Appariés enregistrements de cellules entières dans organotypiques coupes d'hippocampe

Résumé

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Résumé

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Introduction

Les récepteurs du glutamate médient la majorité de la transmission synaptique excitatrice dans les synapses du système nerveux central. Les deux principaux sous-types de récepteurs ionotropiques du glutamate localisées à la tête de la colonne vertébrale de la membrane post-synaptique sont la N-méthyl-D-aspartate (NMDA) et α-amino-3-hydroxy-5-méthylisoxazole-4-propionique acide (AMPA) des récepteurs. A des potentiels de membrane au repos, les récepteurs AMPA portent plus du courant post-synaptique au cours de la transmission synaptique. Dans l'hippocampe, le récepteur NMDA joue un rôle clé dans le déclenchement de l'évolution du nombre de récepteurs de l'AMPA dans la membrane post-synaptique: en agissant comme un "détecteur de coïncidence" ¹ à initier des changements dans la force synaptique ^1, le récepteur NMDA participe aux mécanismes synaptiques qui sont pensés pour soutenir l'apprentissage et la mémoire à un niveau subcellulaire. En réponse à la dépolarisation du neurone post-synaptique en parallèle avec la libération du transmetteur présynaptique, le calcium pénètre par le NMDArécepteur pour lancer l'insertion du récepteur AMPA ou d'enlèvement ^2. Cette dynamique des récepteurs à la base de plasticité synaptique: une augmentation de la force synaptique est potentialisation à long terme ^2,3 (LTP), alors qu'une diminution de la force synaptique est la dépression à long terme ⁴ (LTD). Par conséquent, le mouvement du récepteur AMPA est considéré comme responsable de l'expression de la plasticité synaptique, tandis que les récepteurs NMDA sont considérées pour contrôler son induction.

Déterminer les mécanismes précis qui sous-tendent la transmission synaptique et la plasticité nécessite l'étude de petites populations de synapses, idéalement synapses individuelles. Alors que certaines synapses sont parfaitement adaptés pour l'étude à ce niveau, par exemple, le calice de Held ^5, pour les populations les plus synaptiques ce qui est extrêmement difficile en raison de la petite et diffuse la nature des connexions synaptiques. Deux principales techniques d'électrophysiologie ont été développés pour examiner les connexions synaptiques simples: La première est la stimulation minimale, where une fibre présynaptique est présumé stimulée extracellulaire. La deuxième technique est jumelé enregistrements, où deux enregistrements simultanés de cellules entières de neurones reliés par des synapses est effectuée. Un avantage majeur de stimulation minimal est qu'elle est rapide et relativement simple à réaliser, comportant le placement d'une électrode de stimulation extracellulaire dans le tube tout en enregistrant simultanément des axones d'un neurone post-synaptique. La principale préoccupation lors de l'utilisation de cette technique est que la stimulation fiable d'une seule cellule peut rarement être garantie procès après procès.

Au cours des quinze dernières années, nous avons utilisé couramment associé enregistrements de cellules entières de deux neurones pyramidaux reliés par des synapses ^6-17. L'avantage majeur de cette technique est que seul neurone présynaptique est stimulée cohérente et fiable. Il permet aussi non seulement la caractérisation électrophysiologique, mais aussi la manipulation pharmacologique du neurone présynaptique ^{6,18 <}/ Sup>. Cependant, la probabilité de la connectivité synaptique entre les neurones est faible, ce qui rend difficile les paires connectées à obtenir ^19. L'utilisation de cultures de tranches de cerveau organotypiques de contourner cet obstacle comme la connectivité synaptique peut rétablir in vitro et d'ailleurs la nature de la connexion qui en résulte est semblable à celle dans le tissu cérébral ²⁰ native. En outre, les cultures organotypiques expriment LTP, LTD ^{7-10,12-15,21} et d'autres formes de plasticité synaptique à court terme, y compris la facilitation double choc (PPF) et la dépression (PPD) ^6,22,23, permettant mécanismes de plasticité à être étudiée dans des paires de neurones. Nous décrivons ici en détail la méthodologie nécessaire pour atteindre des succès enregistrements appariés dans ce système in vitro. Cette information peut aisément être adapté à d'autres systèmes expérimentaux, y compris les tranches aiguës et d'autres régions du cerveau.

Protocole

Déclaration d'éthique animale:

Les protocoles décrits dans ce manuscrit suivent les directives de protection des animaux établies par l'Université d'Auckland et de l'Université de Stanford. Les ratons P7 ont été euthanasiés par décapitation rapide. Dissection de l'hippocampe est alors immédiatement effectué comme décrit ci-dessous.

1. organotypique hippocampe Slice Culture

1. Préparation
   1. Préparer dissection moyen (utilisé seulement pour la dissection du cerveau). Mélanger 200 ml de milieu essentiel minimum, 2 ml de solution de pénicilline-streptomycine (10 000 unités de chaque, dans 0,85% de NaCl), 5 ml de solution tampon HEPES, 2 ml de Tris 1 M solution stock (pH 7,2), et stériliser par filtration avec filtre de 0,22 um . Effectuer une dissection de l'hippocampe dans le milieu de dissection glacée.
   2. Refroidir le milieu de dissection. Placer le support de dissection au congélateur environ 1 heure avant le début de la dissection jusqu'à ce que le liquide est très froid. Ne pas laisser grand cr de glaceystals à former. Stocker sur la glace jusqu'à ce que nécessaire.
   3. Préparer le milieu de culture (utilisé pour tout, sauf de dissection hippocampes). Mélanger 100 ml de milieu essentiel minimum (concentration de 1 x, liquide) w / des sels de Hank, w / L-glutamine, 2 ml de solution de pénicilline-streptomycine (liquide, 10 000 unités de chaque, dans NaCl à 0,85%), 2,5 ml de HEPES 1 M de tampon solution, 50 ml solution saline équilibrée de Hank, 50 ml de sérum de cheval (défini, inactivé par la chaleur), et stériliser par filtration avec filtre de 0,22 um.
   4. Préparer les boîtes de culture. Placer 1 ml de milieu de culture par boîte de 35 mm de la culture, et ajouter un insert de membrane à chaque plat. Mettre en place à sept de ces plats dans une boîte de Pétri de 150 mm (ci-après comme «plaque»). Placer la plaque dans un incubateur à CO ₂ pendant au moins une heure avant le début de la dissection, afin que le milieu de culture dans les plats atteint la température et le pH approprié.
2. Dissection de la hippocampes de rats chiots à Jour Post-natal 7 (P7)
   1. Pré-stériliser tous les outils de dissection sous lumière UV avant la procédure.
   2. Après décapitation rapide, retirer le cerveau et le lieu dans un milieu réfrigéré dans un plat, et puis la retirer pour un morceau de papier filtre humidifié pour la dissection. Taquiner le cortex loin du mésencéphale utilisant émoussés lisses spatules décoratifs recouverts de plastique, ce qui expose l'hippocampe. Couper le cul de sac, puis retirez doucement la spatule sous l'hippocampe pour la retourner (Figure 1A).
      NOTE: Le succès des cultures de tranche peuvent être préparés en utilisant des animaux jusqu'à P10.
   3. Coupez l'hippocampe isolé loin du reste du cerveau. Transférer la hippocampes dans un nouveau plat contenant médias de dissection froide à l'aide d'un pinceau doux humide (par exemple, blanc sable # 4).
   4. Nettoyez le dessous (c'est à dire le côté plat) de l'hippocampe de plexus choroïde lors de la dissection, comme ces tissus spongieux, Meninge-comme il est difficile de séparer l'hippocampedes tranches les unes des autres par la suite.
      REMARQUE: Laissez ces tissus en place si elles ne peuvent pas être taquiné loin doucement.
   5. Effectuer l'ensemble de dissection aussi rapidement que possible sans endommager le hippocampes.
      REMARQUE: Une dissection minutieuse est plus important que d'un, rapide, aussi longtemps que les conditions expérimentales sont refroidis. Trancher le hippocampes de rats trois simultanément. L'état de santé de la tranche ne soit pas affectée aussi longtemps que le temps total du début à lorsque les tranches étalées entrent dans l'étuve est de moins de 30 min.
3. Tranchage
   1. Couper les hippocampes transversalement en 400 um sections en utilisant une trancheuse manuelle des tissus. La méthode par laquelle le découpage est réalisé n'est pas important, tant qu'il n'est pas trop dommageable pour le tissu et produit des tranches d'épaisseur uniforme avec une architecture laminaire facilement visible (c'est à dire la corne d'Ammon est facile de voir à conserver dans le tissu).
   2. Allongez la hippocampes sur la scène du tissuhachoir sur une triple épaisseur de # 2 de papier-filtre. Le hippocampes sont entièrement tranché sans retirer les tranches individuellement (c'est à dire l'ensemble de l'hippocampe est laissé sur la scène de l'hélicoptère jusqu'à ce que toutes les coupes ont été faites, mais plutôt comme des miches de pain tranché à ce stade, figure 1B).
   3. Transférer la hippocampes dans le milieu de dissection à l'aide d'un pinceau doux posé à côté de l'hippocampe (blanc sable 2 #). Poussez doucement chaque hippocampe sur le côté pour briser l'adhérence entre l'hippocampe et le papier filtre sous-jacent. Rouler la brosse sous chaque hippocampe à ramasser sur la scène. Placez tous les hippocampes dans la même boîte de Pétri de 35 mm de milieu de dissection froide. Séparez les hippocampes en tranches individuelles en agitant manuellement le plat en alternant mouvements droite et à gauche.
   4. Inspectez les tranches sous un microscope à dissection et supprimer tout ce qui est endommagé, petit, ou qui ne possèdent pas de cellule visiblecouches de corps.
      NOTE: Il sera souvent le cas que toutes les tranches sont séparés de leur fratrie avec succès de cette façon. Dans ce cas, ils peuvent être séparés en les tournant sur le bord et à les pousser du bout des pinces fines. Les «bons» des tranches sont ensuite transférés dans un autre plat propre Petri contenant un milieu de dissection froide à l'aide d'une pipette Pasteur coupée et polie à la flamme (figures 1C-E).
4. Stockage
   1. Placez les tranches individuelles sur les cartouches filtrantes à membrane. Avec une pipette Pasteur coupée et le feu poli pour donner un plus gros calibre, transférer individuellement tranches les inserts de culture.
      REMARQUE: La taille du trou créé lors de la coupe et la pipette de polissage-le-feu est important. Trop petit et les tranches ne seront pas facilement quitter la pipette pour la membrane. Fluide trop grand excès et est placé sur la surface de la membrane avec la tranche. Le diamètre de l'alésage mieux est généralement d'environ la moitié de la diammètre du cylindre de la pipette. Lors de la coupe, ce diamètre peut être choisi en coupant au bon endroit sur le cône de la pipette.
   2. Transfert tranche
      1. Remplir la pipette avec le milieu, et ensuite aspirer une seule tranche de petites forces d'aspiration. Cela permet de maintenir la tranche près de l'ouverture de la pipette et empêche l'expulsion trop fluide dans l'insert de placer la tranche.
      2. Appliquez une légère pression sur l'ampoule afin de former une petite goutte de suspension, permet la tranche de s'installer dans cette gouttelette, puis touchez que des gouttelettes de la membrane et laisser la tranche «chute» sur la membrane. Généralement trois tranches sont placées sur chaque insert de membrane.
         REMARQUE: si la gouttelette de liquide est trop importante, les gouttes provenant des trois tranches ont tendance à fusionner sur la surface de la membrane, et les tranches seront donc tout rassembler vers le centre de la membrane, ce qui rend plus difficile de les séparer pour l'enregistrement électrophysiologique par la suite.
   3. Enlev fluideal
      1. Aspirer tout milieu en excès de la partie supérieure de l'insert de plaque de culture de toutes les tranches en ce que la plaque (3 tranches par plaquette = 21 tranches par plaque), de sorte que les tranches ne sont pas immergés dans ou entourés par un réservoir de milieu de dissection.
      2. Effectuez ce soit avec un non coupée, mais poli-feu pipette Pasteur. Laisser la tranche de régler et d'adhérer à la membrane pendant une minute avant pipetage. Prenez soin de ne pas aspirer la tranche dans la pipette. Effectuer le retrait de fluide pour les inserts qui sont immatriculés en premier lieu, à laisser suffisamment de temps pour les tranches de s'installer.
   4. Tranche de stockage
      1. cultures tranche de magasin dans un incubateur à _CO2 de 5,0% à 37 ° C. Observez la disposition finale des cultures de la figure 1E. Les tranches individuelles reposent sur un insert de plaque de culture qui a une membrane poreuse d'un fond, et s'ajuste à l'intérieur de cette pièce une boîte de Pétri remplie avec une petite quantité de milieu; par ce moyen, les tranches ne sont pas immergés dans la medium, mais elle est ouverte uniquement à travers la membrane au fond de l'insert de plaque de culture.
      2. Eventuellement, retirer les tranches de l'étude peut, soit en retirant l'insert de plaque de culture ou en découpant une section de la membrane de l'insert contenant une tranche.
5. Entretien
   1. Remplacer le milieu dans les boîtes de Pétri jours après la prise de cultures. Transfert de l'insert de plaque de culture à une nouvelle boîte de Pétri contenant 1 ml de milieu de culture frais qui est équilibrée dans l'incubateur pendant au moins une heure avant le transfert.
   2. Changer le milieu de nouveau de la même manière, le troisième jour après la prise de cultures. Le troisième jour, le transfert des cultures à un incubateur réglé à 34 ° C. Changer le support deux fois par semaine (tous les 3-4 jours).
   3. Identifier les cultures saines. Sélectionnez cultures saines pour les enregistrements de cellules entières paires.
      REMARQUE: Les cultures en bonne santé ont un bord bien défini et une couche de cellules pyramidales clairement définie. Cultures d'esprith foncé (nécrotique probable) zones présente un aspect ou vacuole avec des frontières aplaties sont rejetées. En utilisant ces critères, normalement les deux tiers de cultures de tranches sont suffisamment saine pour l'enregistrement.
   4. Utiliser ces cultures dans un délai assez petite fenêtre de temps. Ne pas les tissus utilisés qui sont cultivées depuis plus de deux semaines que les neurones commencent à afficher un comportement légèrement épileptique qui s'aggrave lentement avec le temps. La limite supérieure exacte de la survie neuronale n'est pas connu, mais il est possible d'enregistrer le fonctionnement des cellules pyramidales aussi tard que 16 semaines en culture.

2. paires enregistrements de cellules entières

1. ACSF et Solutions intracellulaires
   1. Préparer la solution d'électrode présynaptique en mélangeant (en mM) 120 gluconate de potassium, 40 HEPES, 5 _MgCl2, 2 NaATP, et 0,3 NaGTP (pH 7,2 avec KOH, osmolarité: 290 mOsm). Alors que la même solution de l'électrode est utilisée pour les neurones post-synaptiques, gluconate de césium (120 mM) Est généralement utilisé comme le principal sel dans l'électrode post-synaptique, plus mM QX314 5.
      NOTE: Ceci permet de serrage de tension stable à des potentiels positifs pour enregistrer les courants NMDAR médiation post-synaptiques ^8-10,13. Elle empêche également l'hyperexcitabilité induite par le potassium, le neurone présynaptique de la solution en écoulement interne de l'électrode d'enregistrement avant un joint postsynaptique de giga ohm est faite.
   2. Préparer la solution d'électrode postsynaptique composition (en mM) 120 gluconate de césium, 40 HEPES, 5 _MgCl2, 5 QX314, NaATP 2, et 0,3 NaGTP (pH 7,2 avec CsOH, osmolarité: 290 mOsm). Tirez microélectrodes de verre à 5-10 résistance de MQ et remplir avec une solution interne filtré.
   3. Préparer le liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) composition (en mM) 119 NaCl, 2,4 KCl, 1,3 MgSO _4, 2,4 _CaCl2, 1 Na ₂ HPO _4, 26,2 NaHCO _3, 11 glucose, pH 7,4, saturé avec 95% O _2, 5 % de CO _2. REMARQUE: Si r AMPAR médiationEPONSES doivent être bloquées pour l'examen des NMDAR EPSCs, comprennent 10 uM CNQX ou NBQX dans l'ACSF.
2. Obtenir jumelés entiers enregistrements cellulaires
   1. Pour examiner la transmission synaptique entre deux neurones individuels, désigner un neurone comme le neurone présynaptique et maintenir pince de courant pour induire des potentiels d'action et de lancer la transmission synaptique.
   2. Désigner le deuxième neurone, comme le neurone post-synaptique, et le maintenir en pince de courant ou de tension en fonction de l'information requise par le chercheur. Obtenir un examen détaillé des courants glutamatergiques, avec EPSCs AMPAR médiation examinés à -65 mV et EPSCs NMDAR médiation examinés à +30 mV ^6-16 en tenant le neurone post-synaptique de la tension de serrage
   3. Établir un enregistrement associé. Pour établir un enregistrement associé, l'enregistrement de la cellule entière présynaptique on obtient toujours la première, permettant à plusieurs neurones post-synaptiques séquentielles à obtenir jusqu'à celui qui est synaptique actuellement connectésd est obtenu. Si la réalisation d'expériences de plasticité synaptique, il est particulièrement important d'obtenir le premier neurone présynaptique comme l'induction de la LTP dans le neurone post-synaptique doit être initiée dans les 10 minutes de l'obtention de l'ensemble des enregistrements de cellules de lavage pour éviter les facteurs cytoplasmiques nécessaires à ^8,19 LTP.
   4. Éviter la perte cellulaire induite par le mouvement. Un défi majeur lors de l'exécution des enregistrements de cellules entières paires est d'éviter les vibrations et les perturbations induites mouvement du premier enregistrement de la cellule entière tout en obtenant le deuxième enregistrement.
      1. Obtenir le premier enregistrement de cellules entières et de passer ensuite au microscope objectif 10-200 pm de l'axe x de telle sorte que l'enregistrement créé est situé au bord de la zone visible sur l'écran (figure 2A).
      2. Soulevez la lentille du microscope ~ 5-10 mm, tout en assurant que le ACSF maintient toujours le contact avec la lentille. Montez la seconde électrode et de guider dans le ménisque de fluide (figure 2B ).
      3. Déplacer l'électrode dans le plan xy jusqu'à ce qu'il soit directement sous le trajet de la lumière à travers la lentille, mais encore de façon significative au-dessus de l'électrode d'enregistrement établi. Une fois que l'électrode est visible au microscope, est de veiller à la pointe à l'extrémité de l'écran éloignée de la première électrode.
      4. Déplacer la deuxième électrode vers le bas dans l'ordre de la mise au point du microscope jusqu'à ce que les deux électrodes sont dans le même plan focal. Il est important que le niveau de pression positive est suffisamment forte pour éviter le blocage pointe, mais pas trop forte de manière à interrompre le premier enregistrement de cellules entières. Cela se traduit par la pression positive induire un mouvement à 2-3 neurones à partir de l'électrode quand il pénètre dans la tranche.
      5. Trouver un partenaire post-synaptique dans un plan focal similaire au premier enregistrement pré-synaptique (figure 2C). L'enregistrement est généralement jumelé obtenir des enregistrements entre les neurones pyramidaux CA3 la deuxième de cellules entières d'un 0-200 mm neurone de la première rnregistrement (figures 2C, D).
         REMARQUE: La transmission synaptique entre deux neurones sont stables sur des périodes allant jusqu'à 3-4 heures lors de l'utilisation de ces techniques d'enregistrement de cellules standards entiers.
3. Plasticité synaptique: Once Upon obtenir un succès paire de cellules pyramidales synaptique connecté (3A Figures, B), examiner les caractéristiques de transmission et la plasticité synaptique.
   1. Induction de LTP.
      1. Induire la LTP en associant des potentiels d'action présynaptiques (1 Hz) avec une dépolarisation post-synaptique à -10 à 0 mV pendant 1 min (figure 3C) ^7-9,12-14. Procédez au couplage à moins de 10 min de pause dans le neurone post-synaptique.
         REMARQUE: LTP peut aussi être induite par les neurones qui s'est tenue à pince de courant en associant des potentiels d'action présynaptiques et post-synaptiques à 1 Hz pendant 1 min, avec des potentiels d'action post-synaptiques suscité 10 ms après l'injection de courant dans le neurone présynaptique ⁸ .
   2. En outre induire LTD par une faible stimulation de fréquence (EPA) à 1 Hz combinée à une légère dépolarisation du neurone post-synaptique à -55 mV pendant 5-10 min (figure 3C) ^9.

Résultats

Connectivité synaptique est évident en stimulant le neurone présynaptique de tirer un potentiel d'action en passant une impulsion de courant de dépolarisation (typiquement 20-50 pA pour 20 ms) via l'électrode d'enregistrement. La trace de courant post-synaptique est alors examiné pour rechercher la présence d'un RPEC monosynaptique évoquée à court (<5 ms) et des temps de latence cohérents après le pic du potentiel d'action présynaptique (Figure 3A). Dans la plupart de...

Discussion

Ici, nous avons décrit les exigences pour établir des enregistrements cellulaires succès paires entières dans les cultures de tranches d'hippocampe organotypiques. Les enregistrements par paires peuvent également être effectuées dans plusieurs préparations, y compris les tranches aiguës et des systèmes de culture ^26,27 dissociées. Si l'accent a été mis sur l'induction de formes plus longues de la plasticité synaptique (à savoir LTP et LTD), il est important de souligner que les enre...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minimum Essential Medium			Stable motorized micromanipulators
Penicillin-Streptomycin solution			Shallow tissue bath
HEPES buffer solution			DIC camera
1 M Tris stock solution			Amplifier
Hank’s Balanced Salt Solution			Computer
Horse Serum			Vibration isolation table
Plastic-coated miniature spatulas			Upright microscope
Soft paintbrush			Data acquistion and analysis software
Manual tissue chopper			Electrode puller
#2 Filter paper			Faraday cage
#5 Forceps
Membrane inserts
CO2 incubator
Dissection hood
Class II hood