Canlı Farelerde Femoral Kemik İliği Aspirasyon

Özet

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Özet

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

Giriş

All blood cells are derived from hematopoietic stem cells (HSCs). Procedures which allow access to the bone marrow (BM), the site of the vast majority of HSC’s in mice and men, without requiring sacrifice of animals, provide a resource to monitor the source of hematopoiesis serially. The overall goal of the procedure described here is to provide a detailed protocol for the sampling of BM cells from the femur of live mice which provides material representative of the cells which would be retrieved by conventional harvest of BM cells through sacrifice of the mice. The advantage of this procedure over conventional harvest of BM cells is that this procedure does not require the sacrifice of mice and therefore allows for longitudinal study of the bone marrow compartment of mice over time.

Although this murine bone marrow aspiration procedure has been used in a number of studies and described previously (see Sundberg et al. for a historical review¹), formal step-by-step procedures illustrating this technique have not been previously published. This protocol enables routine serial sampling of the BM for purposes such as assessing engraftment in the BM of cells exogenously introduced into the mouse (as would be done in xenograft studies for instance^2,3), analysis of chimerism in the BM for comparison with that of the peripheral blood (where results are not necessarily congruent), monitoring the abundance of specific cell types normally enriched in the marrow such as hematopoietic stem and progenitor cells, and retrieval of BM cells for ex vivo culture and/or transplantation. In addition, evaluation of marrow contents may be very useful in murine models of hematological disease as aspiration is helpful in assessing hematological disease burden at time points when disease may not be evident in the peripheral blood^3-5. Moreover, this technique may be used to evaluate response of hematologic disease in the marrow to drugs administered in therapeutic studies. Thus, the procedure described here is ideal for investigators wishing to obtain access to bone marrow hematopoietic cells from mice for cytological analysis, flow cytometric analysis, in vitro culturing, and/or in vivo transplantation studies without requiring sacrifice or harm to the mice.

The protocol for sampling of BM described here is quite similar to the technique used for intra-femoral injection of material directly into the marrow cavity^3,6. The key difference being that this protocol details the procedure for removal of cells from the marrow as opposed to instilling material directly into the marrow cavity space as is done with intrafemoral injection.

Protokol

Bu protokolü açıklanan tüm hayvan prosedürleri Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Rehber uyarınca yapılmıştır ve Memorial Sloan-Kettering Kanser Merkezi'nde Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUCs) tarafından onaylanmıştır.

Femur Kemik İliği 1. Aspirasyon (BM) Hücreler

1. Hassas bir buharlaştırıcı ile uygulanan izofluran (% 1-4) ile femur kemik iliği aspirasyonu geçirecek fare anestezisi. Anestezi derinliği cerrahi manipülasyon ve / veya kulak, ayak ve kuyruk tutam ile ilişkili solunum hızında herhangi bir değişiklik olmadığını gözlemleyerek işlem boyunca her 5-10 dk izlenmelidir. Anestezi izofluran ile indüklenen ve izofluran ile işlem boyunca korunur. 0.05-0.1 mg bir dozda buprenorfin bir rüçhan işlem öncesi doz / kg deri altından, her 6-12 saatte bir adj tarif edilen prosedür ile bağlantılı ağrıyı önlemek için kullanılabilirCarprofen için UNCT.
2. Kornea kurumasını önlemek için anestezi fare aşağıdaki indüksiyon gözleri oftalmik merhem sürün.
3. Kürk dikkatli bir şekilde amaçlanan aspirasyon sitenin alanından daha yaklaşık olarak% 150 daha büyük bir deri bölgesinden kırpılır. Gevşek kürk nemli bir gazlı bezle kaldırılır. İşlem sırasında hipotermi önlemek için dolaşan sıcak su yastığı veya başka güvenli bir termostatik kontrol yüzeyi üzerinde fareyi tutun lütfen.
4. (Povidon-iyot (Betadinede) veya klorheksidin (Nolvasan) çalılık ve% 70 izopropil alkol veya% 70 etanol batırılmış gazlı bez ve sünger ile ya dönüşümlü) alternatif scrubs üç set ile aspirasyon geçirecek femur içeren tüm bacak dezenfekte edin.
5. BM aspirasyon önce steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile:,: 0.5 ml tüberkülin şırınga (27.5 G ölçer 0.5 cc hacim) ıslatın. PBS 200-500 ul şırınga doldurun ve hemen PBS kovmak. Bu işlem 2-3 t tekrarlayınimes.
6. Yüzük parmağı veya beşinci parmak biriyle tibia iterek femur tibia bükük tutun. Uygun anestezi uçak elde edildiğini teyit. Şırınga başparmak ve işaret parmağı kullanılarak yapılır. Bu kondil maruz sağlar ve iğnenin yerleştirilmesini kolaylaştırır.
7. İğne femur iki kondillerin arasında güvenli bir şekilde açılmış, böylece şırınga ıslatma sonra patellar tendon boyunca iğne takın. Baş parmak ve işaret parmağı ile femur epifiz yakın gövdesini tutarak, iğne kolayca femur şaft içine sokulur.
8. Bu femur şaft ile paralel olacak şekilde dışarı ve yukarı doğru iğne çevirin. Bu eylem, femur milinden kemik iliği içeriğinin alma kolaylaştırır.
9. Femoral kemik iliği boşluğuna yavaşça iterken saat yönünün iğne saat yönünde çevirin ve. Nazikçe sy hareket ettirerek iğnenin doğru konumlandırılmasını onaylayınyanal Ringe.
10. Ileri ve geri BM boşluğu içinde iğne hareket ederken nazikçe, negatif basınç oluşturarak, geri iğne pistonu çekin. Not: BM aspire hacmi, tipik olarak 0.4-0.8 x 10 ^6, tek çekirdekli hücreler karşılık gelen yaklaşık 5 ul olacaktır. Başarılı aspirasyon şırınganın tabanında iğnenin üst kan görünümü görsel olarak teyit edilecektir. Kan şırıngaya görülür ise küçük bir kemik veya doku parçası iğne kalmış olması muhtemeldir. Bu, (bu, şırınga BM aspire önce PBS ile doldurulmuş olmalıdır bir nedeni de budur), PBS içinde yukarı ve aşağı hareket eden piston ile iğne kaldırılabilir. Doku şırınga yerinden olamaz, yeni bir iğne ve şırınga (tekrar PBS 200-500 ul şırınga ıslak) kullanın.
11. BM başarıyla femur aspire edildikten sonra, femur ve fareden iğne ve şırınga çıkarın.
12. Bir mikrofuge'de tüp pr aspire BM Taşı500 ul PBS ile efilled. Bir çok uygulama için, BM Hücreler daha sonra daha fazla işlem mümkünse kadar buz üzerinde tutulmalıdır.
13. İşlemin tamamlanmasından sonra, 5 mg / kg deri altından karprofen ile analjezik yönetmek. Sonra anestezi fareyi kaldırmak ve tamamen iyileşti kadar ısıtılmış bir yastık üzerine yerleştirin. NOT: düzgün yapılmazsa eğer aspirasyon prosedürü izleyerek deneyimli hiçbir komplikasyon veya sıkıntı olmamalıdır.
14. Konut alanına fareler dönmeden önce, yiyecek ve su yürümelerine ve ulaşabiliyorlar sağlamak. Sonraki 24 saat içinde sıkıntı ya da enfeksiyon sonrası prosedür belirtileri fareler gözlemleyin. Belirtileri şunlardır: sürekli kanama, anemi, uyuşukluk. Bu belirtilerden herhangi sonrası prosedürü görülürse, hayvan (lar) ötenazi olmalı. Not: BM aspirasyon / numune tekrar edilebilir, ancak tekrar prosedür aynı bacağa tekrar travma önlemek için karşı femur üzerinde gerçekleştirilmelidir. Fr ile ilgili çok az bilgi vardırequency ki BM aspirasyon yapılabilir. Femoral Kemik iliği aspirasyonu genellikle artık daha sık her 2 haftadan daha tekrarlanır.

Emişli BM hücrelerinde hücresel İçerik 2. Değerlendirilmesi

1. 4 ^o C ya da oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile bir mikrofüj tüpüne BM aspirasyon ve yerden alınan Pelet hücreleri.
2. Süpernatan aspire ve ACK alyuvar lisiz tamponu ("amonyum-klorür, potasyum-" lizis tamponu) içinde 500 ul pelletini.
3. 10 dakika boyunca, kırmızı hücre lisis tamponu hücreleri inkübe edin ve daha sonra PBS içinde 1 ml ekleyin ve ^o 4 C ya da oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g hızında tekrar karışımı aşağı doğru döndürün. Not: Kırmızı kan hücresi lize topağı hemen BM mononükleer hücrelerden oluşur. Bu FACS boyaması, hücre sayımı, transplantasyon, sitospin analiz ve / veya herhangi bir başka kullanım (öldürülür farelerden toplanan BM hücrelerinin kullanılacak gibi) için yeniden süspanse edilebilir.

Sonuçlar

Canlı bir C57/B6 fare femur BM aspirasyon kurban etme işleminden sonra, aynı fare BM geleneksel hasat ardından BM mononükleer hücreleri elde etmek için kullanılmıştır. Her iki yöntem ile elde edilen BM mononükleer hücreleri daha sonra, BM hücrelerinin (1), sitolojik analizi ile analiz (2) hematopoietik kök / progenitör hücrelerin nispi frekansı (HSPCs) belirlenmesi ve sıralanmış HSPCs (3) ex vivo kültür edilmiştir. Ikinci deney, soy-negatif SCA1 + c-KIT In + (LSK'ya) hücreleri BM a...

Tartışmalar

Seri BM aspirasyon insanlarda hematolojik hastalıkların klinik araştırma için kritik bir rutin bir işlemdir. Uzun deneyler boyunca hücresel bileşiminde ve BM bileşenlerinin karakterizasyonu için farelerde DM'nin benzer bir seri örnekleme gerçekleştirme yeteneği aynı şekilde çok değerlidir. Bu prosedür, fare ödün vermeden, aynı zamanda periferik kan içeriği BM yaşayan hücrelerin yansıtıcı olmayabilir durumda BM ek hücre tiplerinin varlığını tespit etmek için HSPC en karakterizasyonu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	PAA	H15-002
Bovine serum albumin	PAA	K41-001
ACK lysis buffer	Homemade		in 1 L. Adjust pH 7.2 ~ 7.4 and filter sterile with 0.22 μm vacuum filter.
8.3 g Ammonium chloride	Fisher Scientific	A661-500
1 g Potassium bicarbonate	Fisher Scientific	P184-500
200 μl 0.5 M EDTA pH 8	Gibco	15575-038
RPMI 1640	PAA	E15-842
0.5 ml Tuberculin syringe 27.5 G	Becton Dickinson	305620
Sterile cell strainer 70 μm	Fisher Scientific	22363548
Isoflurane, USP	Attane	NDC:66794-014-25
Blunt-end needle	Stemcell Technologies	28110
PrecisionGlide needle 23 G	Becton Dickinson	305193
3 ml Syringe Luer-Lok tip	Becton Dickinson	309657
Non-tissue culture treated plate, 6 Well	Becton Dickinson	351146
12 x 75 mm 5 ml tubes	Becton Dickinson	352054	FACS staining
12 x 75 mm 5 ml tubes with cell-strainer cap	Becton Dickinson	352235	FACS staining
NK1.1 APC-Cy7	Biolegend	108723
CD11b APC-Cy7	Biolegend	101225
CD45R (B220) APC-Cy7	Biolegend	103223
CD3 APC-Cy7	Biolegend	100222
Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7	Biolegend	108423
Ter119 APC-Cy7	Biolegend	116223
CD19 APC-Cy7	Biolegend	302217
CD4 APC-Cy7	BioLegend	317417
CD117 (c-KIT) PE	BioLegend	105808
Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7	Biolegend	122513
CD34 APC	Biolegend	128612
CD16/32 e450	eBioscience	48-0161-82
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	32670
MethoCult GF M3434	STEMCELLTECHNOLOGIES	3434	For methocellulose culture
Carprofen	Crescent Chemical Company	C11045850	1 dose (5mg/kg)
Flow cytometer, LSRFortessa	Becton Dickinson
Puralube vet ointment (sterile petrolatum ophthalmic ointment)	Dechra-US	17033-211-38