Emparelhados Recordings células inteiras em organot�icas fatias do hipocampo

Resumo

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Resumo

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Introdução

Os receptores de glutamato mediar a maior parte da transmissão sináptica excitatória nas sinapses no sistema nervoso central. Os dois subtipos principais de receptores de glutamato ionotrópicos localizadas na cabeça da coluna de a membrana pós-sináptica, são N-metil-D-aspartato (NMDA) e α-amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-proprionic ácido (AMPA). No potenciais de membrana em repouso, os receptores de AMPA carregam a maior parte da corrente pós-sináptica durante a transmissão sináptica. No hipocampo, o receptor de NMDA desempenha um papel importante no desencadeamento de alteração no número de receptores de AMPA na membrana pós-sináptica: actuando como um "detector de coincidência ^{de" 1} para iniciar mudanças na força sináptica ^1, o receptor de NMDA, participa nos mecanismos sinápticos que são pensados ​​para apoiar a aprendizagem ea memória em um nível subcelular. Em resposta à despolarização do neurónio pós-sináptico em paralelo com a libertação do transmissor pré-sináptico, cálcio entra através do NMDAreceptor de dar início a inserção ou a remoção do receptor de AMPA ^2. Esta dinâmica do receptor subjacentes plasticidade sinapse: um aumento na força sináptica é potenciação de longa duração ^2,3 (LTP), enquanto que uma diminuição na força sináptica é a depressão a longo prazo ^{de 4} (LTD). Portanto, o movimento do receptor de AMPA é pensado para ser responsável pela expressão da plasticidade sináptica, enquanto os receptores NMDA são pensados ​​para controlar a sua indução.

Determinar os mecanismos precisos subjacentes transmissão sináptica e plasticidade requer estudando pequenas populações de sinapses, idealmente sinapses individuais. Enquanto algumas sinapses são altamente adequados para o estudo, a este nível, por exemplo, a Calyx de Held ^5, para as populações mais sinápticas isso é extremamente difícil devido à natureza pequena e difusa das conexões sinápticas. Duas importantes técnicas de eletrofisiologia foram desenvolvidos para examinar as conexões sinápticas individuais: A primeira é a estimulação mínima, where uma fibra pré-sináptica é presumido estimulada extracelularmente. A segunda técnica é emparelhado gravações, onde duas gravações simultâneas de células inteiras de neurônios conectados synaptically é realizada. Uma grande vantagem da estimulação mínima é de que é relativamente rápido e simples de realizar, que envolve a colocação de um eléctrodo de estimulação extracelular no tracto axonal e ao mesmo tempo de gravação de um neurónio pós-sináptico. A principal preocupação quando se utiliza esta técnica é que a estimulação confiável de uma única célula raramente pode ser garantida julgamento após julgamento.

Nos últimos 15 anos temos utilizado rotineiramente emparelhado gravações de células inteiras a partir de dois neurônios piramidais synaptically conectados ^6-17. A principal vantagem desta técnica é que apenas um neurónio pré-sináptico, é estimulado de forma consistente e fiável. Ele também permite que não só caracterização eletrofisiológica, mas também a manipulação farmacológica do neurônio pré-sináptico ^{6,18 <}/ Sup>. No entanto, a probabilidade de conectividade sináptica entre neurónios é baixa, tornando-os pares conectados difícil obter ^19. O uso de culturas organotípicas de cérebro contorna este obstáculo como conectividade sináptica pode restabelecer in vitro e além disso, a natureza da ligação resultante é semelhante ao que no tecido cerebral ²⁰ nativa. Além disso, as culturas organotypic expressar LTP, LTD ^{7-10,12-15,21} e outras formas de plasticidade sináptica de curto prazo, incluindo a facilitação emparelhado-pulso (PPF) e depressão (PPD) ^6,22,23, permitindo que os mecanismos de plasticidade para ser estudada em pares de neurônios. Aqui nós descrevemos a metodologia detalhada envolvido em alcançar sucesso gravações emparelhados neste sistema in vitro. Esta informação pode ser facilmente adaptado a outros sistemas experimentais, incluindo fatias agudas e de outras regiões do cérebro.

Protocolo

Declaração de Ética Animal:

Os protocolos descritos neste manuscrito seguir as orientações de cuidados de animais estabelecidos pela The University of Auckland e da Universidade de Stanford. P7 crias de ratos foram sacrificados por decapitação rápida. Dissecação do hipocampo é então realizada tal como descrito imediatamente abaixo.

1. Organotípicas Hippocampal Fatia Cultura

1. Preparação
   1. Prepare Médio dissecção (usado somente para dissecar o cérebro). Combinar 200 mL de Meio Essencial Mínimo, 2 ml de solução de penicilina-estreptomicina (10.000 unidades de cada, em NaCl a 0,85%), 5 ml de solução tampão de HEPES, 2 ml de solução de 1 M de Tris (pH 7,2), e filtra-se esterilizar com filtro de 0,22 nm . Realizar dissecção do hipocampo em meio dissecção gelada.
   2. Arrefecer o meio de dissecção. Coloque a mídia dissecção no congelador cerca de 1 hora antes do início da dissecção até que o líquido é muito frio. Não permita que grande cr geloystals a se formar. Guarde em gelo até serem necessárias.
   3. Prepare meio de cultura (usado para tudo, exceto dissecação de hipocampo). Combinar 100 mL de Meio Essencial Mínimo (concentração 1x, líquido) w / sais de Hank, w / L-glutamina, 2 ml de solução de penicilina-estreptomicina (líquido, 10.000 unidades de cada, em NaCl a 0,85%), 2,5 mL de HEPES 1 M de tampão solução, 50 ml de solução salina equilibrada de Hank, 50 ml de soro de cavalo (definido, inactivado pelo calor), e filtro de esterilização com filtro de 0,22 um.
   4. Prepare as placas de cultura. Colocar 1 ml de meio de cultura por prato de cultura de 35 mm, e adicionar um inserto de membrana para cada prato. Coloque até sete desses pratos em um 150 milímetros placa de Petri (adiante designado por um "prato"). Colocar a placa num incubador de _CO2 durante pelo menos uma hora antes de começar a dissecção de modo a que o meio de cultura nas placas alcança a temperatura apropriada e pH.
2. Dissecção do hipocampo de filhotes de ratos no dia pós-natal 7 (P7)
   1. Pré-esterilizar todas as ferramentas de dissecção com luz UV antes do procedimento.
   2. Após a decapitação rápida, retire o cérebro e lugar em meio refrigerado em um prato, em seguida, removê-lo para um pedaço de papel de filtro umedecido para dissecação. Provoque o córtex longe do mesencéfalo usando contundentes espátulas plásticas lisas revestidas de miniatura, expondo o hipocampo. Corte o fundo de saco, e depois trabalhar suavemente a espátula por baixo do hipocampo para lançá-lo para fora (Figura 1A).
      NOTA: Sucesso culturas fatia pode ser preparado usando animais até P10.
   3. Aparar o hipocampo isolado do resto do cérebro. Transfira o hipocampo em um novo prato contendo mídia dissecção refrigerados usando um pincel macio umedecido (por exemplo, branco sable # 4).
   4. Limpar o lado de baixo (isto é, o lado mais liso) do hipocampo do plexo coróide durante a dissecção, uma vez que estes tecidos, meninge tipo esponjoso tornam difícil separar do hipocampoFatias de um outro mais tarde.
      NOTA: Deixe esses tecidos no lugar, se eles não podem ser esmiuçadas fora suavemente.
   5. Executa todo o esvaziamento tão rapidamente quanto possível, sem danificar o hipocampo.
      NOTA: A dissecção cuidadosa é mais importante do que um rápido, desde que as condições experimentais são refrigerados. Corte o hipocampo de ratos três simultaneamente. A fatia de saúde não é afectada, enquanto que o tempo total desde o início quando as fatias plaqueadas entrar na incubadora é menos de 30 min.
3. Cortando
   1. Corte os hipocampos transversalmente em 400 um secções transversais usando um cortador de tecido manual. O método através do qual a operação de corte é realizada não é importante, contanto que não é excessivamente prejudicial para o tecido e produz fatias de espessura consistente com uma arquitectura laminar prontamente disponíveis (isto é, corno de Ammon é facilmente visto ser preservada no tecido).
   2. Deite o hipocampo no palco do tecidotriturador no topo de uma espessura tripla de papel de filtro # 2. O hipocampo é cortado totalmente sem remover quaisquer fatias individualmente (ou seja, todo o hipocampo é deixado na cena do helicóptero até que todos foram feitos cortes, mas sim como pães cortados neste momento; Figura 1B).
   3. Transferir o hipocampo em meio de dissecção usando um pincel macio colocado ao lado de cada hipocampo (branco de marta # 2). Com cuidado, empurre cada hipocampo para o lado para quebrar a aderência entre o hipocampo eo papel de filtro subjacente. Role a escova debaixo de cada hipocampo para buscá-lo para fora do palco. Coloque todos os hipocampos no mesmo 35 milímetros placa de Petri de meio de dissecção gelada. Separe o hipocampo em fatias individuais agitando manualmente o prato em alternar movimentos no sentido horário e anti-horário.
   4. Inspecionar as fatias sob um microscópio de dissecação e descartar qualquer que estiverem danificados, pequeno, ou que não possuem células claramente visívelcamadas do corpo.
      NOTA: É, muitas vezes, ser o caso de que nem todas as fatias são separados com sucesso a partir de seus irmãos desta maneira. Neste caso, eles podem ser separados por transformá-los na borda e estimulando-as com as pontas dos pinça fina. "Good" fatias são então transferidos para uma outra placa de Petri contendo meio de dissecção limpo gelada usando um cortadas e polidas ao fogo pipeta de Pasteur (Figuras 1C-E).
4. Armazenamento
   1. Coloque as fatias individuais para as inserções de filtro de membrana. Com uma pipeta Pasteur cortado e polido fogo para dar um furo maior, transferir individualmente fatias para as inserções de cultura.
      NOTA: O tamanho do orifício criado no corte e polimento da pipeta-fogo é importante. Muito pequena e as fatias não será fácil deixar a pipeta para a membrana. Fluido muito grande e em excesso é colocada sobre a superfície da membrana juntamente com a fatia. O melhor diâmetro do furo é tipicamente cerca de metade do diâmetroetro do cano da pipeta. Quando o corte, este diâmetro pode ser escolhido através do corte no local adequado sobre o cone da pipeta.
   2. Fatia de Transferência
      1. Encha a pipeta com o meio em primeiro lugar, e em seguida, aspirar uma única fatia com forças de sucção pequenos. Isto mantém a fatia perto da abertura da pipeta e previne muita expulsão na forma de inserção para colocar a fatia.
      2. Aplique uma leve pressão sobre a lâmpada para formar uma pequena gota de suspensão, permitir que a fatia de resolver em que gota, e depois toque em que gotículas à membrana e que a fatia "queda" para a membrana. Geralmente três fatias são colocadas em cada pastilha de membrana.
         NOTA: Se a gota de fluido é muito grande, as gotículas de as três fatias tendem a fundir sobre a superfície da membrana, e, assim, as fatias de recolher tudo para o centro da membrana, tornando-se mais difícil separá-los para a gravação electrofisiológico mais tarde.
   3. Remov Fluidal
      1. Aspirar todo o meio em excesso do topo da placa de inserção de cultura para todas as fatias em que o prato (3 fatias por pastilha = 21 fatias por placa), de modo que as fatias não são imersas em ou rodeado por um conjunto de meio de dissecção.
      2. Realizar isso é com um sem cortes, mas fogo-polido pipeta Pasteur. Permitir a fatia para se estabelecer e aderir à membrana por um minuto antes de pipetar. Tome cuidado para não sugar a fatia para dentro da pipeta. Realizar remoção de fluido para as inserções que são banhados em primeiro lugar, para que haja tempo suficiente para que as fatias de resolver.
   4. Fatia de armazenamento
      1. Culturas fatia da loja em um 5,0% de CO ₂ incubadora a 37 ° C. Observe o arranjo final das culturas na Figura 1E. As fatias individuais repousar sobre uma placa de cultura de inserção que tem uma membrana porosa de uma parte inferior, e esta inserção se encaixa dentro de um prato de Petri cheio com uma pequena quantidade de meio; por este meio, as fatias não está imerso no medio, mas têm acesso a ele somente através da membrana na parte inferior da placa de cultura de inserção.
      2. Opcionalmente, as fatias pode remover para estudo, quer por remoção da placa de cultura de inserção ou por corte de uma secção da membrana de inserção contendo uma fatia.
5. Manutenção
   1. Trocar o meio em placas de Petri um dia depois fazendo culturas. Transferir a inserção da placa de cultura para uma nova placa de Petri contendo 1 ml de meio de cultura fresco que é equilibrada na incubadora durante pelo menos uma hora antes de serem transferidos.
   2. Alterar outra vez a forma da mesma maneira, no terceiro dia após a tomada de culturas. No terceiro dia, transferir as culturas para uma incubadora fixada em 34 ° C. Mudar o meio duas vezes por semana (a cada 3-4 dias).
   3. Identificar culturas saudáveis. Selecione culturas saudáveis ​​para gravações de células inteiras emparelhados.
      NOTA: As culturas saudáveis ​​têm uma aresta bem definida e uma camada de células piramidais claramente definida. Culturas sagacidadeh áreas escuras (provavelmente necrótica) presente ou um aspecto vacuolizado com bordas achatadas são rejeitados. Empregando estes critérios, normalmente de dois terços das culturas fatia são suficientemente saudável para a gravação.
   4. Utilize estas culturas dentro de uma relativamente pequena janela de tempo. Do não tecidos usados ​​que são cultivadas durante mais de duas semanas desde os neurónios começam a exibir um comportamento ligeiramente epileptiforme que agrava lentamente com o tempo. O limite superior exacto de sobrevivência neuronal não é conhecido, mas é possível gravar a partir das células piramidais tão tarde como 16 semanas em cultura.

2. emparelhados Recordings células inteiras

1. ACSF e Soluções intracelulares
   1. Preparar a solução de pré-sináptica por eléctrodo de mistura (em mM) 120 de gluconato de potássio, 40 HEPES, 5 MgCl _2, 2 NaATP, e 0,3 NaGTP (pH 7,2 com KOH; osmolaridade: 290 mOsm). Embora a mesma solução de eléctrodo é usado para os neurónios pós-sinápticos, o gluconato de césio (120 mM) É normalmente utilizado como o principal sal no eléctrodo de pós-sináptico, mais mM QX314 5.
      NOTA: Isto permite fixação de tensão estável em potenciais positivos para gravar correntes mediadas por NMDAR pós-sinápticos ^8-10,13. Também previne a hiper-excitabilidade induzida por potássio do neurónio pré-sináptico da solução interna que flui a partir do eléctrodo de registo antes da pós-sináptica de um selo giga ohm é feita.
   2. Preparar a solução de pós-sináptico compor eléctrodo (em mM) 120 de gluconato de césio, 40 HEPES, 5 MgCl _2, 5 QX314, 2 NaATP, e 0,3 NaGTP (pH 7,2 com CsOH, osmolalidade: 290 mOsm). Puxe microeletrodos de vidro em 5-10 resistência mohms e encher com solução interna filtrada.
   3. Preparar fluido cerebroespinal artificial (ACSF) compondo (em mM) 119 de NaCl, 2,4 de KCl, 1,3 _MgSO4, 2,4 _CaCl2, 1 de Na ₂ HPO _4, 26,2 _NaHCO3, 11 de glucose, pH 7,4, saturado com 95% de O _2, 5 % de CO _2. NOTA: Se r AMPAR mediadaesponses precisa ser bloqueado para exame de NMDAR EPSCs, incluem 10 mM CNQX ou NBQX no ACSF.
2. Obter gravações de celulares emparelhados inteiras
   1. Para examinar a transmissão sináptica entre dois neurônios individuais, designar um neurônio como o neurônio pré-sináptico e segure pinça de corrente para induzir potenciais de ação e iniciar a transmissão sináptica.
   2. Designar o segundo neurônio, como o neurônio pós-sináptico, e mantê-lo na braçadeira de tensão ou corrente, dependendo das informações exigidas pelo pesquisador. Obter exame detalhado das correntes glutamatérgicos, com EPSCs AMPAR mediadas examinados a -65 mV e EPSCs mediada por NMDAR examinados em 30 mV ^6-16, mantendo o neurônio pós-sináptico na braçadeira de tensão
   3. Estabelecer uma gravação emparelhado. Para estabelecer uma gravação emparelhado, a gravação de células inteiras pré-sináptico é sempre obtido pela primeira vez, permitindo que vários neurônios postsynaptic seqüenciais para ser obtida até aquele que é synaptically connected é obtido. Se se realizarem ensaios de plasticidade sináptica, é especialmente crítica para a obtenção do neurónio pré-sináptico primeira como a indução de LTP no neurónio pós-sináptico deve ser iniciada dentro de 10 min de obtenção de células inteiras das gravações para evitar lavagem de factores citoplásmicos necessários para LTP ^8,19.
   4. Evitar a perda de células induzida pelo movimento. Um desafio importante quando se realiza gravações de células inteiras emparelhadas evitar vibrações e perturbações induzidas pelo movimento do primeiro registo de célula completa, enquanto a obtenção da segunda gravação.
      1. Obter o primeiro registo de célula completa e, em seguida, mover a lente do microscópio 10-200 uM no eixo-x de modo que a gravação é estabelecida localizado na borda da área visível no monitor (Figura 2A).
      2. Levante a lente do microscópio ~ 5-10 mm, assegurando que o ACSF ainda mantém contato com a lente. Monte o segundo eletrodo e orientar no menisco fluido (Figura 2B ).
      3. Mova o eletrodo no plano xy até que esteja diretamente sob o caminho da luz através da lente, mas ainda bem acima do eletrodo de registro estabelecido. Uma vez que o eléctrodo é visível ao microscópio, é assegurar a ponta na extremidade mais distante do monitor de distância a partir do primeiro eléctrodo.
      4. Movimentar o segundo eléctrodo para baixo em sequência com o foco microscópio até que ambos os eléctrodos estão no mesmo plano focal. É importante que o nível de pressão positiva é suficientemente forte para evitar a obstrução da ponta, mas não demasiado forte de modo a interromper a primeira gravação de células inteiras. Isso se traduz em pressão positiva induzir movimento em 2-3 neurônios do eletrodo quando se entra pela primeira vez da fatia.
      5. Localizar um parceiro de pós-sináptica num plano focal semelhante à primeira gravação pré-sináptico (Figura 2C). A gravação é geralmente obter gravações entre os neurônios piramidais do CA3 a segunda célula inteira emparelhado de um neurônio 0-200 mm da primeira recording (Figuras 2C e D).
         NOTA: A transmissão sináptica entre pares neuronais são estáveis ​​ao longo de períodos de até 3-4 horas quando se utiliza estas técnicas de gravação de células inteiras padrão.
3. A plasticidade sináptica: Once Upon a obtenção de um par de células piramidais synaptically conectada sucesso (3A Figures, B), examinar as características da transmissão sináptica e plasticidade.
   1. A indução da LTP.
      1. Induzir LTP, emparelhando potenciais de ação pré-sinápticos (1 Hz) com a despolarização pós-sináptica de -10 a 0 mV por 1 min (Figura 3C) ^7-9,12-14. Inicie o emparelhamento dentro de 10 min de break-in para o neurônio pós-sináptico.
         NOTA: LTP também pode ser induzida com ambos os neurônios, realizada em pinça de corrente através do emparelhamento potenciais de ação pré-sinápticos e pós-sinápticos a 1 Hz por 1 min, com potenciais de ação pós-sinápticos provocou 10 ms após a injecção de corrente para o neurônio pré-sináptico ⁸ .
   2. Além disso induzir LTD pela baixa freqüência de estimulação (LFS) a 1 Hz combinada com uma leve despolarização do neurônio pós-sináptico para -55 mV para 5-10 min (Figura 3C) ^9.

Resultados

Conectividade Synaptic é evidente, estimulando o neurônio pré-sináptico para disparar um potencial de ação por meio de um pulso de corrente de despolarização (tipicamente 20-50 aa para 20 ms), através do eletrodo de registro. O rastreio da corrente pós-sináptica é, em seguida, examinadas para a presença de um EPSC monossináptico evocado no curta (<5 ms) e latências consistentes após o pico do potencial de acção pré-sináptico (Figura 3A). Na maioria das experiências múltiplas neu...

Discussão

Aqui nós descrevemos os requisitos para estabelecer gravações de células bem sucedidos emparelhados inteiras em culturas organotípicas do hipocampo. Gravações emparelhados também pode ser realizada em várias preparações, incluindo fatias agudas e sistemas de culturas dissociadas ^26,27. Embora o foco aqui foi sobre a indução de mais formas de plasticidade sináptica (nomeadamente LTP e LTD), é importante ressaltar que as gravações de células inteiras emparelhados em organotípica, fatia aguda ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Minimum Essential Medium			Stable motorized micromanipulators
Penicillin-Streptomycin solution			Shallow tissue bath
HEPES buffer solution			DIC camera
1 M Tris stock solution			Amplifier
Hank’s Balanced Salt Solution			Computer
Horse Serum			Vibration isolation table
Plastic-coated miniature spatulas			Upright microscope
Soft paintbrush			Data acquistion and analysis software
Manual tissue chopper			Electrode puller
#2 Filter paper			Faraday cage
#5 Forceps
Membrane inserts
CO2 incubator
Dissection hood
Class II hood