器官型海馬スライスにおけるペア全細胞記録

要約

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

要約

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

概要

グルタミン酸受容体は、中枢神経系のシナプスにおける興奮性シナプス伝達の大部分を媒介する。シナプス後膜のスパインヘッドであるN-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）に局在するイオンチャネル型グルタミン酸受容体の二つの主要なサブタイプおよびα-アミノ-3 - ヒドロキシ-5 - メチルイソオキサゾール-4 - プロピオン酸（AMPA）受容体。静止膜電位では、AMPA受容体がシナプス伝達の間にシナプス後電流の大部分を運ぶ。海馬では、NMDA受容体はシナプス後膜におけるAMPA受容体の数の変化を誘発するのに重要な役割を果たしている：「一致検出器」として作用することにより^1は 、シナプス強度¹の変更を開始するために、NMDA受容体はシナプスのメカニズムに関与してそれは細胞下レベルで学習と記憶を下支えすると考えられている。シナプス前伝達物質放出と平行してシナプス後ニューロンの脱分極に応答して、カルシウムは、NMDAを経由して入る受容体はAMPA受容体の挿入または取り外し^2を開始する。これらの受容体の動態は、シナプス可塑性の基礎となる：シナプス強度の低下が長期抑圧^4（LTD）である、シナプス強度の増大が、長期増強の^2,3（LTP）である。 NMDA受容体は、その誘導を制御すると考えられているつつAMPA受容体の移動は、シナプス可塑性の発現に関与すると考えられている。

シナプス伝達と可塑性の基礎となる正確なメカニズムを決定することは、シナプスの小集団、理想的には単一のシナプスを研究する必要があります。いくつかのシナプスが、このレベルでの研究のために非常に適しているが、 例えば ^、5開催の萼は、ほとんどのシナプス集団についてこれは、シナプス結合の小と拡散自然に非常に困難である。二つの主要な電気生理学的技術は、単一のシナプス結合を調べるために開発されている：最初は最小限の刺激であり、機種では電子1シナプス前繊維は細胞外刺激さと推定される。第2の技術は、シナプス接続ニューロンからの2同時ホールセル記録が行われ録音を、ペアになっています。最小限の刺激の主な利点は、それが同時にシナプス後ニューロンから記録しながら軸索管への細胞外刺激電極の配置を含む、実行するために迅速で比較的簡単であることである。この技術を用いて第一の関心事は、単セルの信頼性のある刺激はめったに裁判後に裁判を保証しないことができるということである。

過去15年間で私たちは、日常的に2シナプス接続錐体ニューロン^6-17からペアリングホールセル記録を使用している。この技術の主な利点は、1つのシナプス前ニューロンが一貫して確実に刺激されることである。また、電気生理学的特性評価だけでなく、シナプス前ニューロン^6,18の薬理学的操作だけではないことができます^</ SUP>。しかし、ニューロン間のシナプス接続の確率は^、19を得るために接続されたペアが困難に低い。シナプス接続は、インビトロ、得られた接続性、さらに自然に再確立できるように、器官型脳切片培養物の使用は、この障害を回避するネイティブ脳組織²⁰と同様である。さらに、器官培養物は可塑性にメカニズムを有効にする、対になったパルスの円滑化（PPF）とうつ病^{（PPD）6,22,23}を含む短期シナプス可塑性のLTP、LTD ^{7-10,12-15,21}と追加のフォームを表現ニューロンのペアで研究される。ここでは、正常にこのin vitro系でのペアの録音を達成に関わる詳細な方法論について説明します。この情報は、容易に急性スライスおよび他の脳領域を含む他の実験系に適合させることができる。

プロトコル

動物倫理に関する声明：

この原稿に記載されているプロトコルは、オークランドとスタンフォード大学の大学によって確立された動物のケアのガイドラインに従ってください。 P7の仔ラットは、迅速な断頭により安楽死させた。海馬切開をその後直ちに以下に記載のように行われる。

1器官海馬スライス培養

1. 準備
   1. （脳を解剖するためにのみ使用）解剖培地を作製。 、5ミリリットルHEPES緩衝液、2ミリリットル1Mトリスストック液（pH7.2）（0.85％NaCl中各10,000単位）200ミリリットル最小必須培地、2ミリリットルのペニシリン - ストレプトマイシン溶液を組み合わせ、およびフィルターは、0.22μmのフィルターを用いて滅菌する。氷のように冷たい解剖培地中で海馬解剖を行ってください。
   2. 解剖媒体を冷却する。冷凍庫に液体が非常に寒いになるまで解剖を開始する前に約1時間を解剖メディアを配置します。大きな氷​​CRを許可しない形成するystals。必要になるまで氷上で保管してください。
   3. （海馬の解剖を除いてすべてのために使用される）培養液を準備します。 100ミリリットルの最小必須培地を組み合わせて、（1×濃度、液体）ハンクス塩/ W、L-グルタミン/ W、2ミリリットルのペニシリン - ストレプトマイシン溶液（0.85％NaCl中の液体、それぞれ1万台）、2.5ミリリットルのHEPES、1Mバッファソリューション、50ミリリットルハンクス液を50mlウマ血清（定義された、熱不活性化）、フィルター、0.22μmのフィルターで滅菌する。
   4. 培養皿を準備します。 35mm培養皿あたりの培地の1ミリリットルを置き、それぞれの皿にメンブレンインサートを追加します。 1 150ミリメートルペトリ皿にこれらの料理の7まで使用すること（「プレート」と呼ぶ）。皿中の培地は、適切な温度およびpHを達成するように、解剖が始まる前に、少なくとも1時間、CO ₂インキュベーターでプレートを置きます。
2. 生後7日目のラット仔から海馬の解剖（P7）
   1. 手順の前に、UV光の下ですべての解剖ツールを事前に滅菌する。
   2. 迅速な断頭後、一皿に冷やした培地中に脳と場所を削除し、解剖用の湿らせた濾紙片にそれを削除します。海馬を露出させ、鈍い滑らかなプラスチックでコーティングされたミニチュアスパチュラを使用して離れて脳からの皮質をいじめる。円蓋をカットした後、静かに（ 図1A）、それを反転する海馬の下にへらを働く。
      注：正常スライス培養は、P10まで動物を用いて調製することができる。
   3. 離れて脳の残りの部分から分離された海馬をトリミング。湿らせた柔らかい絵筆を使用して冷却された解剖メディアを含む新しい皿に海馬の転送（ 例えば 、白クロテン＃4）。
   4. 解剖時の脈絡叢の海馬の下側（ すなわち 、より平坦側）を清掃して、これらのスポンジ状、meninge様組織は、それが困難な海馬を分離するために作るように後で互いにスライス。
      注：彼らは静かにからかわできない場合には所定の位置にこれらの組織のままにしておきます。
   5. 海馬を損傷することなく、可能な限り迅速に全体解剖を行ってください。
      注：慎重な解剖限り実験条件が冷えているように、高速で1よりも重要である。同時に3匹のラットからの海馬をスライス。スライスの健康は限り最初からメッキスライスはインキュベーターに行くときに合計時間が30分の下にあるように影響を受けません。
3. スライシング
   1. 手動の組織スライサーを使用して、400μmの横断面に横方向に海馬をスライス。スライスが実施される方法は、それが組織に過度に有害ではないと（ つまり、アモンのホーンを容易に組織内に保存されるように見られている）は、容易に目に見える層状アーキテクチャと整合厚さのスライスを生成するように、重要ではありません。
   2. 組織のステージに海馬うそ＃2ろ紙のトリプル厚さの上にチョッパー。海馬は（むしろこの時点でスライスされたパンのパンのように、 図1B全てのカットが行われたまで、 すなわち全体の海馬がチョッパーのステージ上に残っている）は、個別のスライスを削除せずに完全にスライスされている。
   3. 次の各海馬（白クロテン＃2）に敷設ソフト絵筆を使って解剖培地に海馬を転送します。静かに海馬とその下のろ紙の間の接着を破壊する側にそれぞれ海馬を押してください。段階からそれを拾うために、各海馬の下にブラシをロールバックします。チルド解剖媒体の同じ35ミリメートルペトリ皿にすべての海馬を置きます。手動で右回りと左回りの運動を交互に料理を攪拌することにより、個別スライスに海馬を分離します。
   4. 解剖顕微鏡下でスライスを点検し、損傷している任意のものを捨て、小さな、またははっきりと目に見える細胞を有しないものボディ層。
      注：それは多くの場合、すべてのスライスが正常に、このように自分の兄弟から分離されるわけではない場合になります。この場合、それらはエッジに回し、微細鉗子の先端とそれらをつついて分離することができる。 「良い」のスライスは、その後、カットオフとファイアーポリッシュパスツールピペット（ 図1C-E）を使用して冷却された解剖培地を含む別のきれいなペトリ皿に移している。
4. ストレージ
   1. メンブレンフィルターインサート上に個別のスライスを配置します。パスツールピペットを使用すると、個別に培養インサートにスライスを転送し、遮断し、火が大きなボアを与えるために研磨。
      注：切断·ピペットを火研磨する際に作成した穴の大きさが重要です。小さすぎるとスライスを簡単膜用ピペットを残すことはありません。大きすぎると過剰な流体は、スライスとともに、膜の表面上に配置されている。最高のボア径は、典型的には約半分DIAMですピペットのバレルのETER。切断時に、この直径は、ピペットのテーパーに適切な場所で切断することにより選択することができる。
   2. スライス転送
      1. 第1の媒体とのピペットを記入してから、小さな吸引力で、単一のスライスを吸い上げる。これはピペットの開口部付近のスライスを保持し、スライスを配置し、挿入にあまりにも多くのメディアの追放を防ぐことができます。
      2. 小さな吊り滴を形成するために、電球にわずかな圧力をかけ、スライスがその液滴に落ち着くし、その後膜にその滴をタッチし、膜上にスライス」の秋 "をできるようにすることができます。一般的に3つのスライスは、各膜インサート上に配置されます。
         注：流体液滴が大きすぎると、3つのスライスからの液滴が膜表面上にマージする傾向があり、スライスは、したがって、すべてのことをより困難後で電気生理学的記録のためにそれらを分離すること、膜の中心に集まる。
   3. 流体Removアル
      1. スライスに浸漬または解剖媒体のプールに囲まれないように、そのプレートの全てのスライス（1つのインサートあたり3つのスライス=プレート当たり21スライス）のための培養プレートインサートの上部から余分なメディアを吸引除去する。
      2. 実行これはノーカットますが、ファイアーポリッシュパスツールピペットを使用することです。スライスが落ち着くし、ピペッティングの前に分間膜に付着することを許可する。アップピペットにスライスを吸うしないように注意してください。スライスが落ち着くのに十分な時間を可能にするために、最初にメッキされ挿入するための流体の除去を行う。
   4. スライスストレージ
      1. 37℃、5.0％CO ₂インキュベーターに保管してスライス培養。 図1Eにおける文化の最終配置を観察します。個別のスライスは、底部のための多孔質膜を有する培養プレートインサートに載る、このインサートは、少​​量の培地で満たされたペトリ皿内に収まる。これにより、スライスは私の中に浸漬されていませんdiumが、培養プレートインサートの下部にのみ膜を介してそれにアクセスすることができます。
      2. 必要に応じて、培養プレートインサートを削除するか、またはスライスを含有する挿入膜の一部を切り出してもよい研究のためのいずれかのスライスを削除します。
5. メンテナンス
   1. 文化を作った翌日ペトリ皿に培地を交換します。移す前に少なくとも1時間インキュベーター内で平衡化される新鮮な培養培地1mlを含む新しいペトリ皿に培養プレートインサートを転送します。
   2. 文化を行った後、三日目に同じ方法で再び培養液を交換する。 3日目に、34℃に設定したインキュベーターに文化を移す。 （3〜4日ごとに）各1週間に2回培養液を交換する。
   3. 健全な文化を特定します。対になった全細胞記録のための健全な文化を選択します。
      NOTE：健康な培養物は、明確に定義されたエッジと明確に定義された錐体細胞層を有している。文化ウィット現在または平坦化された境界線と空胞化外観時間暗（おそらく壊死性）の領域が拒否されます。これらの基準を採用し、スライス培養の通常の三分の二は、記録のために十分に健康である。
   4. 時間のかなり小さなウィンドウ内でこれらの培養物を利用する。ニューロンはゆっくりと時間とともに悪化し、わずかにてんかん様の挙動を表示し始めるので、2週間以上培養して組織を使用しないでください。ニューロンの生存の正確な上限は知られていないが、それは培養中の錐体細胞のような後半の16週間を機能し記録することができる。

2ペア全細胞記録

1. ACSFおよび細胞内ソリューション
   1. （単位：mm）120グルコン酸カリウム、40 HEPES、5のMgCl _2、2 NaATP、および0.3 NaGTP（;：290 mOsmで浸透圧KOHで7.2）を混合することにより、シナプス前電極液を調製します。同じ電極溶液はシナプス後ニューロンのために使用される一方、セシウム、グルコン酸（120mMの）は、典型的には、主要なシナプス後の電極中の塩に加え、5 mMのQX314として使用されます。
      注：これは、シナプス後NMDAR媒介電流^8-10,13を記録するために、正の電位で安定した電圧クランプを可能にします。また、ギガオームシールが行われる前に、シナプス後記録電極から流れる内部液によってシナプス前ニューロンのカリウム誘発性の過剰興奮を防ぐことができます。
   2. （単位：mm）を構成するシナプス後電極液120セシウムグルコン酸を準備し、40のHEPES、5のMgCl _2、5 QX314、2 NaATP、および0.3 NaGTP（CsOHを用いてpH 7.2;浸透圧：290ミリオスモル）。 5-10MΩの抵抗でガラス微小電極を引いて、濾過した内部液で満たされる。
   3. 人工脳脊髄液（ACSF）119のNaCl、2.4のKCl、（mM単位）構成を準備し、MgSO ₄ 1.3、2.4のCaCl _2、1mMのNa ₂ HPO _4、26.2のNaHCO _{3、95％O 2、5}で飽和した11グルコース、pH7.4で、 ％のCO _2。注：もしAMPAR媒介ResponsesはACSFで10μMのCNQXまたはNBQXを含む、NMDAR EPSCsの検査のためにブロックする必要がある。
2. ペア全体の細胞記録を入手
   1. 二つの個別のニューロン間のシナプス伝達を調べるために、シナプス前ニューロンのような1つのニューロンを指定し、活動電位を誘導し、シナプス伝達を開始するために電流クランプに保持します。
   2. シナプス後ニューロンのように、第二のニューロンを指定して、研究者が必要とする情報に応じた電流または電圧クランプでそれを保持。 -65 mVの電圧クランプにシナプス後ニューロンを保持することにより、30 mVの^6-16で調べNMDAR媒介EPSCsで調べAMPAR媒介EPSCsで、グルタミン酸作動電流の詳細な検査を取得
   3. 対になった記録を確立します。対になった記録を確立するには、シナプス前細胞全体の記録が常にシナプスconnecteあるものまで得ようとする複数の連続シナプス後ニューロンを可能にする、最初に得られ、dが得られる。シナプス可塑性の実験を行う場合には、シナプス後ニューロンにおけるLTPの誘導として最初のシナプス前ニューロンを得るために特に重要であるLTP ^8,19に必要な細胞質要因の洗い出しを防止するために、全細胞の記録を得るための10分以内に開始しなければなりません。
   4. 運動誘発性細胞損失を避けてください。対になった全細胞の記録を実行する主要な課題は、第二の記録を取得しながら、最初の全細胞記録の振動や動きによって誘発される混乱を避けている。
      1. 最初の全細胞記録を入手した後、確立された記録は、モニタ（ 図2A）に見えている領域の端に位置するように、x軸に顕微鏡レンズは10〜200μmを移動します。
      2. ACSFはまだレンズとの接触を維持することを保証しながら、顕微鏡〜5〜10ミリメートルのレンズを上げる。第二の電極をマウントし、流体メニスカス（ 図2Bに導く）。
      3. それがレンズを通る光の経路の直下にあるが、それでもかなり確立され、記録電極の上までxy平面に電極を移動します。電極は、顕微鏡下で表示されていると、先端が離れて第一の電極からのモニタの遠端にあることを確認してください。
      4. 両方の電極が同じ焦点面になるまで、顕微鏡を中心とした順番に第二の電極を下に移動します。これは、最初の全細胞記録を破壊するように、正圧のレベルが強すぎる先端の閉塞を回避するのに十分な強さではないことが重要である。これは、最初のスライスに入る電極から2-3神経細胞の移動を誘導する正圧に変換される。
      5. 最初のシナプス前の記録（ 図2C）と同様、焦点面におけるシナプス後パートナーを見つけます。録音は、一般に、第1、rの0〜200 mmのニューロンからCA3錐体ニューロン間のペアの録音第二全細胞を入手しているecording（ 図2C、D）。
         注：これらの標準的な全細胞記録技術を使用した場合、ニューロンの対の間のシナプス伝達は、最大3〜4時間の期間にわたって安定である。
3. シナプス可塑性：一度成功したシナプス接続された錐体細胞ペア（ 図3A、B）を取得すると、シナプス伝達と可塑性の特性を調べる。
   1. LTP誘導。
      1. 1分間0 mVの（ 図^{3C）7-9,12-14} -10にシナプス後脱分極とシナプス前活動電位（1 Hz）を組み合わせることで、LTPを誘導する。シナプス後ニューロンへの侵入の10分以内にペアリングを開始します。
         注：シナプス後活動電位がシナプス前ニューロン⁸への電流の10ミリ秒以下の注入を誘発してLTPはまた、1分間1Hzでシナプス前とシナプス後活動電位を組み合わせることで電流クランプで開催され、両方のニューロンと誘導することができるアップ。
   2. さらに5〜10分間（ 図^3C）9 -55 mVのにシナプス後ニューロンのわずかな脱分極と組み合わせる1Hzで低頻度刺激（LFS）でLTDを誘導する。

結果

シナプス接続は記録電極を経由して脱分極電流パルス（20ミリ用、一般に20〜50 PA）を渡すことによって、活動電位を発射するために、シナプス前ニューロンを刺激することによって明らかである。シナプス後現在のトレースは、次にシナプス前活動電位（ 図3A）のピークの後に短い（<5ミリ秒）で一貫性の潜時で誘発単シナプスEPSCの有無を調べる。シナプス接続されたペアを?...

ディスカッション

ここでは、器官型海馬スライス培養物において成功対の全細胞記録を確立するための要件を記載している。対になった記録はまた、急性スライスおよび解離培養系^26,27を含む複数の調製物中で行うことができる。ここでの焦点は、シナプス可塑性（すなわちLTP及びLTD）の長い形の誘導になって、それが器官全体細胞記録をペアにことを強調することが重要であり、急性スライスと細胞...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minimum Essential Medium			Stable motorized micromanipulators
Penicillin-Streptomycin solution			Shallow tissue bath
HEPES buffer solution			DIC camera
1 M Tris stock solution			Amplifier
Hank’s Balanced Salt Solution			Computer
Horse Serum			Vibration isolation table
Plastic-coated miniature spatulas			Upright microscope
Soft paintbrush			Data acquistion and analysis software
Manual tissue chopper			Electrode puller
#2 Filter paper			Faraday cage
#5 Forceps
Membrane inserts
CO2 incubator
Dissection hood
Class II hood