Fémorale aspiration de moelle osseuse chez des souris en direct

Résumé

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

Résumé

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

Introduction

All blood cells are derived from hematopoietic stem cells (HSCs). Procedures which allow access to the bone marrow (BM), the site of the vast majority of HSC’s in mice and men, without requiring sacrifice of animals, provide a resource to monitor the source of hematopoiesis serially. The overall goal of the procedure described here is to provide a detailed protocol for the sampling of BM cells from the femur of live mice which provides material representative of the cells which would be retrieved by conventional harvest of BM cells through sacrifice of the mice. The advantage of this procedure over conventional harvest of BM cells is that this procedure does not require the sacrifice of mice and therefore allows for longitudinal study of the bone marrow compartment of mice over time.

Although this murine bone marrow aspiration procedure has been used in a number of studies and described previously (see Sundberg et al. for a historical review¹), formal step-by-step procedures illustrating this technique have not been previously published. This protocol enables routine serial sampling of the BM for purposes such as assessing engraftment in the BM of cells exogenously introduced into the mouse (as would be done in xenograft studies for instance^2,3), analysis of chimerism in the BM for comparison with that of the peripheral blood (where results are not necessarily congruent), monitoring the abundance of specific cell types normally enriched in the marrow such as hematopoietic stem and progenitor cells, and retrieval of BM cells for ex vivo culture and/or transplantation. In addition, evaluation of marrow contents may be very useful in murine models of hematological disease as aspiration is helpful in assessing hematological disease burden at time points when disease may not be evident in the peripheral blood^3-5. Moreover, this technique may be used to evaluate response of hematologic disease in the marrow to drugs administered in therapeutic studies. Thus, the procedure described here is ideal for investigators wishing to obtain access to bone marrow hematopoietic cells from mice for cytological analysis, flow cytometric analysis, in vitro culturing, and/or in vivo transplantation studies without requiring sacrifice or harm to the mice.

The protocol for sampling of BM described here is quite similar to the technique used for intra-femoral injection of material directly into the marrow cavity^3,6. The key difference being that this protocol details the procedure for removal of cells from the marrow as opposed to instilling material directly into the marrow cavity space as is done with intrafemoral injection.

Protocole

Toutes les procédures d'animaux décrits dans le présent protocole ont été menées en conformité avec les lignes directrices pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle (IACUC) au Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.

1. D'aspiration de la moelle osseuse (BM) Les cellules de la cuisse

1. Anesthésier la souris qui va subir fémorale aspiration de la moelle osseuse à l'isoflurane (1-4%) administré avec un vaporisateur de précision. Profondeur de l'anesthésie doit être surveillée tous les 5-10 minutes tout au long de la procédure en faisant observer qu'il n'y a pas de changement de la fréquence respiratoire associée à la manipulation chirurgicale et / ou de l'oreille, orteil, et pincement de la queue. L'anesthésie est induite par l'isoflurane et a également maintenu tout au long de la procédure à l'isoflurane. Une dose de pré-procédure de préemption de la buprénorphine à une dose de 0,05-0,1 mg / kg par voie sous cutanée toutes les 6-12 heures peut être utilisé pour prévenir la douleur associée à la procédure comme un adjl'équipe de pays de l'Carprofen.
2. Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux de la souris après l'induction de l'anesthésie pour éviter le dessèchement de la cornée.
3. La fourrure est soigneusement coupée à partir d'une zone de peau d'environ 150% supérieure à la surface du site d'aspiration prévue. Fourrure en vrac est enlevé avec un tampon de gaze humide. S'il vous plaît garder la souris sur un tapis de l'eau chaude circulant ou autre surface thermostatique sécurité pour éviter l'hypothermie au cours de la procédure.
4. Désinfecter la jambe entière contenant le fémur qui fera l'objet aspiration avec trois ensembles de gommages alternance (en alternance avec soit une povidone-iode (Bétadine) ou une chlorhexidine (Nolvasan) gommage et 70% d'alcool isopropylique ou éthanol à 70% imbibé de compresses de gaze).
5. Mouiller une seringue 0,5 ml de tuberculine (volume: 0,5 cm; jauge: 27,5 G) avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) avant d'aspirer la BM. Remplir la seringue avec 200-500 ul de PBS et d'expulser immédiatement le PBS. Répétez cette procédure 2-3 times.
6. Gardez la pente tibiale du fémur en appuyant sur le tibia soit avec la bague au doigt ou le cinquième doigt. Assurez-vous que le plan anesthésique approprié a été atteint. La seringue est tenue à l'aide du pouce et de l'index. Ceci permet aux condyles d'être exposés et facilite l'insertion de l'aiguille.
7. Après avoir mouillé la seringue, insérer l'aiguille dans le tendon rotulien de sorte que l'aiguille est introduite en toute sécurité entre les deux condyles du fémur. En maintenant la diaphyse à proximité de l'épiphyse du fémur avec le pouce et l'index, l'aiguille est insérée dans le corps du fémur facilement.
8. Faire pivoter l'aiguille vers l'extérieur et vers le haut de sorte qu'elle est parallèle à l'axe du fémur. Cette action facilite l'extraction du contenu de la moelle osseuse à partir de l'axe du fémur.
9. Mettez l'aiguille dans le sens horaire et anti-horaire tout en poussant lentement dans la cavité de la moelle osseuse du fémur. Confirmer le bon positionnement de l'aiguille en déplaçant doucement le syRinge latéralement.
10. Tirez doucement sur le piston de l'aiguille en arrière, créant une pression négative, tout en déplaçant l'aiguille d'avant en arrière dans la cavité BM. Remarque: le volume aspiré de la BM sera d'environ 5 pi qui correspond typiquement à 0,4 à 0,8 x 10 ⁶ cellules mononucléaires. Aspiration retenu doit être confirmée visuellement par l'apparition de sang dans la partie supérieure de l'aiguille dans le fond de la seringue. En l'absence de sang est vu dans la seringue, il est probable que d'un petit fragment de l'os ou du tissu est coincé dans l'aiguille. Ceci peut être retiré de l'aiguille en déplaçant le piston vers le haut et vers le bas dans le PBS (c'est une des raisons pourquoi la seringue doit être prérempli avec du PBS avant d'aspirer la BM). Si le tissu ne peut être délogé de la seringue, utiliser une nouvelle aiguille et la seringue (nouveau mouiller la seringue avec 200-500 ul de PBS).
11. Une fois BM est aspiré avec succès du fémur, retirez l'aiguille et la seringue du fémur et de la souris.
12. Déplacez aspiré BM à un pr tube de centrifugeuseefilled avec 500 ul de PBS. Pour la plupart des applications, les cellules BM devraient ensuite être conservé sur de la glace jusqu'à ce que le traitement ultérieur si possible.
13. Après l'achèvement de la procédure, le carprofène administrer un analgésique à 5 mg / kg par voie sous cutanée. Ensuite, retirer la souris de l'anesthésie et les déposer sur un coussin chauffant jusqu'à ce que complètement rétabli. REMARQUE: Il devrait y avoir aucune complication ou détresse vécue en suivant la procédure d'aspiration si c'est fait correctement.
14. Avant de retourner la souris pour le domaine du logement, de s'assurer qu'ils sont capables de déambuler et d'atteindre la nourriture et de l'eau. Observez la souris pour des signes de détresse ou de la procédure après l'infection dans le 24 heures suivant. Les signes comprennent: saignement constant, l'anémie, de la léthargie. Si l'un de ces signes apparaît procédure de post, l'animal (s) devrait être euthanasié. Remarque: BM aspiration / d'échantillonnage peut être répété, mais la procédure de répétition doit être effectuée sur le fémur opposée pour empêcher un traumatisme répété de la même jambe. Il ya peu d'informations disponibles sur le frequency BM que l'aspiration peut être effectuée. Fémorale aspiration de la moelle osseuse est généralement répété pas plus souvent que toutes les 2 semaines.

2. L'évaluation de contenu cellulaire dans les cellules aspiration BM

1. cellules à granules extraites de BM aspiration et placer dans un tube de centrifugeuse par centrifugation à 300 g pendant 5 min à 4 ^o C ou RT.
2. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 500 ul de sang rouge ACK lyse cellulaire tampon ("ammonium chlorure de potassium" tampon de lyse).
3. Incuber les cellules dans un tampon de lyse des globules rouges pendant 10 minutes, puis ajouter 1 ml de PBS et centrifuger à nouveau le mélange à 300 xg pendant 5 min à 4 ^{° C} ou à la température ambiante. Remarque: Le culot lysées de globules rouges se compose désormais de cellules mononucléaires BM. Ceux-ci peuvent être remises en suspension de coloration FACS, le comptage des cellules, la transplantation, l'analyse de cytospin et / ou toute autre utilisation (comme les cellules BM récoltées à partir de souris sacrifiées seraient utilisés).

Résultats

Fémorale BM aspiration d'une souris C57/B6 direct a été utilisé pour obtenir des cellules mononucléées BM suivie par la récolte de la BM conventionnel de la même souris, après sacrifice. Cellules mononucléaires BM obtenus par les deux méthodes ont ensuite été analysées par (1) l'analyse cytologique des cellules de MO, (2) la détermination de la fréquence relative des cellules souches / progénitrices hématopoïétiques (HSPCs), et (3) la culture ex vivo de HSPCs triées. Dans l'exp?...

Discussion

Serial aspiration BM est une procédure de routine critique à l'investigation clinique des troubles hématologiques chez les humains. La possibilité d'effectuer un échantillonnage de série analogue de BM dans les souris pour la caractérisation de la composition cellulaire et constituants de BM à travers de longues expériences est également très précieux. Cette procédure est utile pour la caractérisation de HSPC, sans sacrifier de la souris, mais également pour la détection de la présence de types ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	PAA	H15-002
Bovine serum albumin	PAA	K41-001
ACK lysis buffer	Homemade		in 1 L. Adjust pH 7.2 ~ 7.4 and filter sterile with 0.22 μm vacuum filter.
8.3 g Ammonium chloride	Fisher Scientific	A661-500
1 g Potassium bicarbonate	Fisher Scientific	P184-500
200 μl 0.5 M EDTA pH 8	Gibco	15575-038
RPMI 1640	PAA	E15-842
0.5 ml Tuberculin syringe 27.5 G	Becton Dickinson	305620
Sterile cell strainer 70 μm	Fisher Scientific	22363548
Isoflurane, USP	Attane	NDC:66794-014-25
Blunt-end needle	Stemcell Technologies	28110
PrecisionGlide needle 23 G	Becton Dickinson	305193
3 ml Syringe Luer-Lok tip	Becton Dickinson	309657
Non-tissue culture treated plate, 6 Well	Becton Dickinson	351146
12 x 75 mm 5 ml tubes	Becton Dickinson	352054	FACS staining
12 x 75 mm 5 ml tubes with cell-strainer cap	Becton Dickinson	352235	FACS staining
NK1.1 APC-Cy7	Biolegend	108723
CD11b APC-Cy7	Biolegend	101225
CD45R (B220) APC-Cy7	Biolegend	103223
CD3 APC-Cy7	Biolegend	100222
Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7	Biolegend	108423
Ter119 APC-Cy7	Biolegend	116223
CD19 APC-Cy7	Biolegend	302217
CD4 APC-Cy7	BioLegend	317417
CD117 (c-KIT) PE	BioLegend	105808
Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7	Biolegend	122513
CD34 APC	Biolegend	128612
CD16/32 e450	eBioscience	48-0161-82
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)	Sigma-Aldrich	32670
MethoCult GF M3434	STEMCELLTECHNOLOGIES	3434	For methocellulose culture
Carprofen	Crescent Chemical Company	C11045850	1 dose (5mg/kg)
Flow cytometer, LSRFortessa	Becton Dickinson
Puralube vet ointment (sterile petrolatum ophthalmic ointment)	Dechra-US	17033-211-38