Костном мозге бедра Стремление в живых мышей

Резюме

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Аннотация

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

Введение

All blood cells are derived from hematopoietic stem cells (HSCs). Procedures which allow access to the bone marrow (BM), the site of the vast majority of HSC’s in mice and men, without requiring sacrifice of animals, provide a resource to monitor the source of hematopoiesis serially. The overall goal of the procedure described here is to provide a detailed protocol for the sampling of BM cells from the femur of live mice which provides material representative of the cells which would be retrieved by conventional harvest of BM cells through sacrifice of the mice. The advantage of this procedure over conventional harvest of BM cells is that this procedure does not require the sacrifice of mice and therefore allows for longitudinal study of the bone marrow compartment of mice over time.

Although this murine bone marrow aspiration procedure has been used in a number of studies and described previously (see Sundberg et al. for a historical review¹), formal step-by-step procedures illustrating this technique have not been previously published. This protocol enables routine serial sampling of the BM for purposes such as assessing engraftment in the BM of cells exogenously introduced into the mouse (as would be done in xenograft studies for instance^2,3), analysis of chimerism in the BM for comparison with that of the peripheral blood (where results are not necessarily congruent), monitoring the abundance of specific cell types normally enriched in the marrow such as hematopoietic stem and progenitor cells, and retrieval of BM cells for ex vivo culture and/or transplantation. In addition, evaluation of marrow contents may be very useful in murine models of hematological disease as aspiration is helpful in assessing hematological disease burden at time points when disease may not be evident in the peripheral blood^3-5. Moreover, this technique may be used to evaluate response of hematologic disease in the marrow to drugs administered in therapeutic studies. Thus, the procedure described here is ideal for investigators wishing to obtain access to bone marrow hematopoietic cells from mice for cytological analysis, flow cytometric analysis, in vitro culturing, and/or in vivo transplantation studies without requiring sacrifice or harm to the mice.

The protocol for sampling of BM described here is quite similar to the technique used for intra-femoral injection of material directly into the marrow cavity^3,6. The key difference being that this protocol details the procedure for removal of cells from the marrow as opposed to instilling material directly into the marrow cavity space as is done with intrafemoral injection.

протокол

Все животные процедуры, описанные в данном протоколе были проведены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUCs) на Мемориал Слоан-Кеттеринг онкологический центр на.

1. Аспирации костного мозга (КМ) Клетки из бедренной кости

1. Обезболить мышь, которая будет проходить бедренной стремление костного мозга изофлураном (1-4%), которой вводили прецизионного испарителем. Глубину анестезии следует контролировать каждые 5-10 мин в течение всей процедуры, заметив, что нет никаких изменений в частоте дыхания, связанного с хирургического вмешательства и / или уха, пальца, а хвостовой шнура. Анестезия индуцируется изофлураном а также поддерживается на протяжении всей процедуры изофлураном. Упреждающий предварительно процессуальное доза бупренорфина в дозе 0,05-0,1 мг / кг подкожно каждые 6-12 ч может быть использован для предотвращения боли, связанные с процедурой как прилАгентства ООН в Carprofen.
2. Применить глазной мази для глаз мыши следующей вводного наркоза для предотвращения роговицы сушки.
3. Мех тщательно вырезанные из области кожи около 150% больше, чем площадь предполагаемого аспирации сайте. Свободные мех удаляется влажной марлевой салфеткой. Пожалуйста, держать мышь на циркулирующей теплой подушки воды или другого безопасного термостатом поверхности, чтобы предотвратить переохлаждение во время процедуры.
4. Лечить всю ногу, содержащий бедренную кость, которая будет проходить стремление с тремя наборами чередующихся скрабы (переменный или с повидон-йодом (Betadine) или хлоргексидином (Nolvasan) скраб и 70% изопропилового спирта или 70% этанола всасывается марлевые тампоны).
5. Влажный 0,5 мл туберкулина шприц (объем: 0,5 CC; Калибр: 27,5 г) со стерильным фосфатно-солевом буфере (PBS) перед аспирации BM. Заполните шприц с 200-500 мкл PBS и немедленно изгнать PBS. Повторите эту процедуру 2-3 тРедакторы IME.
6. Держите голени согнуты из бедренной кости, нажав на голени или с безымянного пальца или пятого пальца. Убедитесь, что подходит анестетик самолет была достигнута. Шприц держат используя большой палец и указательный палец. Это позволяет мыщелков быть подвержены и облегчает введение иглы.
7. После смачивания шприц, вставить иглу через связки надколенника, чтобы игла подал надежно между двумя мыщелков бедренной кости. Путем проведения диафизе близко к эпифиза бедренной кости с большим пальцем и указательным пальцем, игла вставлена ​​в бедренной кости легко.
8. Поворотный иглу наружу и вверх так, чтобы он был параллелен валу бедренной кости. Это действие облегчает поиск содержимого костного мозга с бедренной вала.
9. Поверните иглу по часовой стрелке и против часовой стрелки, нажимая на него медленно в бедренную полости мозга. Подтвердите правильное позиционирование иглы, осторожно перемещая сиRINGE боков.
10. Осторожно потяните иглы поршень назад, создавая отрицательное давление, при перемещении иглы назад и вперед внутри полости BM. Примечание: Объем BM придыхательных будет примерно 5 мкл который обычно соответствует 0,4-0,8 х 10 ⁶ мононуклеаров. Успешное стремление будет подтверждена визуально по внешнему виду крови в верхней части иглы в базе шприца. Если кровь не видно в шприце вполне вероятно, что небольшая кость или ткани фрагмент застрял в иглу. Это может быть удалена из иглы, перемещая поршень вверх и вниз в PBS (это одна из причин, почему шприц должен быть предварительно заполнен PBS до аспирации BM). Если ткань не может быть выбит из шприца, используйте новую иглу и шприц (снова смачивать шприц с 200-500 мкл PBS).
11. После того, как Б.М. успешно отсасывают из бедренной кости, извлеките иглу и шприц из бедренной кости и мыши.
12. Перемещение атмосферный BM к пробирке пр.efilled с 500 мкл PBS. Для большинства приложений, клетки BM затем следует хранить на льду до дальнейшей обработки, если это возможно.
13. После завершения процедуры, управлять анальгетик с карпрофена 5 мг / кг подкожно. Затем снимите мышь от наркоза и поместить на нагретую площадку до полного восстановления. ПРИМЕЧАНИЕ: Там не должно быть никаких осложнений или теснота испытали в соответствии с процедурой аспирации если все сделано правильно.
14. Перед возвращением мышей в области жилищного строительства, чтобы они в состоянии передвигаться и достичь пищу и воду. Соблюдайте мышей на наличие признаков бедствия или процедуры инфекция сообщению в следующем 24 часов. Симптомы включают в себя: постоянной кровотечения, анемия, вялость. Если какие-либо из этих признаков видны сообщению процедуру, животное (ы) должны быть умерщвлены. Примечание: BM стремление / отбора проб может быть повторен, но процедура повтор должна быть выполнена на противоположной бедренной кости, чтобы предотвратить повторное травму той же ноги. Существует мало информации относительно фрequency, что БМ стремление может быть выполнена. Бедренной стремление костного мозга как правило, не повторяются не чаще, чем раз в 2 недели.

2. Оценка Cellular Материалы в засос BM клеток

1. Гранул клетки, извлеченные из БМ аспирации и место в пробирке путем центрифугирования при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ^{° С} или комнатной температуры.
2. Аспирируйте супернатант и затем ресуспендируют осадок в 500 мкл ACK красных кровяных буфера для лизиса клеток (лизирующего буфера "аммоний-хлорида калия»).
3. Инкубируйте клетки в красной буфера для лизиса клеток в течение 10 мин, а затем добавить 1 мл PBS и спином вниз смесь снова при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ^{° С} или комнатной температуры. Примечание: красных кровяных клеток лизируют гранул в настоящее время состоит из БМ мононуклеаров. Они могут быть ресуспендировали для FACS окрашивания, подсчета клеток, трансплантации, анализа Cytospin и / или любого другого использования (так же, как BM клетки, собранные из жертвенных мышей будет использоваться).

Результаты

Бедренной БМ стремление живого C57/B6 мыши была использована для получения мононуклеарных клеток BM следуют обычным урожая BM того же мыши после жертвоприношения. BM мононуклеарные клетки, полученные обоими методами затем анализировали (1) цитологического анализа BM клеток, (2) определения о?...

Обсуждение

Серийный БМ стремление рутинной процедурой решающее значение для клинических испытаний гематологические заболевания у человека. Возможность выполнять аналогичную серийный выборки BM у мышей для характеристики клеточного состава и составляющих BM всей длительных экспериментов также...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	PAA	H15-002
Bovine serum albumin	PAA	K41-001
ACK lysis buffer	Homemade		in 1 L. Adjust pH 7.2 ~ 7.4 and filter sterile with 0.22 μm vacuum filter.
8.3 g Ammonium chloride	Fisher Scientific	A661-500
1 g Potassium bicarbonate	Fisher Scientific	P184-500
200 μl 0.5 M EDTA pH 8	Gibco	15575-038
RPMI 1640	PAA	E15-842
0.5 ml Tuberculin syringe 27.5 G	Becton Dickinson	305620
Sterile cell strainer 70 μm	Fisher Scientific	22363548
Isoflurane, USP	Attane	NDC:66794-014-25
Blunt-end needle	Stemcell Technologies	28110
PrecisionGlide needle 23 G	Becton Dickinson	305193
3 ml Syringe Luer-Lok tip	Becton Dickinson	309657
Non-tissue culture treated plate, 6 Well	Becton Dickinson	351146
12 x 75 mm 5 ml tubes	Becton Dickinson	352054	FACS staining
12 x 75 mm 5 ml tubes with cell-strainer cap	Becton Dickinson	352235	FACS staining
NK1.1 APC-Cy7	Biolegend	108723
CD11b APC-Cy7	Biolegend	101225
CD45R (B220) APC-Cy7	Biolegend	103223
CD3 APC-Cy7	Biolegend	100222
Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7	Biolegend	108423
Ter119 APC-Cy7	Biolegend	116223
CD19 APC-Cy7	Biolegend	302217
CD4 APC-Cy7	BioLegend	317417
CD117 (c-KIT) PE	BioLegend	105808
Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7	Biolegend	122513
CD34 APC	Biolegend	128612
CD16/32 e450	eBioscience	48-0161-82
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	32670
MethoCult GF M3434	STEMCELLTECHNOLOGIES	3434	For methocellulose culture
Carprofen	Crescent Chemical Company	C11045850	1 dose (5mg/kg)
Flow cytometer, LSRFortessa	Becton Dickinson
Puralube vet ointment (sterile petrolatum ophthalmic ointment)	Dechra-US	17033-211-38