Femoral Medula Óssea aspiração Live Ratos

Resumo

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Resumo

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

Introdução

All blood cells are derived from hematopoietic stem cells (HSCs). Procedures which allow access to the bone marrow (BM), the site of the vast majority of HSC’s in mice and men, without requiring sacrifice of animals, provide a resource to monitor the source of hematopoiesis serially. The overall goal of the procedure described here is to provide a detailed protocol for the sampling of BM cells from the femur of live mice which provides material representative of the cells which would be retrieved by conventional harvest of BM cells through sacrifice of the mice. The advantage of this procedure over conventional harvest of BM cells is that this procedure does not require the sacrifice of mice and therefore allows for longitudinal study of the bone marrow compartment of mice over time.

Although this murine bone marrow aspiration procedure has been used in a number of studies and described previously (see Sundberg et al. for a historical review¹), formal step-by-step procedures illustrating this technique have not been previously published. This protocol enables routine serial sampling of the BM for purposes such as assessing engraftment in the BM of cells exogenously introduced into the mouse (as would be done in xenograft studies for instance^2,3), analysis of chimerism in the BM for comparison with that of the peripheral blood (where results are not necessarily congruent), monitoring the abundance of specific cell types normally enriched in the marrow such as hematopoietic stem and progenitor cells, and retrieval of BM cells for ex vivo culture and/or transplantation. In addition, evaluation of marrow contents may be very useful in murine models of hematological disease as aspiration is helpful in assessing hematological disease burden at time points when disease may not be evident in the peripheral blood^3-5. Moreover, this technique may be used to evaluate response of hematologic disease in the marrow to drugs administered in therapeutic studies. Thus, the procedure described here is ideal for investigators wishing to obtain access to bone marrow hematopoietic cells from mice for cytological analysis, flow cytometric analysis, in vitro culturing, and/or in vivo transplantation studies without requiring sacrifice or harm to the mice.

The protocol for sampling of BM described here is quite similar to the technique used for intra-femoral injection of material directly into the marrow cavity^3,6. The key difference being that this protocol details the procedure for removal of cells from the marrow as opposed to instilling material directly into the marrow cavity space as is done with intrafemoral injection.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais descritos neste protocolo foram conduzidos de acordo com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Animal Care e Use Comitê Institucional (IACUCs) no Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.

1. Aspiração de medula óssea (BM) As células do Fêmur

1. Anestesiar o rato que passará por aspiração da medula óssea do fêmur com isoflurano (1-4%) administrado com um vaporizador de precisão. Profundidade da anestesia deve ser monitorada a cada 5-10 min durante todo o procedimento por meio da observação de que não há nenhuma alteração na taxa respiratória associada à manipulação cirúrgica e / ou ouvido, do dedo do pé, e a cauda de aperto. A anestesia é induzida com isoflurano e também mantida durante todo o procedimento com isoflurano. Uma dose pré-processual de preferência de buprenorfina a uma dose de 0,05-0,1 mg / kg por via subcutânea a cada 6-12 horas pode ser usado para prevenir a dor associada com o processo como um adjUNCT ao carprofeno.
2. Aplicar pomada oftálmica para os olhos do rato após a indução da anestesia para evitar o ressecamento da córnea.
3. A pele é cuidadosamente cortado a partir de uma área de pele de cerca de 150% maior do que a área do local da aspiração pretendido. Pele frouxa é removido com uma gaze úmida. Por favor, mantenha o mouse sobre uma almofada de água quente circulando ou outra superfície segura termóstato para evitar hipotermia durante o procedimento.
4. Desinfetar toda a perna contendo o fêmur, que passará por aspiração com três conjuntos de scrubs alternada (alternando com qualquer um iodopovidona (Betadine) ou um de clorexidina (Nolvasan) esfoliação e 70% de álcool isopropílico ou 70% de etanol embebido esponjas de gaze).
5. Umedeça um 0,5 ml de tuberculina Seringa (volume: 0,5 cc; bitola: 27,5 g) com tampão fosfato estéril (PBS), antes de aspirar o BM. Encha a seringa com 200-500 mL de PBS e expulsar imediatamente o PBS. Repita este procedimento 2-3 times.
6. Manter a tíbia dobrada do fémur, empurrando a tíbia ou com o dedo ou do quinto dedo. Confirme se um plano anestésico adequado foi atingido. A seringa é realizada utilizando o polegar e o dedo indicador. Isto permite que os côndilos a ser expostos e facilita a inserção da agulha.
7. Depois de molhar a seringa inserir a agulha através do tendão patelar, de modo que a agulha é apresentada de forma segura entre os dois côndilos do fémur. Mantendo a diáfise próxima da epífise do fémur com o polegar eo dedo indicador, a agulha é inserida no eixo do fémur facilmente.
8. Rodar a agulha para fora e para cima, de modo que é paralelo com o eixo do fémur. Esta acção facilita a recuperação do conteúdo de medula óssea a partir do eixo do fémur.
9. Gire o agulha e anti-horário, enquanto empurrando-o lentamente na cavidade da medula do fêmur. Confirme o correto posicionamento da agulha movendo suavemente a syRinge lateralmente.
10. Com cuidado, puxe o êmbolo agulha para trás, criando uma pressão negativa, enquanto movendo a agulha para trás e para a frente dentro da cavidade BM. Nota: O volume da BM aspirado será de aproximadamente 5 mL, que corresponde tipicamente a 0,4-0,8 x 10 ⁶ células mononucleares. Aspiração bem sucedida será confirmado visualmente pelo aparecimento de sangue no topo da agulha na base da seringa. Se o sangue não é visto na seringa, é provável que um fragmento de osso ou tecido pequena está preso no interior da agulha. Este pode ser retirado a partir da agulha, movendo o êmbolo para cima e para baixo em PBS (este é uma razão para que a seringa deve ser previamente cheio com PBS antes de aspirar a BM). Se o tecido não pode ser desalojado da seringa, usar uma nova agulha e seringa (de novo molhar a seringa com 200-500 ul de PBS).
11. Uma vez BM é aspirado com sucesso a partir do fêmur, retire a agulha e seringa do fêmur e mouse.
12. Mover aspirado BM para um pr microtuboefilled com 500 ul de PBS. Para a maioria das aplicações, as células BM deve, então, ser mantido no gelo até o processamento, se possível.
13. Após a conclusão do procedimento, administrar analgésico com carprofeno 5 mg / kg por via subcutânea. Em seguida, retire do mouse da anestesia e coloque em uma almofada aquecida até que esteja totalmente recuperado. NOTA: Não deve haver nenhuma complicação ou angústia experimentada após o procedimento de aspiração, se feito corretamente.
14. Antes de devolver os ratos para a área de habitação, garantir que eles são capazes de atingir e deambular comida e água. Observe os ratos para detectar sinais de perigo ou procedimento pós infecção no próximo 24 horas. Os sinais incluem: sangramento constante, anemia, letargia. Se algum destes sinais são vistos após o procedimento, o animal (s) devem ser sacrificados. Nota: BM aspiração / amostragem pode ser repetida, mas o procedimento de repetição devem ser realizadas sobre o fémur oposta para prevenir o trauma repetido da mesma perna. Há pouca informação disponível sobre o frequency essa aspiração BM pode ser realizada. Aspiração da medula óssea do fêmur é geralmente repetida não mais frequentemente do que a cada 2 semanas.

2. Avaliação do conteúdo celular em Aspirado BM Células

1. Células de pellets obtidos a partir BM aspiração e coloque em um tubo de microcentrífuga por centrifugação a 300 xg por 5 min a ^{4 °} C ou RT.
2. Aspirar o sobrenadante e, em seguida, voltar a suspender o sedimento em 500 ul de sangue vermelho ACK tampão de lise celular (tamp de lise "de amónio-cloreto de potássio").
3. Incubar as células em tampão de lise de glóbulos vermelhos, durante 10 min e em seguida adicionar 1 ml de PBS e girar novamente a mistura a 300 xg por 5 min a ^{4 °} C ou TA. Nota: Os sedimentos de lise de glóbulos vermelhos é agora constituído por células mononucleares do BM. Estes podem ser ressuspendidos em coloração de FACS, a contagem das células, o transplante, a análise de citospina e / ou qualquer outra utilização (tal como células de MO colhidas a partir de ratinhos sacrificados seria utilizado).

Resultados

Femoral BM aspiração de um rato C57/B6 vivo foi utilizado para obter as células mononucleares, seguido de colheita de BM BM convencional do mesmo rato, após sacrifício. Células mononucleares BM obtidos pelos dois métodos foram então analisadas por (1) análise citológica de células BM, (2) determinar a freqüência relativa das células-tronco / progenitoras hematopoiéticas (HSPCs), e (3) ex vivo cultura de HSPCs ordenados. No último ensaio, Sca1 linhagem negativa + c-kit + células (LSK) foram clas...

Discussão

Serial aspiração BM é um procedimento de rotina fundamental para investigação clínica de distúrbios hematológicos em seres humanos. A capacidade de executar uma série de amostragem análoga do BM em ratos para a caracterização da composição celular e componentes da BM em todo longas experiências é também muito valioso. Este processo é útil para a caracterização de HSPC de sem sacrificar o rato, mas também para detectar a presença de tipos de células adicionais na BM nos casos em que o conteúdo do...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	PAA	H15-002
Bovine serum albumin	PAA	K41-001
ACK lysis buffer	Homemade		in 1 L. Adjust pH 7.2 ~ 7.4 and filter sterile with 0.22 μm vacuum filter.
8.3 g Ammonium chloride	Fisher Scientific	A661-500
1 g Potassium bicarbonate	Fisher Scientific	P184-500
200 μl 0.5 M EDTA pH 8	Gibco	15575-038
RPMI 1640	PAA	E15-842
0.5 ml Tuberculin syringe 27.5 G	Becton Dickinson	305620
Sterile cell strainer 70 μm	Fisher Scientific	22363548
Isoflurane, USP	Attane	NDC:66794-014-25
Blunt-end needle	Stemcell Technologies	28110
PrecisionGlide needle 23 G	Becton Dickinson	305193
3 ml Syringe Luer-Lok tip	Becton Dickinson	309657
Non-tissue culture treated plate, 6 Well	Becton Dickinson	351146
12 x 75 mm 5 ml tubes	Becton Dickinson	352054	FACS staining
12 x 75 mm 5 ml tubes with cell-strainer cap	Becton Dickinson	352235	FACS staining
NK1.1 APC-Cy7	Biolegend	108723
CD11b APC-Cy7	Biolegend	101225
CD45R (B220) APC-Cy7	Biolegend	103223
CD3 APC-Cy7	Biolegend	100222
Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7	Biolegend	108423
Ter119 APC-Cy7	Biolegend	116223
CD19 APC-Cy7	Biolegend	302217
CD4 APC-Cy7	BioLegend	317417
CD117 (c-KIT) PE	BioLegend	105808
Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7	Biolegend	122513
CD34 APC	Biolegend	128612
CD16/32 e450	eBioscience	48-0161-82
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	32670
MethoCult GF M3434	STEMCELLTECHNOLOGIES	3434	For methocellulose culture
Carprofen	Crescent Chemical Company	C11045850	1 dose (5mg/kg)
Flow cytometer, LSRFortessa	Becton Dickinson
Puralube vet ointment (sterile petrolatum ophthalmic ointment)	Dechra-US	17033-211-38