Pareadas Grabaciones de células enteras en organotípicos de hipocampo rebanadas

Resumen

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Resumen

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Introducción

Los receptores de glutamato median la mayoría de la transmisión sináptica excitadora en las sinapsis del sistema nervioso central. Los dos subtipos principales de receptores ionotrópicos de glutamato localizados en la cabeza de la columna vertebral de la membrana postsináptica son N-metil-D-aspartato (NMDA) y α-amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-propiónico ácido (AMPA). En reposo los potenciales de membrana, receptores AMPA llevan la mayor parte de la corriente postsináptica durante la transmisión sináptica. En el hipocampo, el receptor de NMDA juega un papel clave en el desencadenamiento de los cambios en el número de receptores AMPA en la membrana postsináptica: al actuar como un "detector de coincidencia" ¹ para iniciar los cambios en la fuerza sináptica ^1, el receptor de NMDA participa en los mecanismos sinápticos que se cree que subyacen en el aprendizaje y la memoria en un nivel subcelular. En respuesta a la despolarización de la neurona postsináptica en paralelo con la liberación del transmisor presináptica, el calcio entra a través de la NMDAreceptor para iniciar la inserción del receptor de AMPA o extracción ^2. Estas dinámicas de los receptores de la plasticidad subyacen sinapsis: un aumento en la fuerza sináptica es la potenciación a ^2,3 largo plazo (LTP), mientras que una disminución en la fuerza sináptica es la depresión a largo plazo ⁴ (LTD). Por lo tanto el movimiento del receptor de AMPA se piensa que es responsable de la expresión de la plasticidad sináptica, mientras que los receptores de NMDA se cree que el control de su inducción.

La determinación de los mecanismos precisos que subyacen a la transmisión sináptica y la plasticidad requiere el estudio de pequeñas poblaciones de sinapsis, idealmente sinapsis individuales. Mientras que algunas sinapsis son muy adecuados para el estudio a este nivel, por ejemplo, el cáliz de Held ^5, para las poblaciones más sinápticas esto es extremadamente difícil debido a la naturaleza pequeña y difusa de las conexiones sinápticas. Dos de las principales técnicas de electrofisiología se han desarrollado para examinar las conexiones sinápticas individuales: El primero es la estimulación mínima, where una fibra presináptica se presume estimulada extracelularmente. La segunda técnica se combina grabaciones, donde se lleva a cabo dos grabaciones simultáneas de células enteras de neuronas conectadas sinápticamente. Una ventaja importante de estimulación mínima es que es rápida y relativamente fácil de realizar, que implica la colocación de un electrodo de estimulación extracelular en el tracto axonal mientras que simultáneamente se grabe de una neurona postsináptica. La principal preocupación cuando se utiliza esta técnica es que la estimulación fiable de una única célula rara vez se puede garantizar prueba tras prueba.

Durante los últimos quince años hemos utilizados habitualmente se combina grabaciones de células enteras a partir de dos neuronas piramidales conectados sinápticamente ^6-17. La principal ventaja de esta técnica es que sólo una neurona presináptica es estimulada consistente y fiable. También permite no sólo la caracterización electrofisiológica, sino también la manipulación farmacológica de la neurona presináptica ^{6,18 <}/ Sup>. Sin embargo, la probabilidad de conectividad sináptica entre neuronas es baja, por lo que los pares conectados difícil obtener ^19. El uso de cultivos de cortes de cerebro organotípicos evita este obstáculo como la conectividad sináptica puede volver a establecer in vitro y, además, la naturaleza de la conectividad resultante es similar a la que en el tejido cerebral nativa ^20. Además, cultivos organotípicos expresan LTP, LTD ^{7-10,12-15,21} y otras formas de plasticidad sináptica a corto plazo, incluyendo la facilitación a dos pulsos (PPF) y la depresión (PPD) ^6,22,23, lo que permite a los mecanismos de plasticidad ser estudiado en pares de neuronas. Aquí se describe la metodología detallada que participan en la consecución con éxito grabaciones pareadas en este sistema in vitro. Esta información puede ser fácilmente adaptado para otros sistemas experimentales, incluso en lonchas agudas y otras regiones del cerebro.

Protocolo

Declaración de Ética Animal:

Los protocolos descritos en este manuscrito siguen las directrices de cuidado animal establecidas por la Universidad de Auckland y la Universidad de Stanford. P7 crías de rata fueron sacrificados por decapitación rápida. La disección del hipocampo se realiza entonces inmediatamente como se describe a continuación.

1. organotípicos del hipocampo rebanada Cultura

1. Preparación
   1. Preparar el medio de disección (sólo se utiliza para diseccionar el cerebro). Combinar 200 ml de medio esencial mínimo, 2 ml de solución de penicilina-estreptomicina (10.000 unidades de cada uno, en 0,85% de NaCl), 5 ml de solución tampón de HEPES, 2 ml de solución madre 1 M Tris (pH 7,2), y esterilizar por filtración con filtro de 0,22 micras . Llevar a cabo la disección del hipocampo en medio de disección en frío de hielo.
   2. Enfriar el medio de disección. Coloque la disección de los medios de comunicación en el congelador aproximadamente 1 hora antes de comenzar la disección hasta que el líquido es muy frío. No permita que gran cr hieloystals para formar. Almacenar en hielo hasta que se necesite.
   3. Preparar el medio de cultivo (utilizado para todo, excepto la disección de hipocampos). Combinar 100 ml de medio mínimo esencial, (concentración 1x, líquido) w / sales de Hank, W / L-glutamina, 2 ml de solución de penicilina-estreptomicina (líquido, 10.000 unidades de cada uno, en 0,85% de NaCl), 2,5 ml de HEPES 1 M de tampón solución, 50 ml solución salina equilibrada de Hank, 50 ml de suero de caballo (definida, inactivado por calor), y esterilizar por filtración con filtro de 0,22 micras.
   4. Preparar las placas de cultivo. Coloque 1 ml de medios de cultivo por 35 mm placa de cultivo, y añadir un inserto de membrana para cada plato. Ponga hasta siete de estos platos en una placa de Petri de 150 mm (en lo sucesivo como un 'plato'). Colocar la placa en una incubadora de CO ₂ durante al menos una hora antes de la disección comienza de modo que el medio de cultivo en los platos alcanza la temperatura y pH adecuado.
2. La disección de los hipocampos de rata cachorros en Postnatal Día 7 (P7)
   1. Pre-esterilizar todas las herramientas de disección con luz UV antes del procedimiento.
   2. Después de la decapitación rápida, retire el cerebro y el lugar en un medio frío en un plato, y luego retírela con un trozo de papel de filtro humedecido para la disección. Se burlan de la corteza lejos del cerebro medio usando espátulas lisas contundentes recubiertos de plástico en miniatura, dejando al descubierto el hipocampo. Corte el fondo de saco, y luego trabajar suavemente la espátula debajo del hipocampo para voltear hacia fuera (Figura 1A).
      NOTA: El éxito de cultivos de corte se pueden preparar usando animales hasta P10.
   3. Recorte el hipocampo aislado lejos del resto del cerebro. Transferir el hipocampo en un nuevo plato que contiene los medios de comunicación disección fría utilizando un pincel suave humedecido (por ejemplo, blanco sable # 4).
   4. Limpiar la parte inferior (es decir, el lado más plano) del hipocampo de plexo coroideo durante la disección, ya que estos tejidos esponjosos,-meninge como hacen difícil separar del hipocamporebanadas entre sí más adelante.
      NOTA: Deje estos tejidos en su lugar si no pueden ser objeto de burlas de distancia con cuidado.
   5. Realizar toda la disección tan rápidamente como sea posible sin dañar los hipocampos.
      NOTA: Una cuidadosa disección es más importante que uno rápido, siempre y cuando se enfrían las condiciones experimentales. Cortar los hipocampos de tres ratas simultáneamente. La salud rebanada no se ve afectada, siempre y cuando el tiempo total desde el principio hasta cuando las rebanadas chapados entran en la incubadora tiene menos de 30 min.
3. Rebanar
   1. Cortar los hipocampos transversalmente en 400 micras secciones transversales utilizando una máquina de cortar el tejido manual. El método por el cual se lleva a cabo el corte no es importante, siempre y cuando no sea demasiado perjudicial para el tejido y produce rebanadas de espesor consistente con la arquitectura laminar fácilmente visible (es decir, el cuerno de Ammon se ve fácilmente que se conserva en el tejido).
   2. Lie los hipocampos en el escenario del tejidochopper en la parte superior de un espesor triple # 2 de papel de filtro. El hipocampo se cortó por completo sin necesidad de retirar algún segmento individual (es decir, todo el hipocampo se deja en la escena del helicóptero hasta que se hayan hecho todos los cortes, sino como hogazas de pan de molde en este punto; Figura 1B).
   3. Transfiera los hipocampos en medio de disección utilizando un pincel suave relajado al lado de cada hipocampo (blanco sable # 2). Empujar suavemente cada hipocampo a un lado para romper la adhesión entre el hipocampo y el papel de filtro subyacente. Enrolle el cepillo debajo de cada hipocampo a recogerlo fuera del escenario. Coloque todos los hipocampos en la misma 35 mm placa de Petri de medio de disección fría. Separar los hipocampos en rodajas individuales agitando manualmente el plato en la alternancia de movimientos en sentido horario y antihorario.
   4. Inspeccione las rebanadas con un microscopio de disección y descartar cualquier que se daña, pequeña, o que no poseen células claramente visiblecapas del cuerpo.
      NOTA: A menudo será el caso de que no todas las rebanadas se separan con éxito de sus hermanos de esta manera. En este caso, se pueden separar girándolas en el borde y empujando con la punta de unas pinzas finas. "Buenas" cortes se transfieren a otra placa de Petri que contenía medio limpio disección fría utilizando una cortada y pulida al fuego pipeta Pasteur (figuras 1C-E).
4. Almacenamiento
   1. Coloque las rebanadas individuales en los elementos filtrantes de membrana. Con una pipeta Pasteur cortada y pulida al fuego para dar una luz mayor, transferir individualmente rebanadas a los insertos de cultivo.
      NOTA: El tamaño del agujero creado al cortar y es importante la pipeta-pulido fuego. Demasiado pequeño y las rodajas no dejarán fácilmente la pipeta para la membrana. Fluido demasiado grande y el exceso se coloca en la superficie de la membrana junto con la rebanada. La mejor diámetro del agujero es típicamente de alrededor de la mitad del diámetrotro del cilindro de la pipeta. Al cortar, este diámetro puede ser elegido por el corte en el lugar adecuado sobre el cono de la pipeta.
   2. Rodaja de transferencia
      1. Llenar la pipeta con el medio, y luego aspirar una sola rebanada con pequeñas fuerzas de succión. Esto mantiene la porción cerca de la abertura de la pipeta y evita demasiado expulsión medio en el inserto para colocar la rebanada.
      2. Aplique una ligera presión en el bulbo para formar una pequeña gota colgante, permita que el segmento se asiente en esa gota, y luego toque que gota a la membrana y dejar que el sector "caída" sobre la membrana. Generalmente tres rebanadas se colocan en cada inserción de membrana.
         NOTA: Si la gotita de líquido es demasiado grande, las gotitas procedentes de los tres rodajas tienden a fusionarse en la superficie de la membrana, y las rodajas se reúnen para así todo el centro de la membrana, lo que hace más difícil separarlas para registro electrofisiológico más tarde.
   3. Remov Fluidal
      1. Aspirar el medio sobrante de la parte superior del inserto de placa de cultivo para todos los sectores en que la placa (3 rebanadas por inserto = 21 rebanadas por placa), de modo que las rebanadas no están sumergidos en o rodeados por una piscina de medio de disección.
      2. Realice esto es con un sin cortar, pero pipeta Pasteur pulida al fuego. Deje que la rebanada se asiente y se adhieren a la membrana por un minuto antes de pipetear. Tenga cuidado de no aspirar la rebanada en la pipeta. Llevar a cabo la eliminación de líquido para las inserciones que se sembraron en primer lugar, para que haya tiempo suficiente para que las rodajas se asienten.
   4. Rodaja de almacenamiento
      1. Cultivos de corte tienda en un incubador de _CO2 un 5,0% a 37 ° C. Observar la disposición final de las culturas en la figura 1E. Las rodajas individuales descansan sobre un inserto de placa de cultivo que tiene una membrana porosa por un fondo, y este inserto encaja dentro de una placa de Petri llena con una pequeña cantidad de medio; por este medio, las rebanadas no están inmersos en el meDium, pero tiene acceso a ella sólo a través de la membrana en la parte inferior del inserto de placa de cultivo.
      2. Opcionalmente, puede eliminar las rodajas de estudio, ya sea mediante la eliminación de la inserción de placa de cultivo o mediante la reducción de una sección de la membrana inserto que contiene una rebanada.
5. Mantenimiento
   1. Cambie el medio de las placas de Petri el día después de hacer las culturas. Transferir el inserto de placa de cultivo a una nueva placa de Petri que contiene 1 ml de medio de cultivo fresco que se equilibra en la incubadora durante al menos una hora antes de la transferencia.
   2. Cambiar el medio de nuevo de la misma manera en el tercer día después de hacer las culturas. En el tercer día, transferir las culturas a una incubadora a 34 ° C. Cambie el medio dos veces por semana (cada 3-4 días).
   3. Identificar los cultivos sanos. Seleccione culturas saludables para grabaciones de células enteras pareadas.
      NOTA: Los cultivos sanos tienen un borde bien definido y una capa de células piramidales claramente definido. Culturas ingenioh oscuro (probablemente necrótico) áreas o presente un aspecto vacuolado con bordes aplanados son rechazadas. El empleo de estos criterios, generalmente de dos tercios de los cultivos de cortes son lo suficientemente saludable para la grabación.
   4. Utilizar estas culturas dentro de una bastante pequeña ventana de tiempo. No tejidos utilizados que son cultivadas durante más de dos semanas desde que las neuronas comienzan a mostrar un comportamiento ligeramente epileptiforme que empeora lentamente con el tiempo. El límite superior exacto de la supervivencia neuronal no se conoce, pero es posible grabar de funcionamiento de las células piramidales tan tarde como 16 semanas en cultivo.

2. pareadas grabaciones de células enteras

1. ACSF y Soluciones intracelulares
   1. Preparar la solución de electrodo presináptica mezclando (en mM) 120 gluconato de potasio, 40 HEPES, 5 MgCl _2, 2 NaATP, y 0,3 NaGTP (pH 7,2 con KOH; osmolaridad: 290 mOsm). Mientras que la misma solución de electrodo se utiliza para las neuronas postsinápticas, gluconato de cesio (120 mM) Se utiliza típicamente como la sal importante en el electrodo postsináptica, además de 5 mM QX314.
      NOTA: Esto permite fijación de tensión estable a potenciales positivos para registrar corrientes NMDAR mediada postsinápticos ^8-10,13. También evita que la hiperexcitabilidad inducida por potasio de la neurona presináptica por la solución interna que fluye desde el electrodo de registro postsináptica antes de que se hizo un sello ohmios giga.
   2. Preparar la solución de electrodo postsináptica componer (en mM) 120 gluconato de cesio, 40 HEPES, 5 MgCl _2, 5 QX314, 2 NaATP, y 0,3 NaGTP (pH 7,2 con CsOH; osmolaridad: 290 mOsm). Tire de microelectrodos de vidrio a 5-10 resistencia mW y rellenar con solución interna filtrada.
   3. Preparar el líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) componer (en mM) 119 NaCl, 2,4 KCl, 1,3 MgSO _4, 2,4 CaCl _2, 1 Na ₂ HPO _4, 26.2 _NaHCO3, 11 de glucosa, pH 7,4, saturado con 95% O _2, 5 % de CO _2. NOTA: Si r AMPAR mediadaesponses necesitan ser bloqueado para el examen de NMDAR EPSCs, incluyen 10 M CNQX o NBQX en la ACSF.
2. Obtener emparejado enteros Grabaciones celulares
   1. Para examinar la transmisión sináptica entre dos neuronas individuales, designar una neurona como la neurona presináptica y mantenga en la pinza de corriente para inducir potenciales de acción e iniciar la transmisión sináptica.
   2. Designe la segunda neurona, como la neurona postsináptica, y mantenerlo en su pinza de corriente o voltaje en función de la información requerida por el investigador. Obtener un examen detallado de las corrientes glutamatérgicas, con EPSCs mediados por AMPAR examinados a -65 mV y EPSCs NMDAR mediada examinados en 30 mV ^6-16 mediante la celebración de la neurona postsináptica de fijación de voltaje
   3. Establecer una grabación emparejado. Establecer una grabación emparejado, la grabación de células completas presináptica se obtiene siempre primero, lo que permite múltiples neuronas postsinápticas secuenciales para obtener hasta uno que es sinápticamente connectese obtiene d. Si la realización de experimentos de plasticidad sináptica, es especialmente crítica para obtener la neurona presináptica primera como la inducción de LTP en la neurona postsináptica debe iniciarse dentro de los 10 min de la obtención de células enteras las grabaciones para evitar el lavado de los factores citoplásmicos necesarios para LTP ^8,19.
   4. Evitar la pérdida de células inducida por el movimiento-. Un reto importante al realizar grabaciones de células enteras pareadas es evitar la vibración y la interrupción inducida movimiento-de la primera grabación de células enteras, mientras que la obtención de la segunda grabación.
      1. Obtener la primera grabación de células enteras y luego mover el microscopio lente 10-200 micras en el eje x de manera que el registro establecido se encuentra en el borde de la zona visible en el monitor (Figura 2A).
      2. Elevar la lente del microscopio ~ 5-10 mm garantizando al mismo tiempo que la ACSF todavía mantiene contacto con la lente. Monte el segundo electrodo y guiar en el menisco de líquido (Figura 2B ).
      3. Mueva el electrodo en el plano xy hasta que esté directamente debajo de la trayectoria de la luz a través del objetivo, pero todavía muy por encima del electrodo de registro establecido. Una vez que el electrodo es visible bajo el microscopio, asegurar la punta está en el borde más alejado de la monitor lejos del primer electrodo.
      4. Mueva el segundo electrodo hacia abajo en secuencia con el foco del microscopio hasta que ambos electrodos están en el mismo plano focal. Es importante que el nivel de presión positiva es lo suficientemente fuerte para evitar el bloqueo punta pero no demasiado fuerte como para perturbar la primera grabación de células enteras. Esto se traduce en la presión positiva inducir movimiento en 2-3 neuronas del electrodo cuando entra primero la rebanada.
      5. Localizar un socio postsináptica en un plano focal similar a la primera grabación presináptica (Figura 2C). Grabación generalmente obtener grabaciones entre las neuronas piramidales CA3 el segundo conjunto de células emparejado de una neurona 0-200 mm de la primera rrabación (Figuras 2C, D).
         NOTA: La transmisión sináptica entre pares neuronales son estables durante periodos de tiempo de hasta 3-4 horas cuando se utilizan estas técnicas de grabación de células enteras normalizadas.
3. La plasticidad sináptica: Érase obtener un éxito par de células piramidales conectado sinápticamente-3A (figuras, B), examinar las características de la transmisión sináptica y la plasticidad.
   1. Inducción de LTP.
      1. Inducir LTP por el emparejamiento de los potenciales de acción presináptica (1 Hz) con la despolarización postsináptica a -10 a 0 mV durante 1 min (Figura 3C) ^7-9,12-14. Inicia la vinculación dentro de 10 minutos de rodaje a la neurona postsináptica.
         NOTA: LTP también puede ser inducida con ambas neuronas celebradas en pinza de corriente por el emparejamiento de los potenciales de acción presinápticos y postsinápticos a 1 Hz durante 1 min, con potenciales de acción postsináptica suscitó 10 mseg después de la inyección de la corriente en la neurona presináptica ⁸ .
   2. Además inducir LTD por estimulación de baja frecuencia (EPA) a 1 Hz en combinación con una ligera despolarización de la neurona postsináptica a -55 mV durante 5-10 minutos (Figura 3 C) ^9.

Resultados

Conectividad sináptica es evidente mediante la estimulación de la neurona presináptica para disparar un potencial de acción por el que pasa un impulso de corriente de despolarización (típicamente 20-50 Pa durante 20 mseg) a través del electrodo de registro. La traza actual postsináptica se examina para detectar la presencia de un EPSC monosináptico evocado en corto (<5 ms) y latencias consistentes después del pico del potencial de acción presináptica (Figura 3A). En la mayoría de los exp...

Discusión

Aquí hemos descrito los requisitos para establecer exitosas grabaciones de células enteras pareadas en cultivos de cortes de hipocampo organotípicos. Grabaciones apareadas también se pueden realizar en múltiples preparaciones, incluso en lonchas agudas y sistemas de cultivo disociadas ^26,27. Mientras que el enfoque aquí ha estado en la inducción de formas de plasticidad sináptica (LTP y LTD saber) más largos, es importante destacar que las grabaciones de células enteras pareadas en organotípico, re...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minimum Essential Medium			Stable motorized micromanipulators
Penicillin-Streptomycin solution			Shallow tissue bath
HEPES buffer solution			DIC camera
1 M Tris stock solution			Amplifier
Hank’s Balanced Salt Solution			Computer
Horse Serum			Vibration isolation table
Plastic-coated miniature spatulas			Upright microscope
Soft paintbrush			Data acquistion and analysis software
Manual tissue chopper			Electrode puller
#2 Filter paper			Faraday cage
#5 Forceps
Membrane inserts
CO2 incubator
Dissection hood
Class II hood