Analyse de la migration cellulaire dans un tridimensionnelle Matrice Collagène

Résumé

La migration des cellules est un phénomène biologique qui est impliquée dans une grande variété de physiologiques, telles que la cicatrisation des plaies et les réponses immunitaires, et des processus physiopathologiques, comme le cancer. La détermination de la migration de la matrice 3D-collagène est un outil polyvalent pour analyser les propriétés de migration de différents types de cellules à l'intérieur dans un environnement physiologique analogue à 3D.

Résumé

La capacité de migrer est une caractéristique de divers types de cellules et joue un rôle crucial dans plusieurs processus physiologiques, y compris le développement embryonnaire, la cicatrisation des plaies, et les réponses immunitaires. Cependant, la migration cellulaire est également un mécanisme clé dans l'activation de ces cancers des cellules cancéreuses à se détacher de la tumeur primaire pour commencer la dissémination métastatique. Dans les dernières années, différents essais de migration cellulaire ont été développées pour analyser le comportement migratoire des différents types de cellules. Parce que le comportement locomoteur des cellules diffère nettement entre une à deux dimensions (2D) et en trois dimensions (3D) l'environnement, il peut être supposé que l'analyse de la migration des cellules qui sont incorporées dans un environnement 3D donnerait à la migration cellulaire plus importante données. L'avantage de l'essai décrit à la migration de la matrice de collagène 3D est que les cellules sont incorporées dans un réseau 3D physiologique des fibres de collagène qui représentent la composante majeure de la matrice extracellulaire. Grâce àtime-lapse microscopie vidéo migration de cellules réelles est mesurée permettant la détermination de plusieurs paramètres de migration ainsi que leurs modifications en réponse à des facteurs pro-migratoires ou des inhibiteurs. Divers types de cellules peuvent être analysées en utilisant cette technique, y compris les lymphocytes / leucocytes, des cellules souches et des cellules tumorales. De même, aussi des amas de cellules ou sphéroïdes pourraient être intégrés dans le concomitante de matrice de collagène avec l'analyse de l'émigration des cellules individuelles de l'amas de cellules / sphéroïde dans le réseau de collagène. Nous concluons que le dosage de migration 3D de la matrice de collagène est un procédé polyvalent pour analyser la migration des cellules au sein d'un environnement 3D physiologique analogue.

Introduction

Comme la fusion cellulaire (pour un aperçu, voir ^1,2) la migration cellulaire est un autre phénomène biologique qui est impliqué dans une multitude de processus physiologiques tels que le développement embryonnaire, la cicatrisation des plaies et les réponses immunitaires (pour revue, voir ^3). Cependant, la capacité de migrer est également une condition préalable pour les cellules tumorales à métastaser (pour revue, voir ^3,4).

La migration cellulaire est un complexe, pas procédé encore entièrement compris qui est dirigée par l'interaction de plusieurs voies de transduction du signal initié par divers ligand (par exemple, des cytokines, des chimiokines, des facteurs de croissance, les hormones, les composants de la matrice extracellulaire) récepteur (par exemple, les kinases de tyrosine du récepteur, récepteurs de chimiokines, intégrines) ⁵ interactions provoquant finalement la réorganisation du cytosquelette d'actine concomitante ment et le remontage des complexes d'adhésion focale et l'intégrine-médiation de signalisation ^6.

Pour analyser la migration des cellules de plusieurs in vitro et in vivo de la migration des cellules ont été développés au cours des dernières décennies, y compris le test Boyden chambre / transwell ^7, zéro dosage / cicatrisation dosage ^8-10, en trois dimensions ( 3D) matrice de collagène migration dosage ¹¹ ainsi que intravital imagerie / microscopie (pour revue, voir ^12). Chacun de ces essais de migration cellulaire a des avantages et des inconvénients, par exemple, concernant les coûts et les besoins de l'équipement, de la manutention ou de la fiabilité des données obtenues.

Tant la chambre / test transwell Boyden et le / la cicatrisation dosage dosage de zéro sont, à faible coût et facile dosages bien développés pour mesurer la migration cellulaire in vitro ^7-10. Dans la chambre de Boyden / cellules transwell d'analyse sont ensemencées sur un insert contenant des pores (environ 8 m de diamètre) - le compartiment supérieur ⁷ soi-disant. En option, l'insert peut être revêtu de m extracellulaireAtrix composants, par exemple, la fibronectine, le collagène, etc, afin d'imiter un environnement plus physiologique. De même, les cellules endotheliales peuvent être cultivées sur le dessus de l'insert, imitant ainsi une barrière de cellules endotheliales ^13. Les cellules qui sont passées à travers les pores pendant un intervalle de temps défini dans le compartiment inférieur hébergeant médias et les suppléments, tels que des facteurs de croissance et des chimiokines, sont utilisées comme une sortie de lecture quantifier la migration des cellules (ou extravasation).

Dans le test de rayure / cellules d'essai de cicatrisation sont ensemencées dans des plaques et sont cultivées jusqu'à confluence ^10. En fonction des plaques de montage expérimental peut être pré-revêtu avec des composants de la matrice extracellulaire, comme la fibronectine. Après avoir créé une égratignure / plaies par grattage des cellules individuelles de monocouches de cellules de chaque côté de la rayure / blessure peut migrer dans l'espace, remplissant ainsi / guérissant ^10. La distance entre les deux côtés de la rayure / blessures est déterminéeen fonction du temps et est utilisé comme une sortie de lecture pour l'activité de migration des cellules ^10. Cependant, faire la distinction entre la prolifération cellulaire (ce qui pourrait également entraîner de remplissage / la guérison de la rayure / blessure) et la migration cellulaire, il est recommandé de combiner le dosage avec time-lapse microscopie vidéo et une seule cellule de suivi ^10.

Toutefois, la chambre de Boyden / test transwell et zéro dosage / cicatrisation dosage, sont assez imparfaite concernant un environnement cellulaire physiologique comme. Dans la chambre de Boyden / cellules d'essai transwell ont à migrer à travers un pore plastique, tandis que dans le test de zéro / de cicatrisation des cellules d'essai sont ensemencées sur une plaque de matière plastique pré-revêtu à deux dimensions. De même, il est bien connu que le comportement migratoire diffère sensiblement entre un environnement en deux dimensions et 3D ^3. Par exemple, les adhérences tridimensionnel matrice de fibroblastes diffèrent des adhésions focales et sur deux fibrillaires caractérisésubstrats de dimension de leur contenu et de α5β1 intégrine avß3, la paxilline, d'autres composants du cytosquelette, et phosphorylation de la tyrosine kinase d'adhérence focale ^14. De même, les cellules intégrées dans un environnement 3D s'affichent également un comportement migratoire modifié ^15. Ainsi, pour analyser la migration des cellules avec plus de précision un dosage de migration est recommandé permettant de mesurer la migration de cellules individuelles au sein d'un milieu physiologique ou physiologique analogue à 3D.

Intravitale imagerie / microscopie est l'étalon-or pour mesurer la migration des cellules dans un contexte physiologique 3D. Cela ne fait pas partie des interactions matrice de cellules extracellulaires, mais aussi aux interactions entre les différents types de cellules, comme les cellules tumorales et les cellules endothéliales lors de l'extravasation ¹⁶ ou le trafic des lymphocytes à l'intérieur du ganglion lymphatique ^17, qui, à ce jour, est possible grâce à l'amélioration des techniques de microscopie par fluorescence, tels que le 2-photonmicroscopie confocale à balayage laser, l'utilisation de colorants fluorescents vitaux et les souches de souris transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dérivées ^12,16,17. En outre, l'imagerie intravitale / microscopie peut être combiné avec le suivi de la cellule manuelle et automatique ^18. Toutefois, en raison de la nécessité d'un 2-photon microscopie confocale à balayage laser, ainsi que les animaux (et les modèles animaux transgéniques appropriés) intravitale imagerie / microscopie est une technique plutôt de coûteux.

Pour surmonter les limitations de la chambre / essai transwell Boyden et l'essai de cicatrisation dosage zéro / de la plaie et à analyser la migration de différents types de cellules dans un environnement 3D la détermination de la migration de la matrice de collagène 3D est développé ^11,19. De ce fait, la migration des cellules sont incorporées dans un réseau de fibres de collagène en 3D, qui ressemble plus à la situation in vivo. Conjointement, en raison de time-lapse microscopie vidéo migration de cellules réelles est mesurée permettant la déternation de plusieurs paramètres de migration ainsi que leurs modifications en réponse à des facteurs pro-migratoires ou des inhibiteurs. Divers types de cellules peuvent être analysées en utilisant cette technique, y compris les lymphocytes et les leucocytes ^11,20 souches hématopoïétiques, des cellules progénitrices / ^{21 à 24,} et les cellules tumorales ^5,25-29. En plus des cellules seule cellule également grappes ou sphéroïdes pourraient être intégrés dans le concomitante de matrice de collagène avec l'analyse de l'émigration des cellules individuelles de l'amas de cellules / sphéroïde dans le réseau de collagène ^30,31.

Ce protocole donne un aperçu d'une technique simple, mais puissant pour analyser le comportement migratoire des différents types de cellules dans un environnement 3D - une méthode in vitro donnant des résultats qui sont proches de la situation in vivo.

Protocole

1 Préparation de la migration Chambers

1. Préparer une gelée de paraffine / pétrole (1: 1) mélanger et chauffer jusqu'à ce que le mélange soit fondu. Utilisation d'un pinceau et tirer 2-3 couches de la gelée de paraffine / éther de pétrole (1: 1) mélanger dans le milieu de la lame de verre, conformément aux figures 1B-1D.
   NOTE: Nous utilisons des lames de verre communes (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (L / P / H))
2. Appliquer le mélange de gelée de paraffine / pétrole fondu rapidement sur la lame de verre pour éviter la solidification pendant le dessin. S'assurer que la couche de gelée de paraffine / pétrole est d'environ 2-2,5 cm de long et 0,3-0,5 cm de largeur. L'épaisseur de la couche de gelée de paraffine / pétrole doit être d'environ 0,1 à 0,15 cm.
3. Ajouter une lamelle à la cire de paraffine solidifiée / mélange de gelée de pétrole et sceller de deux à trois couches de paraffine mélange de gelée cire / de pétrole (figures 1E, 1F). Utilisez 4-8 chambres de migration pour une expérience de la migration cellulaire commun. Lieu migration chambres iN en position verticale dans un rack.

2 Préparation de la suspension cellulaire de collagène Mix

1. Récolte (par exemple, avec 0,25% de trypsine / EDTA) et compter les cellules d'intérêt. Remettre en suspension les cellules dans du milieu complet contenant du sérum de veau foetal (SVF), les antibiotiques et les suppléments recommandé. Préparation 8.4 1,5 ml et les tubes de réaction de 20 ul de suspension de cellules contenant de 4 à 6 x 10 ⁴ cellules (le nombre total de cellules dépend du type de cellules à analyser) et remplir à 50 ul avec du milieu complet.
   REMARQUE: Des composés supplémentaires (par exemple, facteurs de croissance, des chimiokines, des inhibiteurs, etc) sont ajoutés à la suspension cellulaire. Utilisation des solutions mères appropriés, tels que le volume final de la suspension cellulaire ne dépasse pas 50 pi.
2. Préparer un montant total de 452 ul finale suspension de collagène pour quatre expériences de migration cellulaire. Ajouter 50 ul de MEM 10 x (pH 5.1 à 5.5) et 27 ul d'une solution de bicarbonate de sodium à 7,5% (pH 9,0 à 9,5) Dans un tube de réaction de 1,5 ml et mélanger soigneusement. Observez la solution couleur tour du jaune-orangé au violet intense (pH 9,0-9,5). Ajouter suspension de collagène 375 pi liquide à l'/ solution de bicarbonate de sodium 10x MEM et bien mélanger. Le pH de la suspension de collagène finale doit être d'environ 7,5 (indiqué par une couleur violet clair).
   REMARQUE: Vérifiez le pH de la solution de bicarbonate de sodium à 7,5%. Si le pH est d'environ 7,5 au lieu de la solution de bicarbonate de sodium avec un couvercle ouvert dans un incubateur (37 ° C, 5% CO ₂₎ d'être saturé en CO ₂ et d'augmenter le pH (environ 9,0 à 9,5). Le pH de la suspension de collagène cellule de mélange est essentiel pour la stabilité du réseau de collagène. Si elle est trop faible, le réseau de collagène se replier lors de l'expérience de la migration cellulaire.
   NOTE: Pour ce protocole, utilisez collagène liquide (pH 1,9-2,2) depuis l'arrière bovine (2.9 à 3.3 mg / ml de collagène; 95% de collagène de type I, 5% du collagène de type IV). Des exemples de protocoles de préparation de treillis plus de collagène à l'aidecollagène de type I provenant d'autres sources, telles que porcine ou rat, sont donnés en ^32,33. Ne pas modifier les volumes des solutions utilisées que ceci modifie la concentration finale de collagène de 1,67 mg / ml de la maille. Une concentration de collagène plus ou moins élevée a un impact sur ​​la densité des fibres de collagène et la distance moyenne entre les concomitante avec les cellules de comportement migratoire ^34.
3. Ajouter 100 ul de la suspension finale de collagène à 50 ul de suspension cellulaire et mélanger thoroughly.The suspension finale de collagène (1,67 mg / ml de collagène) est légèrement visqueux. Pour transférer le montant exact (100 pi), la pipette la solution finale de collagène, une fois de haut en bas avant de le transférer à la suspension de cellules.
   Remarque: Une fois que le mélange de cellules en suspension de collagène est combiné avec la solution de bicarbonate / sodium 10x MEM et la valeur de pH de 7,5 a changé les fibres de collagène commencent immédiatement à polymériser.
4. Transférer la dernière cellule mélange collagène de suspension de eréaction tubes e aux chambres de migration. Tapoter doucement la chambre de migration à répartir équitablement la cellule mélange collagène de suspension sur le fond de la chambre de migration (Figure 1H). Placer les chambres de migration dans une position verticale dans un bâti et incuber pendant environ 30 minutes (37 ° C, 5% CO ₂₎ pour permettre la polymérisation des fibres de collagène.
5. Notez que le réseau de collagène polymérisé est légèrement trouble, mais toujours en étant léger couleur pourpre. Remplir les chambres de migration avec un milieu complet ou un milieu complet avec des suppléments d'intérêt et sceller la chambre de migration avec de la gelée de paraffine / pétrole mélange (figures 1I, 1J).

3. enregistrement et l'analyse de la migration cellulaire

Cette section décrit l'enregistrement de la migration cellulaire par time-lapse vidéo microscopie et analyse de la migration cellulaire par un suivi manuel de la cellule.

1. Allumez le microscope et la HEA platine du microscopeter. Ajuster la température à 37 ° C. Utilisez un objectif 10X. Passer chambre de migration sous un microscope et concentrer à environ 50 cellules ou plus dans le champ de vision.
2. La migration des cellules d'enregistrement en mode time-lapse en utilisant un logiciel de surveillance vidéo multi-caméras. Enregistrer des films de la migration des cellules dans un format approprié, par exemple, "* avi» ou «* mov". Lier les fichiers vidéo de la migration des cellules à une base de données contenant des informations à l'appui, comme le type de cellule et des conditions expérimentales.
   NOTE: Nous enregistrons les lymphocytes et les HSPCs jusqu'à 2 heures en utilisant un facteur time-lapse de 1:80, ce qui signifie que 0,75 s en time-lapse est égal à 1 min en temps réel. Les cellules tumorales sont des cellules lents et sont ainsi enregistrées pendant au moins 16 heures en utilisant un facteur time-lapse de 1: 1800 (0,5 s en time-lapse est égale à 15 min en temps réel).
3. Analyser films de migration cellulaire en utilisant un logiciel de suivi de la cellule appropriée, comme les greffons logiciels ImageJ(Un aperçu est donné dans ^18). Pour une analyse impartiale, il est d'une importance cruciale que les cellules seront choisis au hasard à l'insu si les cellules sont actives ou non migrateurs.
   NOTE: Nous utilisons un logiciel auto-développé pour suivre manuellement les chemins d'au moins 30 cellules par expérience en suivant les cellules se déplacent avec précision le curseur de la souris (qui est positionné pour le noyau). Bien que le suivi, les coordonnées xy des cellules chenilles sont automatiquement déterminés conformément au mode time-lapse utilisé. Pour les lymphocytes / HSPCs coordonnées xy sont déterminées chaque 0,75 s (égale à 1 min en temps réel), alors que pour les cellules tumorales les coordonnées xy sont déterminées chacune 0,5 s (égale à 15 minutes en temps réel).
4. Déterminer un total de 60 coordonnées xy par cellule pour une expérience de la migration cellulaire typique. Elle est égale à 1 heure en temps réel pour les lymphocytes / HSPCs et 15 heures en temps réel pour les cellules tumorales. A "," indique que la cellule n'a pas bougé entre two points dans le temps, alors qu'un "valeur numérique" indique la distance en "pixels" d'une cellule est déplacé entre deux points dans le temps (figure 2A).
   REMARQUE: suivi manuel de cellules requiert de l'expérience. Particulièrement cellules migrantes rapide sont difficiles à suivre et chaque pièce de type de cellule un comportement migratoire distincte qui pourrait être déclenchée par des facteurs complétées. Dans le cas de la division cellulaire tout en suivant, choisissez au hasard une cellule fille pour le suivi continue. Les cellules qui migrent hors du champ de vue ou meurent tandis que le suivi ne sont pas négligés, mais sont pris en compte pour l'analyse.

Analyse 4. données

1. Analyser les données de suivi de la cellule en utilisant un logiciel approprié, par exemple, un tableur.
   1. Analyser les données de suivi de la cellule en copiant le suivi des données brutes (figure 2A) cellule, dans un modèle de feuille de calcul auto-conçu. Multipliez somme des «valeurs numériques», représentantla distance totale d'une cellule a migré avec un facteur de correction pour convertir "pixel" en "um".
   2. Déterminer deux paramètres de migration cellulaire: activité locomotrice (ce qui équivaut à un taux de migration) et le temps de déplacement actif (figures 2C, 2D).
   3. Identifier les cellules qui ont migré inférieure à 25 um (niveau de seuil pour réduire le nombre de cellules faussement positives) en tant que cellules non en mouvement. Remplacer "valeurs numériques» de ces cellules avec ",".
      REMARQUE: Le paramètre "activité locomotrice» (ou taux de migration) représente le pourcentage de cellules de la population cellulaire suivis qui ont déménagé entre deux points dans le temps (figure 2D). Une "valeur numérique" est définie comme une cellule mobile, tandis que "," est définie comme une cellule non en mouvement. Le paramètre "temps de déplacement actif» (active) représente le pourcentage du temps total d'une cellule a migré en relation de la trame de temps de la période d'observation (Figure 2C). Une "valeur numérique" indique que la cellule a été déplacé, tandis que "," indique que la cellule n'a pas bougé. Ce paramètre est en outre utilisé pour déterminer le nombre de cellules qui ne s'est pas déplacé.
2. Calculer la signification statistique et les données de migration de cellules d'affichage.
   1. Calculer la signification statistique de l'activité locomotrice moyenne de la cellules (taux de migration) en utilisant le test de Mann-Whitney. Considérons p-value <0,05 comme significative.
   2. Afficher l'activité locomotrice moyen de cellules que xy-diagramme, BoxPlot schéma, ou comme un diagramme de graphique à barres. Afficher des données simples à base de cellules, telles que le temps de mouvement actif ou la vitesse, comme un diagramme de graphique à barres ou sous forme d'histogramme.
      REMARQUE: Si le logiciel de feuille de calcul choisi ne contient pas un outil graphique ou histogramme BoxPlot une recherche en ligne doit être effectuée pour la recherche de tu adaptétorials.

Résultats

La détermination de la migration matrice 3D-collagène utilisé combiné avec time-lapse vidéo-microscopie et le suivi de la cellule assistée par ordinateur permet la détermination des différents paramètres de la migration des cellules, y compris les deux paramètres sur la population (par exemple, signifier activité locomotrice) et les paramètres à base de cellules individuelles (par exemple, le temps de déplacement actif, la vitesse, la distance migré). Un exemple des ensembles de données...

Discussion

La capacité de migrer est une caractéristique des cellules tumorales ^4. Sans la capacité de se détacher de la tumeur primaire et la migration des cellules tumorales à travers les tissus conjonctifs environnants ne sera pas capable de semer des lésions secondaires, qui sont la cause principale de la mort de presque tous les patients atteints de cancer. En raison de cette relation de nombreuses études se concentrent sur la migration des cellules cancéreuses. Le but de ces études est l'identificatio...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leica DM IL inverted microscope	Leica, Wetzlar, Germany
Microscope stage heater	Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany
JVC C1431 video camera	JVC, Bad Vilbel, Germany
Axis 241Q video server	Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 Computer	Apple Macintosh
iMac	Apple Macintosh
FileMaker Pro	FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany
Multi-camera video surveillance software(Security Spy)	Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0	RunRev Ltd., Edinburgh, UK
Paraffin	Applichem GmbH, Darmstadt, Germany	A4264
Petroleum jelly	local drug store
Purecol (liquid collagen)	Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands		contains 2.9 - 3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)
10x MEM	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M0275
7.5% sodium bicarbonate solution	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	S8761
EGF	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	E9644
U73122	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	662035	dissolve first in CHCl3; reconstitute in DMSO just prior to use