Associati a cellule intere registrazioni in organotipiche fettine di ippocampo

Riepilogo

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Abstract

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Introduzione

Recettori del glutammato mediano la maggior parte della trasmissione sinaptica eccitatoria a livello delle sinapsi del sistema nervoso centrale. I due principali sottotipi di recettori ionotropici del glutammato localizzate alla testa dorso della membrana postsinaptica sono N-metil-D-aspartato (NMDA) e α-ammino-3-idrossi-5-methylisoxazole-4-proprionic acido (AMPA) recettori. A riposo potenziali di membrana, i recettori AMPA portano la maggior parte della corrente post-sinaptica durante la trasmissione sinaptica. Nel ippocampo, il recettore NMDA svolge un ruolo chiave nello scatenare variazioni nel numero di recettori AMPA nella membrana postsinaptica: agendo come un "rivelatore coincidenza" ¹ per avviare cambiamenti nella forza sinaptica ^1, il recettore NMDA partecipa ai meccanismi sinaptici che si pensa di sostenere l'apprendimento e la memoria a livello subcellulare. In risposta alla depolarizzazione del neurone postsinaptico in parallelo con rilascio di neurotrasmettitore presinaptico, calcio entra attraverso l'NMDArecettore per avviare l'inserimento dei recettori AMPA o la rimozione ^2. Queste dinamiche recettori sono alla base della plasticità sinaptica: un aumento della forza sinaptica è a lungo termine ^2,3 potenziamento (LTP), mentre una diminuzione della forza sinaptica è la depressione a lungo termine ⁴ (LTD). Quindi il movimento del recettore AMPA è pensato per essere responsabile di espressione plasticità sinaptica, mentre i recettori NMDA sono pensati per controllare la sua induzione.

Determinare i precisi meccanismi alla base della trasmissione sinaptica e la plasticità è necessario studiare piccole popolazioni di sinapsi, idealmente singole sinapsi. Mentre alcune sinapsi sono molto adatti per lo studio a questo livello, ad esempio, il calice di Held ^5, per le popolazioni più sinaptici questo è estremamente difficile a causa della natura piccola e diffusa delle connessioni sinaptiche. Due principali tecniche di elettrofisiologia sono state sviluppate per esaminare le connessioni sinaptiche singoli: il primo è la stimolazione minima, DOVe una fibra presinaptica si presume stimolata extracellulare. La seconda tecnica è accoppiato registrazioni, in cui si svolge due registrazioni di cellule intere simultanee da neuroni sinapticamente collegati. Un vantaggio importante di stimolazione minima è che è rapido e relativamente semplice da eseguire, coinvolgendo il posizionamento di un elettrodo di stimolazione extracellulare nel tratto assonale e contemporaneamente registrare da un neurone postsinaptico. La preoccupazione principale quando si utilizza questa tecnica è che la stimolazione affidabile di una singola cellula può raramente essere garantita prova dopo prova.

Negli ultimi quindici anni abbiamo abitualmente utilizzati accoppiato registrazioni whole-cell da due neuroni piramidali sinapticamente collegati ^6-17. Il principale vantaggio di questa tecnica è che solo neurone presinaptico è coerente e affidabile stimolato. Inoltre permette non solo la caratterizzazione elettrofisiologica, ma anche la manipolazione farmacologica del neurone presinaptico ^{6,18 <}/ Sup>. Tuttavia, la probabilità di connettività sinaptica tra neuroni è basso, accoppiando collegati difficile ottenere ^19. L'utilizzo di culture fetta cerebrale organotipica aggira questo ostacolo come connettività sinaptica può ristabilire in vitro ed inoltre la natura della connettività risultante è simile a quello nel tessuto cerebrale nativo ^20. Inoltre, culture organotipiche esprimono LTP, LTD ^{7-10,12-15,21} e ulteriori forme di plasticità sinaptica a breve termine, tra cui la facilitazione paired-pulse (PPF) e depressione (PPD) ^6,22,23, consentendo meccanismi di plasticità a essere studiato in coppie di neuroni. Qui si descrive la metodologia dettagliata coinvolti nel raggiungimento di successo registrazioni appaiati in questo sistema in vitro. Questa informazione può essere facilmente adattato ad altri sistemi sperimentali, tra cui fettine acute e altre regioni del cervello.

Protocollo

Etica Animale Dichiarazione:

I protocolli descritti in questo manoscritto seguono le linee guida per la cura degli animali, istituito dall'Università di Auckland e la Stanford University. P7 ratti sono stati sacrificati da una rapida decapitazione. Dissezione ippocampale viene quindi eseguita immediatamente come descritto di seguito.

1 Organotipica ippocampale Fetta Cultura

1. Preparazione
   1. Preparare dissezione Media (utilizzato solo per sezionare il cervello). Unire 200 ml Minimum Essential Medium, 2 ml di soluzione di penicillina-streptomicina (10.000 unità di ciascuno, nel 0,85% NaCl), 5 ml di soluzione tampone HEPES, 2 ml di soluzione 1 M Tris (pH 7,2), e filtro sterilizzare con 0,22 micron filtro . Effettuare dissezione ippocampale in media dissezione ghiacciata.
   2. Raffreddare il medium dissezione. Posizionare il supporto di dissezione nel congelatore circa 1 ora prima di iniziare la dissezione fino a quando il liquido è molto freddo. Non permettere grandi cr ghiaccioystals per formare. Conservare in ghiaccio fino al momento.
   3. Preparare terreno di coltura (usato per tutto tranne la dissezione di ippocampi). Unire 100 ml Minimum Essential Medium, (concentrazione 1x, liquido) w / sali di Hank, w / L-glutammina, 2 ml di soluzione di penicillina-streptomicina (liquido, 10.000 unità di ciascuno, nel 0,85% NaCl), 2,5 ml di HEPES 1 M tampone soluzione, 50 ml di soluzione salina bilanciata di Hank, 50 ml di siero di cavallo (definito, calore inattivato), e filtro sterilizzare con 0,22 micron filtro.
   4. Preparare i piatti della cultura. Mettere 1 ml di coltura per 35 millimetri piatto di cultura, e aggiungere un inserto di membrana per ogni piatto. Mettere fino a sette di questi piatti in uno a 150 mm piastra di Petri (di seguito indicato come un 'piatto'). Porre la piastra in un incubatore CO ₂ per almeno un'ora prima della dissezione inizia in modo che il terreno di coltura nei piatti raggiunge la giusta temperatura e pH.
2. Dissezione del Hippocampi da Rat cuccioli a postnatale giorno 7 (P7)
   1. Pre-sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione sotto la luce UV prima della procedura.
   2. Dopo una rapida decapitazione, rimuovere il cervello e il luogo in media refrigerate in un piatto, e poi rimuoverlo per un pezzo di carta da filtro inumidita per la dissezione. Tease la corteccia dal mesencefalo utilizzando smussate spatole in plastica rivestita lisce in miniatura, esponendo l'ippocampo. Tagliare il fornice, e poi lavorare delicatamente la spatola sotto l'ippocampo per capovolgere fuori (Figura 1A).
      NOTA: Riuscito culture fetta possono essere preparati utilizzando animali fino a P10.
   3. Tagliare il ippocampo isolato dal resto del cervello. Trasferire il dell'ippocampo in un nuovo piatto contenente i media dissezione refrigerata utilizzando un pennello morbido inumidito (ad esempio, bianco sable # 4).
   4. Pulire la parte inferiore (cioè il lato piatto) dell'ippocampo del plesso coroideo durante la dissezione, in quanto tali, tessuti meninge-come spugnosi rendono difficile separare ippocampaleFette una dall'altra in seguito.
      NOTA: Lasciare questi tessuti in atto se non possono essere presi in giro dolcemente.
   5. Eseguire l'intero dissezione più rapidamente possibile senza danneggiare l'ippocampo.
      NOTA: Un attento dissezione è più importante di un veloce, a patto che le condizioni sperimentali sono refrigerati. Affettare il ippocampi da tre ratti contemporaneamente. La salute fetta non è influenzata purché il tempo totale dall'inizio a quando le fette placcati vanno in incubatore è sotto 30 min.
3. Affettare
   1. Affettare le dell'ippocampo trasversalmente in 400 micron sezioni utilizzando un'affettatrice manuale dei tessuti. Il metodo con cui il taglio è condotta non è importante, purché non sia troppo dannoso per il tessuto e produce fette di spessore costante con l'architettura laminare facilmente visibile (cioè corno di Ammon è facilmente visibile da conservare nel tessuto).
   2. Lie il dell'ippocampo sul palco del tessutochopper in cima a un triplo spessore di # 2 carta da filtro. Il ippocampi sono interamente a fette senza rimuovere alcun fette singolarmente (cioè l'intero ippocampo è lasciato sulla scena del chopper fino a quando sono stati fatti tutti i tagli, ma piuttosto come pagnotte di pane a fette, a questo punto, Figura 1B).
   3. Trasferire il ippocampi in mezzo dissezione con un pennello morbido di cui uno accanto ippocampo (bianco sable # 2). Spingere delicatamente ogni ippocampo di lato per rompere l'adesione tra l'ippocampo e la carta da filtro sottostante. Arrotolare la spazzola sotto ogni ippocampo a raccoglierla dal palco. Mettere tutti gli ippocampi nella stessa piastra da 35 mm di Petri di media dissezione refrigerata. Separare la ippocampi in singole sezioni agitando manualmente il piatto alternando movimenti in senso orario e antiorario.
   4. Ispezionare le fette sotto un microscopio da dissezione e scartare qualsiasi che vengono danneggiati, piccola, o che non possiedono cellule chiaramente visibilestrati del corpo.
      NOTA: Sarà spesso il caso che non tutte le sezioni sono separate con successo dai loro fratelli in questo modo. In questo caso, essi possono essere separati da trasformandoli sul bordo e li incitamento con le punte di una pinza sottile. "Good" fette vengono poi trasferiti in un altro piatto di Petri pulita contenente medio dissezione refrigerata utilizzando un cut-off e il fuoco-lucidato pipetta Pasteur (Figure 1C-E).
4. Conservazione
   1. Mettere le singole sezioni sugli inserti del filtro a membrana. Usando una pipetta Pasteur tagliato e fuoco lucido per dare un foro più grande, trasferire singolarmente fette agli inserti di cultura.
      NOTA: La dimensione del foro creato durante il taglio e il fuoco lucidare la pipetta è importante. Troppo piccolo e le fette non sarà facile lasciare la pipetta per la membrana. Fluido troppo grande e l'eccesso è posto sulla superficie della membrana assieme alla fetta. Il miglior diametro del foro è di solito circa la metà del diametrotro del barile della pipetta. Durante il taglio, questo diametro può essere scelto tagliando al posto giusto sul cono della pipetta.
   2. Fetta di trasferimento
      1. Riempire la pipetta con il mezzo prima, e poi aspirare una sola fetta con piccole forze di aspirazione. Ciò mantiene la fetta vicino all'apertura della pipetta e impedisce troppa medio espulsione nell'inserto per posizionare la fetta.
      2. Applicare una leggera pressione sul bulbo per formare un piccolo pensile goccia, consentono la fetta di stabilirsi in quella goccia, e poi toccare quella goccia alla membrana e lasciare la fetta "caduta" sulla membrana. Generalmente tre fette sono posizionati su ogni inserto di membrana.
         NOTA: Se la gocciolina liquido è troppo grande, le goccioline delle tre fette tendono a fondersi sulla superficie della membrana, e le fette saranno quindi tutto raccogliere al centro della membrana, il che rende più difficile separarli per la registrazione elettrofisiologica tardi.
   3. Remov Fluidal
      1. Aspirare ogni eccesso di terreno dalla parte superiore dell'inserto piastra di coltura per tutte le sezioni di quel piatto (3 fette per inserto = 21 fette per piastra), in modo che le fette non sono immersi in o circondati da un pool di media dissezione.
      2. Eseguire questo è con un non tagliato, ma il fuoco lucidato pipetta Pasteur. Lasciare che la fetta di stabilirsi e di aderire alla membrana per un minuto prima di pipettaggio. Fare attenzione a non risucchiare la fetta alto nella pipetta. Eseguire la rimozione del liquido per gli inserti che sono placcati in primo luogo, per dare il tempo sufficiente per le fette di stabilirsi.
   4. Fetta di archiviazione
      1. Culture fetta Conservare in CO ₂ incubatore 5,0% a 37 ° C. Osservare la disposizione finale delle culture in Figura 1E. Le singole sezioni poggiano su un inserto piastra di coltura che ha una membrana porosa per una parte inferiore, e questo inserto si inserisce all'interno di una capsula di Petri riempita con una piccola quantità di mezzo; in questo modo, le fette non sono immersi nel medium, ma ha accesso ad esso solo attraverso la membrana nella parte inferiore dell'inserto piastra di coltura.
      2. Facoltativamente, rimuovere le fette possono per motivi di studio o rimuovendo l'inserto piastra di coltura o tagliando fuori una sezione di membrana inserto contenente una fetta.
5. Manutenzione
   1. Sostituire il mezzo in piastre di Petri il giorno dopo aver fatto le culture. Trasferire l'inserto piastra di coltura di una nuova capsula di Petri contenente 1 ml di terreno di coltura fresco che viene equilibrato in incubatrice per almeno un'ora prima del trasferimento.
   2. Cambiare il mezzo nuovamente nello stesso modo il terzo giorno dopo aver culture. Il terzo giorno, il trasferimento delle culture di un incubatore a 34 ° C. Modificare il medio due volte alla settimana (ogni 3-4 giorni).
   3. Identificare le colture sane. Selezionare colture sane per le registrazioni di cellule intere appaiati.
      NOTA: colture sane hanno un bordo ben definito e uno strato di cellule piramidali chiaramente definito. Culture with scuro (probabilmente necrotico) aree presenti o un aspetto vacuolato con bordi appiattiti vengono rifiutati. Utilizzando questi criteri, di solito due terzi delle culture fetta sono sufficientemente sani per la registrazione.
   4. Utilizzare queste culture all'interno di una relativamente piccola finestra di tempo. Non tessuti utilizzati che sono coltivate per più di due settimane da quando i neuroni cominciano a mostrare un comportamento leggermente epilettiforme che peggiora lentamente nel tempo. Il limite superiore esatto della sopravvivenza neuronale non è noto, ma è possibile registrare dal funzionamento delle cellule piramidali più tardi di 16 settimane di cultura.

2. accoppiati Registrazioni a cellula intera

1. ACSF e intracellulari Solutions
   1. Preparare la soluzione elettrodo presinaptica mescolando (in mm) 120 gluconato di potassio, 40 HEPES, 5 MgCl _2, 2 NaATP, e 0,3 NaGTP (pH 7,2 con KOH; osmolarità: 290 mOsm). Mentre la stessa soluzione elettrodo è utilizzato per i neuroni postsinaptici, gluconato di cesio (120 mM) È tipicamente utilizzato come il principale sale nella elettrodo postsinaptica, più 5 QX314 mM.
      NOTA: Questo consente di bloccaggio tensione stabile a potenziali positivi per registrare NMDAR-mediata correnti postsinaptiche ^8-10,13. Inoltre impedisce l'ipereccitabilità potassio indotta del neurone presinaptico dalla soluzione interna che scorre dall'elettrodo registrazione postsinaptica prima di un sigillo giga ohm è fatta.
   2. Preparare la soluzione elettrodo postsinaptico comporre (in mm) 120 gluconato di cesio, 40 HEPES, 5 MgCl _2, 5 QX314, 2 NaATP, e 0,3 NaGTP (pH 7.2 con CsOH; osmolarità: 290 mOsm). Tirare microelettrodi di vetro 5-10 resistenza MW e riempire con soluzione interna filtrata.
   3. Preparare liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) composizione (in mm) 119 NaCl, KCl 2.4, 1.3 MgSO _4, 2.4 CaCl _2, 1 Na ₂ HPO _4, 26.2 NaHCO _3, 11 glucosio, pH 7.4, saturato con il 95% O _2, 5 % di CO _2. NOTA: Se r Ampar-mediataesponses devono essere bloccate per l'esame di NMDAR EPSCs, includono 10 mM CNQX o NBQX nel ACSF.
2. Ottenere accoppiati interi Recordings Cellulari
   1. Per esaminare la trasmissione sinaptica tra due neuroni individuali, designare un neurone in neurone presinaptico e tenere in pinza per indurre potenziali d'azione e di avviare la trasmissione sinaptica.
   2. Designare il secondo neurone, il neurone postsinaptico, e tenerlo in clamp corrente o tensione in relazione alla informazioni richieste dal ricercatore. Ottenere un esame dettagliato delle correnti glutamatergiche, con EPSCs Ampar-mediate esaminati a -65 mV e EPSCs NMDAR mediata esaminati a +30 mV ^6-16 tenendo il neurone postsinaptico in morsetto di tensione
   3. Stabilire una registrazione accoppiato. Per stabilire una registrazione accoppiato, la registrazione intera cellula presinaptica è sempre ottenuta prima, consentendo molteplici neuroni postsinaptici sequenziali da ottenere fino a quello che è sinapticamente Connected è ottenuta. Se l'esecuzione di esperimenti di plasticità sinaptica, è particolarmente critico per ottenere il neurone presinaptico prima come l'induzione di LTP nel neurone postsinaptico deve essere avviata entro 10 min di ottenere l'intera registrazioni cellulari per evitare dilavamento dei fattori citoplasmatici necessari per la LTP ^8,19.
   4. Evitare la perdita di cellule movimento-indotta. Una sfida importante quando si eseguono registrazioni di cellule intere appaiati è di evitare vibrazioni e disagi indotti dal movimento della prima registrazione cellula intera, mentre ottenere la seconda registrazione.
      1. Ottenere la prima registrazione cellula intera e quindi spostare il microscopio lente 10-200 micron in asse x in modo che la registrazione stabilita si trova ai margini della zona visibile sul monitor (Figura 2A).
      2. Sollevare la lente del microscopio ~ 5-10 mm, garantendo nel contempo che il ACSF mantiene ancora il contatto con la lente. Montare il secondo elettrodo e guidare nel menisco liquido (Figura 2B ).
      3. Spostare l'elettrodo nel piano xy fino a quando non è direttamente sotto il percorso della luce attraverso l'obiettivo, ma ancora significativamente sopra l'elettrodo di registrazione stabilita. Una volta che l'elettrodo è visibile al microscopio, garantire la punta è al limite estremo del monitor lontano dal primo elettrodo.
      4. Spostare il secondo elettrodo nella sequenza con la messa a fuoco del microscopio fino a che entrambi gli elettrodi sono sullo stesso piano focale. E 'importante che il livello di pressione positiva è abbastanza forte per evitare punta blocco ma non troppo forte in modo da interrompere la prima registrazione cellula intera. Questo si traduce in pressione positiva inducendo movimento tra 2-3 neuroni dall'elettrodo quando entra per la prima fetta.
      5. Individuare un partner postsinaptico in un piano focale simile alla prima registrazione presinaptico (Figura 2C). La registrazione è generalmente associato ottenere registrazioni tra i neuroni piramidali CA3 seconda cella tutto da un neurone 0-200 mm della prima recording (Figure 2C, D).
         NOTA: La trasmissione sinaptica tra coppie neuronali sono stabili su periodi di tempo fino a 3-4 ore quando si utilizzano queste tecniche intere standard di registrazione delle cellule.
3. Plasticità sinaptica: Once Upon ottenere un paio di cellule piramidali sinapticamente-collegato di successo (3A figure, B), esaminare le caratteristiche di trasmissione e plasticità sinaptica.
   1. Induzione di LTP.
      1. Indurre LTP accoppiando potenziali d'azione presinaptico (1 Hz) con depolarizzazione postsinaptica a -10 a 0 mV per 1 min (Figura 3C) ^7-9,12-14. Avviare l'associazione entro 10 minuti di break-in al neurone postsinaptico.
         NOTA: LTP può anche essere indotta con entrambi i neuroni tenutasi a pinza con l'associazione potenziali d'azione presinaptici e postsinaptici a 1 Hz per 1 min, con potenziali d'azione postsinaptici suscitato 10 msec dopo l'iniezione di corrente nel neurone presinaptico ⁸ .
   2. Ulteriori indurre LTD dalla bassa frequenza di stimolazione (LFS) a 1 Hz combinata con una leggera depolarizzazione del neurone postsinaptico a -55 mV per 5-10 min (Figura 3C) ^9.

Risultati

Connettività Synaptic è evidente stimolando il neurone presinaptico a fuoco un potenziale d'azione passando un impulso di corrente depolarizzante (tipicamente 20-50 pA per 20 msec) tramite l'elettrodo di registrazione. La traccia corrente postsinaptica viene poi esaminato per la presenza di una EPSC monosinaptico evocata a breve (<5 msec) e latenze coerenti dopo il picco del potenziale d'azione presinaptico (Figura 3A). Nella maggior parte degli esperimenti più neuroni postsinaptici so...

Discussione

Qui abbiamo descritto i requisiti per la creazione di successo registrazioni di cellule intere associati nel organotipica culture fetta dell'ippocampo. Registrazioni accoppiati possono essere eseguite in diverse preparazioni, tra cui fettine acute e sistemi di colture dissociate ^26,27. Mentre il fuoco qui è stato sul induzione di forme di plasticità sinaptica (LTP e LTD cioè) più lunghi, è importante sottolineare che le coppie di registrazioni di cellule intere in organotipica, fetta acuta e dissocia...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minimum Essential Medium			Stable motorized micromanipulators
Penicillin-Streptomycin solution			Shallow tissue bath
HEPES buffer solution			DIC camera
1 M Tris stock solution			Amplifier
Hank’s Balanced Salt Solution			Computer
Horse Serum			Vibration isolation table
Plastic-coated miniature spatulas			Upright microscope
Soft paintbrush			Data acquistion and analysis software
Manual tissue chopper			Electrode puller
#2 Filter paper			Faraday cage
#5 Forceps
Membrane inserts
CO2 incubator
Dissection hood
Class II hood