 제거됩니다. 절차를 수행하는 동안 저체온증을 방지하기 위해 순환 온수 패드 또는 다른 안전한 온도 조절 장치로 통제 된 표면에서 마우스를 보관하십시오.
4. (포비돈 요오드 (베타 딘) 또는 클로르헥시딘 (Nolvasan) 스크럽 70 % 이소 프로필 알코올이나 70 % 에탄올을 적신 거즈 스폰지 하나와 교류) 교류 수술의 세 가지 세트로 포부를 받게 될 것이다 대퇴골을 포함하는 전체 다리를 소독.
5. BM을 흡입하기 전에 멸균 인산 완충 생리 식염수 (PBS)으로 :; : 0.5 ㎖ 투베르쿨린 주사기 (27.5 G 게이지 0.5 cc의 볼륨)을 적 십니다. PBS의 200 ~ 500 ㎕ 씩 주사기를 입력하고 즉시 PBS를 추방. 이 절차 2-3t를 반복IME를.
6. 반지 손가락 또는 다섯 번째 손가락 하나와 경골을 눌러 대퇴골에서 경골의 굴곡을 유지합니다. 적절한 마취 비행기가 달성되었는지 확인합니다. 주사기는 엄지와 집게 손가락을 사용하여 유지된다. 이는 관절 구가 노광 될 수 있도록하고 바늘의 삽입을 용이하게한다.
7. 바늘이 대퇴골 두 관절 구 사이에 단단히 박혀되도록 주사기를 적시 한 후, 슬개를 통해 바늘을 삽입합니다. 엄지 손가락과 집게 손가락으로 대퇴골 골단 부근 골간을 유지함으로써, 바늘이 쉽게 대퇴골의 샤프트에 삽입된다.
8. 이 대퇴골 축과 평행이되도​​록 외측으로 상향 바늘 스위블. 이 작업은 대퇴골 축에서 골수 내용의 검색을 용이하게한다.
9. 대퇴 골수 구멍으로 천천히 누르면서 시계 반대 방향으로 바늘을 시계 방향으로 돌려. 온화 싸이 이동하여 바늘의 정확한 위치 확인옆으로 ringe.
10. 앞뒤로 BM 캐비티 내에서 바늘을 이동하는 동안 부드럽게, 부정 압력을 생성, 다시 바늘 플런저를 잡아 당깁니다. 주 : 흡입 된 BM의 부피는 일반적으로 0.4-0.8 × ¹⁰⁶ 단핵 세포에 상당 약 5 μL 것이다. 성공 열망은 주사기의 기지에있는 바늘의 위쪽에있는 혈액의 모양을 시각적으로 확인 될 것이다. 피가 주사기에서 볼 경우 그것은 작은 뼈 또는 조직 조각이 바늘에 걸린 가능성이 높습니다. 이것은 (이것은 주사기 BM 흡입 전에 PBS로 채워져해야 하나의 이유이다) PBS에 상하 플런저를 이동함으로써 바늘로부터 제거 될 수있다. 조직이 주사기로부터 빠질 수없는 경우, 새로운 바늘과 주사기 (다시 PBS의 200-500 μL와 주사기를 젖은 상태) 사용.
11. BM이 성공적으로 대퇴골에서 흡입되면, 대퇴골 및 마우스에서 바늘과 주사기를 제거합니다.
12. 의 미세 튜브 홍보에 흡입 된 BM 이동PBS 500 μL와 efilled. 대부분의 응용 프로그램, BM 세포는 추가 처리를 가능하면 때까지 얼음에 보관해야합니다.
13. 절차의 완료 후, 5 ㎎ / ㎏ 피하 carprofen으로 진통을 관리 할 수​​ 있습니다. 그 후 마취에서 마우스를 제거하고 완전히 회복 될 때까지 가열 패드에 배치합니다. 참고 : 만약 제대로 흡입 절차에 따라 경험 합병증이나 고통이 없어야합니다.
14. 주택 지역에 마우스를 반환하기 전에, 그들은 음식과 물을 ambulate 및 도달 할 수 있는지. 다음 24 시간에 고통이나 감염 후 절차의 징후 쥐를 관찰합니다. 증상은 다음을 포함한다 : 지속적인 출혈, 빈혈, 혼수를. 이러한 징후는 포스트 절차를 보이는 경우, 동물 (들) 안락사한다. 주 : BM 흡입 / 샘플링을 반복 할 수 있지만 반복 절차는 동일 다리 반복 외상을 방지하기 위해 대향 대퇴골을 수행하여야한다. FR에 대한 가능한 약간의 정보가있다equency 그 BM 열망을 수행 할 수 있습니다. 대퇴 골수 흡입은 일반적으로 더 자주 매 2 주 이상 반복되지 않습니다.

으로 발음 BM 세포의 세포 내용의 2. 평가

1. 4 ^O를 C 또는 RT에서 5 분 300 XG에서 원심 분리하여 미세 원심 분리 튜브에 BM 열망과 장소에서 검색 펠렛 세포.
2. 뜨는을 대기음 후 ACK 적혈구 세포 용해 버퍼 ( "암모늄, 염화 칼륨,"용해 버퍼) 500 μL에 펠렛을 재현 탁.
3. 10 분 동안 적혈구 용해 완충액에 세포를 부화 후 PBS 1 ㎖를 추가하고 4 ^입출력 C 또는 RT에서 5 분 동안 300 XG에 다시 혼합물을 스핀 다운. 참고 : 적혈구 용해 펠릿 지금 BM 단핵 세포로 구성되어 있습니다. 이들은 FACS 염색, 세포 계수, 이식, cytospin 분석 및 / 또는 기타 사용 (희생 생쥐에서 수확 BM 세포를 사용하는 것처럼)에 재현 탁 할 수있다.

결과

라이브 C57/B6 마우스의 대퇴골 BM 흡입은 희생 후의 같은 종래의 마우스 BM 수확 하였다 BM 단핵 세포를 수득하는 데에 이용 하였다. 이 방법에 의해 얻어진 BM 단핵 세포이어서, BM 세포 (1) 세포 학적 분석에 의해 분석 (2) 조혈 줄기 / 전구 세포의 상대적인 주파수 (HSPCs)를 결정하고, 소트 HSPCs (3) 체외 배양 하였다. 후자의 실험, 혈통 부정적인 SCA1 + C-KIT에서 + (LSK) 세포는 BM 흡인에 의해뿐만 아니...

토론

직렬 BM 열망은 인간의 혈액 학적 장애의 임상 연구에 중요한 일상적인 절차입니다. 긴 실험을 통하여 세포의 구성 및 BM의 성분의 특성에 마우스에서 BM의 유사한 일련의 샘플링을 수행 할 수있는 능력 역시 매우 중요합니다. 이 절차는 마우스를 희생하지 않고 또한 말초 혈액의 내용이 BM에 거주하는 세포의 반사되지 않을 수 인스턴스에서 BM있는 추가적인 세포 유형의 존재를 검출하기위한 HSPC의 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	PAA	H15-002
Bovine serum albumin	PAA	K41-001
ACK lysis buffer	Homemade		in 1 L. Adjust pH 7.2 ~ 7.4 and filter sterile with 0.22 μm vacuum filter.
8.3 g Ammonium chloride	Fisher Scientific	A661-500
1 g Potassium bicarbonate	Fisher Scientific	P184-500
200 μl 0.5 M EDTA pH 8	Gibco	15575-038
RPMI 1640	PAA	E15-842
0.5 ml Tuberculin syringe 27.5 G	Becton Dickinson	305620
Sterile cell strainer 70 μm	Fisher Scientific	22363548
Isoflurane, USP	Attane	NDC:66794-014-25
Blunt-end needle	Stemcell Technologies	28110
PrecisionGlide needle 23 G	Becton Dickinson	305193
3 ml Syringe Luer-Lok tip	Becton Dickinson	309657
Non-tissue culture treated plate, 6 Well	Becton Dickinson	351146
12 x 75 mm 5 ml tubes	Becton Dickinson	352054	FACS staining
12 x 75 mm 5 ml tubes with cell-strainer cap	Becton Dickinson	352235	FACS staining
NK1.1 APC-Cy7	Biolegend	108723
CD11b APC-Cy7	Biolegend	101225
CD45R (B220) APC-Cy7	Biolegend	103223
CD3 APC-Cy7	Biolegend	100222
Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7	Biolegend	108423
Ter119 APC-Cy7	Biolegend	116223
CD19 APC-Cy7	Biolegend	302217
CD4 APC-Cy7	BioLegend	317417
CD117 (c-KIT) PE	BioLegend	105808
Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7	Biolegend	122513
CD34 APC	Biolegend	128612
CD16/32 e450	eBioscience	48-0161-82
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	32670
MethoCult GF M3434	STEMCELLTECHNOLOGIES	3434	For methocellulose culture
Carprofen	Crescent Chemical Company	C11045850	1 dose (5mg/kg)
Flow cytometer, LSRFortessa	Becton Dickinson
Puralube vet ointment (sterile petrolatum ophthalmic ointment)	Dechra-US	17033-211-38