Análisis de la migración de células dentro de una matriz de colágeno tridimensional

Resumen

La migración celular es un fenómeno biológico que está involucrada en una gran cantidad de fisiológicos, tales como la curación de heridas y las respuestas inmunitarias, y los procesos fisiopatológicos, como el cáncer. El ensayo de migración de matriz de colágeno 3D es una herramienta versátil para analizar las propiedades migratorias de diferentes tipos de células dentro de un entorno fisiológico-como 3D.

Resumen

La capacidad de migrar es un sello de diversos tipos de células y juega un papel crucial en diversos procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas, y la respuesta inmune. Sin embargo, la migración celular también es un mecanismo clave en el cáncer permitiendo estas células cancerosas para desprenderse del tumor primario para iniciar la diseminación metastásica. En los últimos años se han desarrollado varios ensayos de migración celular para analizar el comportamiento migratorio de diferentes tipos de células. Debido a que el comportamiento de locomoción de las células difiere notablemente entre una de dos dimensiones (2D) y tres dimensiones medio ambiente (3D) se puede suponer que el análisis de la migración de las células que están incrustados dentro de un entorno 3D produciría en la migración celular más significativo datos. La ventaja del ensayo de migración de matriz de colágeno 3D descrito es que las células están incrustadas dentro de una red 3D fisiológica de las fibras de colágeno que representan el componente principal de la matriz extracelular. Debido alapso de tiempo de microscopía de vídeo real de la migración celular se mide permitiendo la determinación de varios parámetros de migración, así como sus alteraciones en respuesta a factores pro-migratorias o inhibidores. Varios tipos de células podrían ser analizados usando esta técnica, incluyendo linfocitos / leucocitos, células madre, y células tumorales. Del mismo modo, también grupos de células o esferoides pueden ser incrustados dentro de la matriz de colágeno concomitante con el análisis de la emigración de las células individuales del grupo de células / esferoide en la red de colágeno. Llegamos a la conclusión de que el ensayo de migración de matriz de colágeno 3D es un método versátil para analizar la migración de células dentro de un entorno 3D-como fisiológico.

Introducción

Al igual que la fusión celular (para una revisión ver ^1,2) la migración celular es otro fenómeno biológico que está involucrado en una plétora de procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas y las respuestas inmunes (para una revisión véase ^3). Sin embargo, la capacidad de migrar es también un requisito previo para las células tumorales metastatizan a (para revisión ver ^3,4).

La migración celular es un complejo, proceso aún no completamente entendido que está dirigida por la interacción de varias vías de transducción de señales iniciada por varios ligando (por ejemplo, citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, hormonas, componentes de la matriz extracelular) del receptor (por ejemplo, tirosina quinasas receptoras, receptores de quimioquinas, integrinas) interacciones ⁵ en última instancia provocan la reorganización del citoesqueleto de actina concomitante con de- y montaje de complejos de adhesión focal y la integrina mediada por la señalización ^6.

Para el análisis de la migración de células de varios in vitro y en ensayos de migración celular in vivo se han desarrollado en las últimas décadas, incluyendo el ensayo Boyden cámara / transwell ^7, cero ensayo / cicatrización de heridas ensayo de ^8-10, en tres dimensiones ( 3D) ensayo de migración de matriz de colágeno ^11, así como intravital de imágenes / microscopía (para revisión ver ^12). Cada uno de estos ensayos de migración celular tiene ventajas y desventajas, por ejemplo, en relación con los costos y la necesidad de equipos, manipulación o fiabilidad de los datos obtenidos.

Tanto la cámara de ensayo Boyden / transwell y el ensayo ensayo de rayado / cicatrización de heridas son fáciles, de bajo costo y ensayos bien desarrollados para medir la migración de células in vitro ^7-10. En la cámara de Boyden / Transwell células de ensayo se siembran en la parte superior de un inserto que contiene poros (alrededor de 8 micras de diámetro) - el llamado compartimiento superior ^7. Opcional, el inserto podría ser recubierto con m extracelularAtrix componentes, por ejemplo, fibronectina, colágeno, etc, para imitar un entorno más fisiológico. Del mismo modo, las células endoteliales podrían ser cultivadas en la parte superior del inserto, imitando de ese modo una barrera de células endoteliales ^13. Aquellas células que han pasado a través de los poros durante un intervalo de tiempo definido en el compartimiento inferior que alberga medios de comunicación y los suplementos, tales como factores de crecimiento y quimiocinas, se utilizan como un dispositivo de lectura para cuantificar la migración celular (o extravasación).

En el ensayo de rayado / curativas células de ensayo de la herida se siembran en placas y se cultivan hasta la confluencia ^10. En dependencia de las placas de ajuste experimentales podría ser pre-recubierto con componentes de la matriz extracelular, tales como fibronectina. Después de crear un rasguño / herida por raspado de las células individuales en monocapa de células de cada lado del arañazo / herida puede migrar en el espacio, llenando así / curarla ^10. La distancia entre los dos lados de los arañazos / heridas se determinaen dependencia del tiempo y se usa como un dispositivo de lectura para la actividad migratoria de las células ^10. Sin embargo, para discriminar entre la proliferación celular (que podría resultar también en el llenado / curación del cero / herida) y la migración celular se recomienda combinar el ensayo con microscopía de vídeo de lapso de tiempo y de una sola célula de seguimiento ^10.

Sin embargo, tanto la cámara de Boyden / ensayo Transwell y cero ensayo / ensayo de cicatrización de la herida, son más bien imperfecta relativa a un entorno celular-como fisiológico. En la cámara de Boyden / células de ensayo Transwell tienen que migrar a través de un poro de plástico, mientras que en el ensayo de rayado / cicatrización de heridas células de ensayo se sembró en una placa de plástico pre-recubierto de dos dimensiones. Asimismo, es bien reconocido que el comportamiento migratorio difiere notablemente entre un medio ambiente de dos dimensiones y 3D ^3. Por ejemplo, las adherencias en tres dimensiones de matriz de fibroblastos se diferencian de las adhesiones focales fibrilares y caracterizados en dossustratos -dimensionales en su contenido de α5β1 y integrinas αvβ3, paxilina, otros componentes del citoesqueleto, y la fosforilación de tirosina quinasa de adhesión focal ^14. Del mismo modo, las células embebidas dentro de un entorno 3D también muestran un comportamiento migratorio alterada ^15. Así, para analizar la migración de células con más precisión un ensayo de migración se recomienda permitir para medir la migración de células individuales dentro de un entorno fisiológico o fisiológico-como 3D.

Intravital de imágenes / microscopía es el estándar de oro para la medición de la migración de células dentro de un contexto fisiológico 3D. Esto no sólo pertenecen a las interacciones célula-matriz extracelular, sino también a las interacciones entre los diferentes tipos de células, tales como células tumorales y las células endoteliales durante la extravasación ¹⁶ o el tráfico de linfocitos en el ganglio linfático ^17, que, hasta la fecha, es posible debido a mejora de las técnicas de microscopía de fluorescencia, tales como 2-fotónmicroscopía de barrido láser confocal, el uso de colorantes fluorescentes vitales y cepas de ratones transgénicos que expresan proteínas fluorescentes derivados ^12,16,17. Además, intravital de imágenes / microscopía podría combinarse con el seguimiento de células manual y automatizado ^18. Sin embargo, debido a la necesidad de un 2-fotón láser confocal de microscopía de barrido, así como animales (y modelos de animales transgénicos adecuados) intravital de imágenes / microscopía es una técnica bastante onerosa.

Para superar las limitaciones de la cámara de ensayo Boyden / transwell y el ensayo de curación de cero ensayo / herida y para analizar la migración de diferentes tipos de células dentro de un entorno 3D el ensayo de migración de matriz de colágeno 3D fue desarrollado ^11,19. De esta manera, las células que migran están incrustados dentro de una red de fibras de colágeno en 3D, lo que más se asemeja a la situación in vivo. Conjuntamente, debido al time-lapse video microscopía migración celular verdadero se mide lo que permite la deternación de varios parámetros de migración, así como sus alteraciones en respuesta a factores pro-migratorias o inhibidores. Varios tipos de células podrían ser analizados usando esta técnica, incluyendo linfocitos y leucocitos ^11,20 madre hematopoyéticas, células progenitoras / ^21-24, y las células tumorales ^5,25-29. Además de las células individuales también cúmulos celulares o esferoides pueden ser incrustados dentro de la matriz de colágeno concomitante con el análisis de la emigración de las células individuales del grupo de células / esferoide en el colágeno celosía ^30,31.

Este protocolo presenta una visión general acerca de una técnica sencilla, pero de gran alcance para analizar el comportamiento migratorio de diferentes tipos de células dentro de un entorno 3D - un método in vitro ceder en los resultados que están cerca de la situación in vivo.

Protocolo

1 Preparación de Cámaras de migración

1. Preparar una jalea de cera de parafina / petróleo (1: 1) mezcla y calentar hasta que la mezcla se haya derretido. El uso de un cepillo de pintura y dibujar 2-3 capas de la jalea de cera de parafina / petróleo (1: 1) mezclar en el medio de la lámina de vidrio de acuerdo a las figuras 1B-1D.
   NOTA: Estamos utilizando portaobjetos de vidrio común (76 x 26 x 1,0 a 1,5 mm (W / D / H))
2. Aplique la mezcla de gelatina de cera de parafina / petróleo derretido rápidamente en el portaobjetos de vidrio para evitar la solidificación mientras dibuja. Asegúrese de que la capa de jalea de cera de parafina / petróleo es de alrededor de 2-2,5 cm de longitud y 0,3-0,5 cm de ancho. El espesor de la capa de gelatina de cera de parafina / petróleo debe ser de aproximadamente 0,1-0,15 cm.
3. Añadir un cubreobjetos a la cera de parafina solidificada / mezcla de vaselina y sellarlo con dos o tres capas de parafina jalea mezcla de cera / petróleo (Figuras 1E, 1F). Utilice 4-8 cámaras de migración para un experimento de migración celular común. Cámaras Lugar de migración in una posición vertical en un rack.

2. preparación de la suspensión de la mezcla de la célula de colágeno

1. Cosecha (por ejemplo, con 0,25% de tripsina / EDTA) y contar las células de interés. Resuspender las células en medio completo que contenía suero de ternera fetal (FCS), antibióticos y suplementos recomendados. Preparar 4-8 1,5 ml tubos de reacción y 20 l de suspensión celular que contiene 4-6 x 10 ⁴ células (el número total de células depende del tipo de célula a analizar) y rellenar hasta 50 l con medio completo.
   NOTA: Los compuestos adicionales (por ejemplo, factores de crecimiento, quimiocinas, inhibidores, etc) se añaden a la suspensión celular. Utilice soluciones madre apropiadas de tal manera que el volumen final de suspensión de células no exceda de 50 l.
2. Preparar una cantidad total de 452 l de suspensión final de colágeno durante cuatro experimentos de migración celular. Añadir 50 l de 10x MEM (pH 5.1 a 5.5) y 27 l de solución de bicarbonato de sodio 7,5% (pH 9,0-9,5) A un tubo de reacción de 1,5 ml y mezclar bien. Observe el cambio de color de la solución de color amarillo-naranja a púrpura intenso (pH 9,0 a 9,5). Añadir 375 l de suspensión de colágeno líquido a la solución de bicarbonato de 10x MEM / sodio y mezclar bien. El pH de la suspensión de colágeno final debería ser de aproximadamente 7,5 (indicado por un color púrpura claro).
   NOTA: Verifique el pH de la solución de bicarbonato de sodio al 7,5%. Si el pH es de aproximadamente 7,5 a cabo la solución de bicarbonato de sodio con una tapa abierta en una incubadora (37 ° C, 5% CO ₂₎ para ser saturada con CO ₂ y aumentar el pH (aproximadamente 9,0 a 9,5). El pH de la mezcla de células en suspensión de colágeno es crucial para la estabilidad de la red de colágeno. Si es demasiado baja, la red de colágeno se derrumbará durante el experimento la migración celular.
   NOTA: Para este protocolo, utilizar colágeno líquido (pH 1.9 a 2.2) de hind bovina (2,9-3,3 mg / ml de colágeno, y el 95% de colágeno tipo I, 5% de colágeno tipo IV). Ejemplos de protocolos de preparación de celosía más de colágeno utilizandocolágeno tipo I procedente de otras fuentes, tales como porcino o rata, se dan en ^32,33. No cambie los volúmenes de las soluciones utilizadas o modificará la última concentración de colágeno de 1,67 mg / ml de la red. Una concentración de colágeno mayor o menor tiene un impacto en la densidad de las fibras de colágeno y la distancia media entre ellos concomitante con las células comportamiento migratorio ^34.
3. Añadir 100 l de la suspensión de colágeno final a 50 l de suspensión celular y mezclar thoroughly.The suspensión de colágeno final (1,67 mg / ml de colágeno) es ligeramente viscosa. Para transferir la cantidad correcta (100 l), la pipeta la solución de colágeno final una vez arriba y abajo antes de transferirla a la suspensión celular.
   NOTA: Una vez que la mezcla de células en suspensión de colágeno se combina con la solución de bicarbonato de sodio / 10x MEM y el valor del pH ha cambiado a 7,5 las fibras de colágeno comienzan inmediatamente para polimerizar.
4. Transferir la mezcla de células en suspensión final de colágeno de Thtubos de reacción e para las cámaras de migración. Golpear suavemente la cámara de migración para distribuir por igual la mezcla de células en suspensión de colágeno en la parte inferior de la cámara de la migración (Figura 1H). Colocar las cámaras de migración en una posición vertical en un bastidor y se incuba durante aproximadamente 30 min (37 ° C, 5% CO ₂₎ para permitir la polimerización de las fibras de colágeno.
5. Observe que la red de colágeno polimerizado es ligeramente turbia pero aún siendo la luz de color púrpura. Llenar las cámaras de migración con medio completo o medio completo con suplementos de interés y sellar la cámara de la migración con la mezcla de gelatina de cera de parafina / petróleo (figuras 1I, 1J).

3. registro y análisis de la migración celular

En esta sección se describe la grabación de la migración celular por microscopía de vídeo time-lapse y el análisis de la migración celular por el seguimiento manual de células.

1. Encienda el microscopio y el hea platina del microscopioter. Ajustar la temperatura a 37 ° C. Utilice un objetivo de 10X. Coloque cámara de migración bajo un microscopio y enfocar aproximadamente 50 células o más en el campo de visión.
2. Migración celular Record en modo de lapso de tiempo utilizando una aplicación de software de vídeo vigilancia multicámara. Guarde las películas de migración celular en un formato adecuado, por ejemplo, "* avi" o "* Mov". Enlace los archivos de película de migración celular a una base de datos que contiene información de apoyo, tales como el tipo de células y las condiciones experimentales.
   NOTA: Estamos grabando linfocitos y HSPCs para un máximo de 2 horas usando un factor de lapso de tiempo de 1:80, lo que significa que 0,75 segundos en tiempo-lapse es igual a 1 min en tiempo real. Las células tumorales son células que se mueven lentamente y por lo tanto se registran por lo menos durante 16 horas utilizando un factor de lapso de tiempo de 1: 1800 (0,5 segundos en tiempo-lapse es igual a 15 minutos en tiempo real).
3. Analizar películas migración celular utilizando una aplicación de software de seguimiento celular apropiada, como plugins de software ImageJ(Una visión general se da en ^18). Para un análisis imparcial que es de crucial importancia que las células serán seleccionados al azar sin el conocimiento si las células son migratorias activo o no.
   NOTA: Estamos utilizando una aplicación de software libre desarrollado para rastrear manualmente los caminos de al menos 30 células por experimento siguiendo las células en movimiento con precisión con el cursor del ratón (que se sitúa en el núcleo). Mientras que el seguimiento, los xy coordenadas de las células de orugas se determinan automáticamente de acuerdo al modo de lapso de tiempo utilizado. Para linfocitos / HSPCs coordenadas xy se determinan cada 0,75 seg (igual a 1 min de tiempo real), mientras que para las células tumorales las coordenadas xy se determinan cada 0,5 seg (igual a 15 min de tiempo real).
4. Determinar un total de 60 xy coordenadas por célula para un experimento típico de la migración celular. Esto es igual a 1 hr en tiempo real para los linfocitos / HSPCs y 15 hr en tiempo real para las células tumorales. A "," indica que una célula no se ha movido entre two puntos de tiempo, mientras que un "valor numérico" indica la distancia en "píxeles" una célula ha movido entre 2 puntos de tiempo (Figura 2a).
   NOTA: seguimiento celular manual requiere experiencia. Particularmente células que migran rápido son difíciles de rastrear y cada tipo de células exhiben un comportamiento migratorio distinto que podría ser desencadenada por factores suplementados. En caso de división celular mientras que el seguimiento, elegir al azar una célula hija para el seguimiento continuo. Las células que migran fuera del campo de visión o mueren mientras que el seguimiento no se han descuidado, pero se consideran para el análisis.

Análisis 4. Datos

1. Analizar los datos de seguimiento de células mediante el uso de una aplicación de software apropiada, por ejemplo, un programa de hoja de cálculo.
   1. Analizar los datos de seguimiento de células copiando la célula de seguimiento de datos en bruto (Figura 2A), en una plantilla de hoja de cálculo de diseño propio. Multiplique suma de los "valores numéricos", que representala distancia total de una célula ha migrado con un factor de corrección para convertir "pixel" en "m".
   2. Determinar dos parámetros de migración celular: la actividad locomotriz (que es equivalente a la tasa de migración) y el tiempo de movimiento activo (Figuras 2C, 2D).
   3. Identificar las células que han migrado menor que 25 micras (nivel de umbral para reducir el número de células positivas falsas) como células que no se mueva. Vuelva a colocar los "valores numéricos" de estas células con ",".
      NOTA: El parámetro "actividad locomotriz" (o tasa de migración) representa el porcentaje de células de la población de células seguimiento que se han movido entre dos puntos de tiempo (Figura 2D). Un "valor numérico" se define como una célula en movimiento, mientras que "," se define como una célula no en movimiento. El parámetro "tiempo de movimiento activo" (tiempo activo) representa el porcentaje del tiempo total de una célula ha migrado en Remento a los plazos del período de observación (Figura 2C). Un "valor numérico" indica que una célula se ha movido, mientras que "," indica que una célula no se ha movido. Este parámetro se utiliza además para determinar el número de células que no se ha movido.
2. Calcular la significación estadística y visualización de datos de migración celular.
   1. Calcular la significación estadística de la actividad locomotriz media de la células (tasa de migración) mediante la prueba de Mann-Whitney. Considere el valor de p <0,05 como significativo.
   2. Mostrar la actividad locomotriz medio de células como xy-diagrama, diagrama DiagramaCaja, o como un diagrama de barras. Mostrar los datos basados ​​en células individuales, tales como el tiempo de movimiento activo o la velocidad, como un diagrama de barras o como un histograma.
      NOTA: Si la aplicación de software de hoja de cálculo elegido no contiene una tabla o gráfico de histograma herramienta DiagramaCaja una búsqueda en línea se debe realizar para buscar adecuado matorials.

Resultados

El ensayo de migración de matriz 3D-colágeno utilizado combinado con lapso de tiempo de video-microscopía y seguimiento celular asistida por ordenador permite la determinación de diversos parámetros de migración celular, incluyendo tanto parámetro basado en la población (por ejemplo, la media de la actividad locomotriz) y parámetros basados ​​en células individuales (por ejemplo, el tiempo de movimiento activo, velocidad, distancia migró). Un ejemplo de los conjuntos de datos de seguimie...

Discusión

La capacidad de migrar es una característica de las células tumorales ^4. Sin la capacidad de desprenderse del tumor primario y para migrar a través de las células tumorales del tejido conectivo circundante no será capaz de sembrar lesiones secundarias, que son la principal causa de muerte de casi todos los pacientes con cáncer. Debido a esta relación muchos estudios se centran en la migración de células de cáncer. El objetivo de estos estudios es la identificación de nuevas moléculas diana y las v...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Leica DM IL inverted microscope	Leica, Wetzlar, Germany
Microscope stage heater	Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany
JVC C1431 video camera	JVC, Bad Vilbel, Germany
Axis 241Q video server	Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 Computer	Apple Macintosh
iMac	Apple Macintosh
FileMaker Pro	FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany
Multi-camera video surveillance software(Security Spy)	Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0	RunRev Ltd., Edinburgh, UK
Paraffin	Applichem GmbH, Darmstadt, Germany	A4264
Petrolatum jelly	local drug store
Purecol (liquid collagen)	Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands		contains 2.9-3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)
10x MEM	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M0275
7.5% Sodium Bicarbonate solution	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	S8761
EGF	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	E9644
U73122	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	662035	dissolve first in CHCL3; reconstitute in DMSO just prior to use