Парные Целые Записи Сотовые в Органотипической срезов гиппокампа

Резюме

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Аннотация

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Введение

Рецепторы глутамата посредником большинство возбуждающей синаптической передачи в центральных синапсах нервной системы. Две основные подтипы ионотропных глутаматных рецепторов, локализованных на позвоночнике головки постсинаптической мембраны являются N-метил-D-аспартата (NMDA) и α-амино-3-гидрокси-5-метилизоксазол-4-пропионовой кислоты (АМРА) рецепторов. В отдыхает мембранных потенциалов, АМРА-рецепторы несут большую часть постсинаптической тока во время синаптической передачи. В гиппокампе, рецептор NMDA играет ключевую роль в запуске изменения в ряде АМРА-рецепторов в постсинаптической мембраны: выступая в качестве "детектора совпадений" ¹ инициировать изменения в синаптической силы ^1, рецептор NMDA участвует в синаптических механизмов что, как полагают, лежат в основе обучения и памяти на субклеточном уровне. В ответ на деполяризации постсинаптического нейрона параллельно с пресинаптической выпуска передатчика, кальций входит через NMDAрецепторов инициировать введение рецептора АМРА или удаление ^2. Такая динамика рецепторов лежат синапса пластичность: увеличение синаптической силы является долгосрочное потенцирование ^2,3 (LTP), в то время как снижение синаптической силы является долгосрочной депрессии ⁴ (ООО). Поэтому движение рецептора АМРА, как полагают, несет ответственность за синаптической пластичности выражения, в то время как рецепторы NMDA, как полагают, контролировать его индукции.

Определение точных механизмов, лежащих передачу синаптическую пластичность и требует изучения малых популяций синапсов, в идеале одиночные синапсы. В то время как некоторые синапсы хорошо подходит для изучения на этом уровне, например, чашечки, удерживаемых ^5, для наиболее синаптических населения это крайне сложно вследствие малого и диффузного характера синаптических связей. Две основные методы электрофизиологии были разработаны для изучения одиночных синаптических связей: Первый минимальна стимуляция, порогае один пресинаптический волокна Предполагается стимулировали внеклеточно. Второй метод работает в паре записи, где два одновременных целые клеточные записи с синаптически связанных нейронов выполняется. Основным преимуществом минимальной стимуляции является то, что быстрое и относительно прост в исполнении, с участием размещение внеклеточного стимулирующего электрода в аксонов-кишечного тракта, одновременно записи с постсинаптического нейрона. Главной задачей при использовании этого метода является то, что надежным стимуляция одной клетки редко может быть гарантирована суда после судебного разбирательства.

За последние пятнадцать лет мы регулярно использовали в паре цельноклеточная записи с двух синаптически связанных пирамидальных нейронов ^6-17. Основным преимуществом этого метода является то, что только один пресинаптический нейрон последовательно и надежно стимулировали. Она также позволяет не только электрофизиологические характеристики, но и фармакологической манипуляции пресинаптической нейрон ^{6,18 <}/ SUP>. Тем не менее, вероятность синаптической связи между нейронами низка, что делает подключенные пары трудно получить ^19. Использование органотипических культур мозга срезов обходит это препятствие, как синаптической связи может восстановить в пробирке и тому природа полученного соединения аналогична в основном мозговой ткани ^20. Кроме того, органотипической культуры выразить LTP, ООО ^{7-10,12-15,21} и дополнительные формы краткосрочного синаптической пластичности в том числе содействия в паре-импульса (PPF) и депрессии (PPD) ^6,22,23, позволяя механизмы пластичности в быть изучены в пар нейронов. Здесь мы опишем детальную методику, участвующих в успешно достижения парные записи в этой системе в пробирке. Эта информация может быть легко адаптированы к другим экспериментальных системах, в том числе острых срезов и других областях головного мозга.

протокол

О себе животных Этика:

Протоколы, описанные в этой рукописи следовать указаниям по уходу за животными, установленные Университета Окленда и Стэнфордский университет. P7 крысята были подвергнуты эвтаназии быстрым обезглавливание. Гиппокампа рассечение затем немедленно проводили, как описано ниже.

1 Органотипической гиппокампа ломтик Культура

1. Подготовка
   1. Подготовьте рассечение Средний (используется только для рассечения мозга). Объединить 200 мл минимальной основной среде, 2 мл пенициллина-стрептомицина раствора (10000 единиц каждого из них, в 0,85% NaCl), 5 мл буферного раствора HEPES, 2 мл 1 М раствор трис (рН 7,2), и фильтр стерилизуют при 0,22 мкм фильтр . Провести гиппокампа рассечение в ледяной рассечение среды.
   2. Охладите рассечение среды. Поместите рассечение СМИ в морозильнике примерно 1 час до начала рассечение, пока жидкость не очень холодно. Не допускайте большого льда крystals сформировать. Храните на льду, пока не требуется.
   3. Подготовка питательной среды (используется для всего, кроме рассечения гиппокампе). Зерноуборочные 100 мл минимально необходимой среды, (концентрационные 1x, жидкость) ж / солей Хэнка, ж / L-глутамина, 2 мл пенициллина-стрептомицина решения (жидкого, 10000 единиц каждого, в 0,85% NaCl), 2,5 мл HEPES 1 М буфера Раствор 50 мл Хэнка сбалансированный солевой раствор, 50 мл лошадиной сыворотки (определяется, инактивированной нагреванием), и фильтр стерилизуют при 0,22 мкм фильтр.
   4. Подготовьте чашки для культивирования. Поместите 1 мл культуральной среды на 35 мм блюдо культуры, и добавьте мембранный вкладыш к каждому блюду. Положите до семи из этих блюд в один 150 мм чашки Петри (далее обозначается как 'тарелки'). Место пластины в CO ₂ инкубаторе в течение по крайней мере часа перед рассечение начинается так, что культурная среда в блюдах достигает нужной температуры и рН.
2. Рассечение гиппокампы от крысят в постнатальном День 7 (P7)
   1. Предварительно стерилизовать все рассечение инструментов под ультрафиолетовым светом перед процедурой.
   2. После быстрого обезглавливания, извлечь мозг и место в охлажденный среды в одном блюде, а затем удалить его с куском влажной фильтровальной бумаге для вскрытия. Дразнить кору от мозга тупыми гладкими пластмассовыми миниатюрные шпатели, подвергая гиппокамп. Разрежьте свода, а затем аккуратно работать лопаточку под гиппокампе, чтобы перевернуть его (рисунок 1а).
      Примечание: Успешное срез культуры могут быть получены с использованием животных до Р10.
   3. Обрежьте изолированный гиппокамп от остальной части головного мозга. Трансфер гиппокампа в новую чашку, содержащую охлажденный рассечение СМИ с помощью увлажненной мягкой кистью (например, белый соболь № 4).
   4. Почистите нижнюю (т.е. плоский сторона) гиппокампе сосудистого сплетения во время вскрытия, так как эти губчатые, meninge-как ткани сделать его трудно отделить гиппокампаломтики друг от друга в дальнейшем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте эти ткани на месте, если они не могут быть дразнили от нежно.
   5. Выполните всю рассечение как можно быстрее, не повреждая гиппокампа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При внимательном рассечение важнее быстрого один, пока экспериментальные условия охлажденным. Нарежьте гиппокампа от одновременно трех крыс. Здоровья срез не зависит тех пор, пока общее время от начала до когда покрытием ломтики войти в инкубаторе при 30 мин.
3. Нарезки
   1. Нарежьте гиппокампа в поперечном направлении в 400 мкм сечений с использованием ручного ткани слайсер. Метод, с помощью которого нарезки проводится не важно, пока это не чрезмерно вредно для ткани и производит ломтики одинаковой толщиной с хорошо видимом ламинарного архитектуры (т.е. Рог Аммона, как легко видеть сохраняется в ткани).
   2. Ли гиппокампа на этапе тканиИзмельчитель сверху тройной толщины # 2 фильтровальной бумаги. Гиппокамп нарезаны полностью не снимая ломтики индивидуально (т.е. весь гиппокамп остается на стадии вертолета, пока все порезы не были сделаны, скорее, как буханки нарезанный хлеб в этой точке; рисунке 1b).
   3. Трансфер гиппокампа в рассечение среды, используя мягкую кисть положил рядом с каждым гиппокампе (белый соболь # 2). Аккуратно вставьте каждый гиппокамп в сторону, чтобы разорвать сцепление между гиппокампе и подстилающей фильтровальной бумаги. Раскатайте кисть под каждым гиппокампе, чтобы поднять его со сцены. Поместите все гиппокампа в то же 35 мм чашки Петри охлажденной рассечение среды. Отделите гиппокампа на отдельные кусочки вручную перемешивания блюдо попеременно по часовой стрелке и против часовой стрелки движения.
   4. Осмотрите ломтики под микроскопом рассекает и отбросить любые, которые повреждены, маленький, или которые не обладают четко видимый ячейкуслои тела.
      Примечание: Это часто будет тот случай, когда не все кусочки успешно отделены от их братьев в этой манере. В этом случае, они могут быть разделены путем поворота их на краю, и подталкивает их кончиками тонких щипцов. "Хорошие" ломтики, которые затем передаются в другую чистую чашку Петри, содержащую охлажденный рассечение среды с использованием отсечения и огневой полировкой пипетки Пастера (Цифры 1С-E).
4. Хранение
   1. Поместите отдельные кусочки на мембранный фильтр вставками. С помощью пипетки Пастера отрезать и огонь полированной дать более крупный канал, индивидуально передать ломтики к культуре вставками.
      Примечание: размер отверстия, созданного при резке и противопожарной полировки пипетку имеет важное значение. Слишком мала, и части не будет легко выйти из пипетки на мембране. Слишком большой избыток жидкости и помещают на поверхности мембраны вместе с кусочком. Лучший диаметр отверстия обычно составляет около половины диаметрметра ствола пипетки. При резке, этот диаметр может быть выбран путем разрезания на должном месте на конус пипетки.
   2. Slice Передача
      1. Заполните пипетку со средой, а затем сосать одну кусочек с небольшими всасывающих сил. Это удерживает кусок вблизи отверстия пипетки, предотвращает слишком много среднего изгнание во вкладыш, чтобы поместить кусочек.
      2. Нанесите небольшое давление на луковице сформировать небольшой висячий капельку, позволяют срез, чтобы обосноваться в этой капле, а затем нажмите эту капельку к мембране и пусть срез "падения" на мембрану. Вообще три ломтика помещаются на каждой мембранной вставкой.
         Примечание: Если капли жидкости слишком большие, капли из трех кусочков, как правило, сливаются на поверхности мембраны, и, таким образом, ломтики будут все собираются в центре мембраны, что делает его более трудно отделить их электрофизиологические записи позже.
   3. Жидкость Removаль
      1. Аспирируйте любой избыток среды из верхней части культурального планшета вставкой для всех срезов в этой пластине (3 ломтиков в вставкой = 21 ломтиков в пластине), так, чтобы кусочки не погружена в или в окружении пула рассечение среды.
      2. Выполните это с режиссерский, но огневой полировкой пипетки Пастера. Разрешить ломтик урегулировать и придерживаться мембраны за минуту до пипетки. Будьте осторожны, не сосать кусочек внутрь пипетки. Провести удаление жидкости для вставок, которые высевали первой, чтобы обеспечить достаточное время для ломтики урегулировать.
   4. Slice хранения
      1. Магазин срез культуры в 5,0% CO ₂ инкубаторе при 37 ° С. Соблюдайте окончательное расположение культур в фиг.1Е. Отдельные ломтики опираться на культуральном планшете вставки, который имеет пористую мембрану, на дно, и эта вставка устанавливается внутри чашки Петри, наполненную небольшим количеством среды; Посредством этого ломтики не погружен в меняDIUM, но есть доступ к ней только через мембрану в нижней части культурального планшета вставки.
      2. При желании, удалить ломтики может для изучения либо путем удаления пластины культуры вставку или вырезанием раздел вставки мембраны, содержащей кусочек.
5. Техническое обслуживание
   1. Замените среду в чашках Петри на следующий день после принятия культур. Перенести культуры пластины вставку на новую чашку Петри, содержащую 1 мл свежей культуральной среде, которая находится в равновесии в инкубаторе в течение по крайней мере часа до передачи.
   2. Изменение среды вновь таким же образом, на третий день после внесения культуры. На третий день, передать культуру в инкубатор при 34 ° C. Измените среду дважды в неделю (каждые 3-4 дня).
   3. Определить здоровых культур. Выберите здоровые культур для парных целых записей клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здоровые культуры имеют четко выделенный край и четко определенной пирамидальную слоя клеток. Культуры остроумиеч темно (вероятно, некротический) области присутствует или вакуолизированных внешний вид с плоскими границами отвергаются. Используя эти критерии, как правило, две трети срез культуры достаточно здоровым для записи.
   4. Использование этих культур в довольно небольшой промежуток времени. Не использованные салфетки, которые культивировали в течение более двух недель, так как нейроны начинают показывать немного эпилептиформной поведение, которое медленно ухудшается со временем. Точная верхняя граница выживание нейронов не известно, но можно записать функционировать пирамидальных клеток, как в конце 16 недели в культуре.

2. Парные Целые Записи Сотовые

1. ACSF и внутриклеточные Решения
   1. Готовят раствор пресинаптического электрода путем смешивания (в мм) глюконат калия 120, 40 HEPES, 5 MgCl _2, 2 NaATP и 0,3 NaGTP (рН 7,2 с помощью КОН; осмолярность: 290 мОсм). Хотя тот же раствор электрод используется для постсинаптических нейронов, цезий глюконата (120 мМ) Обычно используется в качестве основного соли в постсинаптической электрода, плюс 5 мМ QX314.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет стабильную фиксацию напряжения на положительных потенциалов для записи постсинаптические NMDAR опосредованного токи ^8-10,13. Это также предотвращает возбудимость калия, вызванной из пресинаптической нейрон внутренним раствора, вытекающей из постсинаптической электрода записи, прежде чем уплотнение Giga Ом изготовлен.
   2. Готовят раствор постсинаптической электрода композиции (в мм) 120 цезия глюконат, 40 HEPES, 5 MgCl _2, 5 QX314, 2 NaATP и 0,3 NaGTP (рН 7,2 с CsOH; осмолярность: 290 мОсм). Потяните стеклянные микроэлектродов на 5-10 сопротивления МОм и залейте фильтрованной внутреннего решения.
   3. Подготовка искусственной спинномозговой жидкости (ACSF) композиции (в мм) 119 2,4 NaCl, KCl, 1,3 _MgSO4, 2,4 CaCl _2, 1 Na ₂ HPO _4, NaHCO ₃ 26,2, 11 глюкозы, рН 7,4, насыщают 95% O _2, 5 % CO _2. ПРИМЕЧАНИЕ: Если Ампар опосредованного гesponses нужно быть заблокирован для рассмотрения NMDAR EPSCs, включают 10 мкм CNQX или NBQX в ACSF.
2. Получить Парные всей клетки Recordings
   1. Чтобы изучить синаптическую передачу между двумя отдельными нейронами, назначить одного нейрона как пресинаптической нейрон и удерживайте в токовых клещей, чтобы вызвать потенциал действия и инициировать синаптическую передачу.
   2. Назначить второй нейрон, как постсинаптического нейрона, и держать его в тока или напряжения зажим в зависимости от информации, требуемой исследователем. Получить подробную экспертизу глутаматергических токов, с Ампар-опосредованных EPSCs обследованных при -65 мВ и NMDAR опосредованного EPSCs рассмотренных на 30 мВ ^6-16, удерживая постсинаптического нейрона в зажим напряжения
   3. Установите в паре запись. Для установления парного запись, запись пресинаптический целая клетка всегда получается первое, что позволяет нескольким последовательные постсинаптические нейроны не должны быть получены до одного, который синаптически connecteд получается. При выполнении синаптической пластичности эксперименты, это особенно важно для получения пресинаптического нейрона сначала индукции LTP в постсинаптического нейрона должны быть начаты в течение 10 мин получения записей целые клеточные для предотвращения вымывания цитоплазматических факторов, необходимых для LTP ^8,19.
   4. Избегайте движения, вызванного потерю клеток. Одна из основных задач при выполнении парных целые записи клеток избегает вибрации и движения, вызванного нарушение первого всей записи клеток в то время как получение второго запись.
      1. Получение первой записи целой клетки, а затем переместить линзы микроскопа 10-200 мкм в х-оси, так что установлено записи находится на краю области, видимой на мониторе (фиг.2А).
      2. Поднимите объектив микроскопа ~ 5-10 мм, обеспечивая при этом ACSF еще поддерживает контакт с линзой. Подключите второй электрод и направлять в мениска жидкости (Рисунок 2B ).
      3. Перемещение электрода в плоскости, пока не находится непосредственно под светового пути через объектив, но по-прежнему значительно выше установленного записи электрода. После того, как электрод видна под микроскопом, обеспечить верхушка в дальнем краю монитора от первого электрода.
      4. Перемещение второй электрод вниз в последовательности с акцентом микроскопа, пока оба электрода не находятся в той же фокальной плоскости. Важно, что уровень положительного давления является достаточно сильным, чтобы избежать закупорки наконечника, но не слишком сильно, чтобы нарушить первую запись целой клетки. Это приводит к положительным давлением, вызывающего движение в течение 2-3 нейронов от электрода, когда он впервые попадает в срез.
      5. Найдите постсинаптическую партнера в подобной фокальной плоскости к первому пресинаптической записи (Рисунок 2C). Запись, как правило, Obtain паре записи между CA3 пирамидальных нейронов второй одноклеточные от 0-200 мм нейрона первого гапись (Цифры 2C, D).
         ПРИМЕЧАНИЕ: синаптической передачи между нейронными пар стабильны в течение периодов времени до 3-4 ч при использовании этих стандартных целые методы записи клеток.
3. Синаптической пластичности: Однажды получения успешным синаптически-подключен пара пирамидальные клетки (3А, Б), изучить характеристики синаптической передачи и пластичности.
   1. LTP индукции.
      1. Вызвать LTP путем спаривания пресинаптические потенциалы действия (1 Гц) с постсинаптической деполяризации до -10 0 мВ в течение 1 мин (Рисунок 3C) ^7-9,12-14. Запустить процесс подключения пределах 10 минут взлома к постсинаптического нейрона.
         Примечание: LTP также может быть индуцирован с обеих нейронов, проведенных в текущем зажима путем спаривания пресинаптические и постсинаптические потенциалы действия с частотой 1 Гц в течение 1 мин, при постсинаптических потенциалов действия вызвали 10 мс после инъекции тока в пресинаптической нейрон ⁸ .
   2. Кроме того побудить ООО низкой частоты стимуляции (LFS) с частотой 1 Гц в сочетании с небольшим деполяризации постсинаптического нейрона к -55 мВ в течение 5-10 мин (Рисунок 3C) ^9.

Результаты

Синаптические связи очевидно, стимулируя пресинаптическое нейрон стрелять потенциал действия, передавая деполяризующего импульса тока (обычно 20-50 Па в течение 20 мс) с помощью регистрирующего электрода. Постсинаптической, ток затем исследовали на присутствие моносинаптического EPSC вы...

Обсуждение

Здесь мы описали требования по созданию успешных парные целые записи клеток в органотипических гиппокампа культур срез. Парные записи также может быть выполнена в нескольких препаратов, в том числе острых ломтиками и диссоциированных культур систем ^26,27. Хотя основное внимание з...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minimum Essential Medium			Stable motorized micromanipulators
Penicillin-Streptomycin solution			Shallow tissue bath
HEPES buffer solution			DIC camera
1 M Tris stock solution			Amplifier
Hank’s Balanced Salt Solution			Computer
Horse Serum			Vibration isolation table
Plastic-coated miniature spatulas			Upright microscope
Soft paintbrush			Data acquistion and analysis software
Manual tissue chopper			Electrode puller
#2 Filter paper			Faraday cage
#5 Forceps
Membrane inserts
CO2 incubator
Dissection hood
Class II hood