Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

Özet

Hücre göçü, bir kanser gibi yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkilerinin ve patofizyolojik süreçler gibi, fizyolojik bir bolluk dahil bir biyolojik bir olgudur. 3D-kollajen matris göç deneyi 3D fizyolojik gibi bir ortamda içinde farklı hücre tipleri göç özelliklerini analiz etmek için çok yönlü bir araçtır.

Özet

Göç etme yeteneği, çeşitli hücre tiplerinin ayırt edici bir özelliği olup, embriyonik gelişmesi, yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkilerinin dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçlerde önemli bir rol oynar. Fakat, hücre göçü aynı zamanda yayılma metastatik başlatmak için primer tümörün ayırmak için, bu kanser hücrelerini etkinleştirerek kanserinde önemli bir mekanizmadır. Geçen yıllar içinde çeşitli hücre göçü deneyler, farklı hücre tiplerinin göç davranışlarını analiz için geliştirilmiştir. Hücrelerin lokomotor davranışı belirgin bir iki boyutlu (2D) arasında değişmektedir ve üç boyutlu (3D) ortamında 3 boyutlu bir ortamda gömülü olan hücrelerin göç analizi daha önemli hücre göçü olarak verim olacağını kabul edilebilir, çünkü Veri. Tarif edilen 3D kollajen matris, göç deneyi avantajı hücreler, hücre dışı matrisin başlıca bileşenini temsil eden kolajen liflerinin ve fizyolojik bir 3 boyutlu bir ağ içinde gömülü olmasıdır. Nedeniylezaman atlamalı görüntü mikroskopi gerçek Hücre göçü, ön-göç faktörleri veya inhibitörlerine tepki olarak çeşitli geçiş parametrelerine ve bunların değişikliklerinin tespitine imkan ölçülür. Çeşitli hücre tipleri hücreleri ve tümör hücreleri, lenfositler / lökositler de dahil olmak üzere, bu teknik kullanılarak kök incelenebilir. Benzer şekilde, aynı zamanda hücre kümeleri veya sferoidler kolajen kafes içine hücre kümesi / sfero ikinci tek hücrelerin göç analizi ile kollajen matris, eşlik eden gömülü olabilir. Biz 3D kollajen matris göç deneyi fizyolojik-benzeri 3D ortamında hücrelerin göçünü analiz için çok yönlü bir yöntem olduğu sonucuna varıldı.

Giriş

Hücre füzyonu (genel bir bakış için bakınız ^1,2) Hücre göçü, embriyonik gelişmesi, yara iyileşmesi ve bağışıklık (inceleme için ³ bakınız) dahil olmak üzere, fizyolojik süreçlerin bir bolluk katılır başka bir biyolojik fenomen gibi. Ancak, göç yeteneği tümör hücreleri (inceleme için ^3,4 bakınız) metastaz için bir önkoşul da.

Hücre göçü, bir kompleksi, çeşitli ligand (örneğin, sitokinler, kemokinler, büyüme faktörleri, hormonlar, hücre dışı matris bileşenleri) reseptör (örneğin, reseptör tirozin kinazlar tarafından başlatılan çeşitli sinyal transdüksiyon yollarının etkileşimiyle yönlendirilir henüz tam olarak anlaşılmamıştır süreçtir sonuçta de- ve fokal yapışma kompleksleri tekrar takılmasıyla ile aktin hücre iskeleti eşlik eden yeniden yapılanmasını neden kemokin reseptörleri, integrinleri) etkileşimler ^{5 6} sinyalizasyon integrin'in-aracılı.

in vitro ve in vivo çeşitli hücre göç deneyleri, hücre göçü analiz etmek tahlil ^8-10, üç boyutlu (şifa Boyden odası / Transwell tahlilinde ^7, çizilmeye tahlil / yara dahil, geçmiş yıllarda geliştirilmiştir 3D) kollajen matris, göç deneyi ¹¹ yanı sıra, intravital görüntüleme / mikroskop (inceleme için ¹² bakınız). Bu hücre göç deneyleri her artılarını ve eksilerini, örneğin, ilgili maliyetleri ve ekipman ihtiyacını, taşıma veya elde edilen verilerin güvenilirliği vardır.

Boyden odasının / Transwell deneyi ve çizik deney / yara iyileşme testi, hem de in vitro ^7-10 hücre migrasyonun ölçülmesi için kullanımı kolay, düşük maliyetli ve gelişmiş tahliller bulunmaktadır. Olarak adlandırılan üst bölmeye ⁷ - Boyden odasının içinde / Transwell hücre tahlili bir uç ihtiva eden gözenek (yaklaşık 8 um çapında) üzerine ekilir. İsteğe bağlı, uç hücre dışı m ile kaplanabilirAtrix parçalar, örneğin, fibronektin, kolajen, vb daha fizyolojik ortamı taklit etmek. Benzer şekilde, endotelyal hücreler, bu şekilde bir endotelyal hücre engeli ¹³ taklit eden, parçanın üstüne yetiştirilebileceğini. Bu gibi büyüme faktörlerinin ve kemokinlerin medya ve takviyeleri, barındırılması alt bölmeye tanımlanan bir zaman aralığı boyunca gözeneklerin içinden geçen bu hücreler, hücre göçü (veya ekstravazasyon) ölçmek için bir okuma olarak kullanılmaktadır.

Sıfırdan deneyde / yara iyileşmesi analiz, hangi hücrelerin plakalara ekilir ve ortak akışkanlığa gelinceye kadar büyütülür ^10. Deney plakaları ayar bağlı olarak örneğin fibronektin gibi hücre dışı matriks bileşenlerinin, önceden kaplanmış olabilir. Sıfırdan her tarafında hücre tek tek hücreleri kazıyarak yara çizik / oluşturduktan sonra / yara böylelikle ¹⁰ şifa / dolum, boşluğa geçirebilirsiniz. Sıfırdan / yaraların iki tarafı arasındaki mesafe belirlenirzaman bağlı olarak ve hücreler ¹⁰ göç aktivitesi için bir okuma olarak kullanılır. Ancak, time-lapse video mikroskopi ve tek hücre ¹⁰ izleme ile tahlil birleştirmek için tavsiye edilir ve hücre göçü (ayrıca çizik / yaranın dolum / iyileşmeye neden olabilir), hücre çoğalması arasındaki ayrımcılık.

Ancak, Boyden odası / Transwell tahlil ve iyileşmesi deneyini çizik tahlil / yara, hem fizyolojik bir benzeri hücresel çevre ile ilgili oldukça kusurlu. Boyden odasının içinde / Transwell hücre tahlili sıfırdan deney hücreleri iyileştirme deneyi / yara, iki boyutlu bir önceden kaplanmış plastik bir levha üzerine ekilir ise, plastik bir gözenekten geçiş gerekir. Aynı şekilde, iyi göç davranışı iki boyutlu ve 3 boyutlu bir ortamda ³ arasında belirgin farklılık olduğu kabul edilmektedir. Örneğin, fibroblastlar üç boyutlu matris adezyonlar ile karakterize edici özelliği, iki fokal ve fibriler adezyonlardan farklıdırα5β1 ve αvβ3 integrinler, paxillin, diğer hücre iskeleti bileşenleri ve fokal yapışma kinaz ¹⁴ tirosin fosforilasyonu içindeki yoğunluğu boyutlu takım alt-tabakalar. Aynı şekilde, bir 3D ortamı içinde gömülü hücreler de değişmiş bir göç davranışı ¹⁵ görüntülenir. Böylece, daha doğru bir şekilde hücre göçünü analiz etmek için göç deneyi 3B, fizyolojik veya fizyolojik gibi bir ortam içinde tek hücre göçünü ölçmek için izin önerilir.

İntravital görüntüleme / mikroskop 3D fizyolojik bağlamında hücre göçü ölçmek için altın standarttır. Bu şimdiye kadar sadece nedeniyle mümkün olduğu, ancak, aynı zamanda, lenf düğümü ^{17, 16} ya da içindeki ekstravazasyon lenfosit ticaretinde tümör hücreleri ve endotelyal hücreler gibi farklı hücre tipleri arasında etkileşimler, hücre dışı matris-hücre etkileşimlerinin ait değil örneğin 2-foton şeklinde geliştirilmiş bir floresan mikroskopi teknikleri,konfokal lazer tarama mikroskobu, floresan proteinleri sentezleyen türevleri ^12,16,17 hayati floresan boyalar ve transgenik fare suşlarının kullanılması. Buna ek olarak, intravital görüntüleme / mikroskop indirin otomatik hücre ¹⁸ izlemek için birleştirilebilir. Bununla birlikte, bir 2-foton odaklı lazer tarama mikroskobu ihtiyacı hem de hayvanlarda (ve uygun transjenik hayvan modellerinde) intravital görüntüleme / mikroskop oldukça maliyet-yoğun bir yöntemdir.

Boyden odası / Transwell tahlili ve çizik tahlil / yara iyileştirici testin sınırlamaları aşmak ve 3D kollajen matris göç deneyi ^11,19 geliştirilen bir 3D ortamında farklı hücre tiplerinin göç analiz etmek. Böylece, göç edici hücrelerin 3B kolajen lif şebekesi, in vivo olarak daha fazla benzeyen, bir durum içinde gömülürler. Müştereken, time-lapse video mikroskopi gerçek hücre göçü nedeniyle saptamaya olanak ölçülürBirkaç göç parametreler yanı sıra yanlısı göçmen faktörler veya inhibitörleri tepki olarak kendi değişikliklerin ulus. Çeşitli hücre tipleri lenfosit ve lökositlerin ^11,20, hematopoietik sap / ^21-24 progenitör hücreleri ve tümör hücreleri dahil olmak üzere bu ^5,25-29 teknik kullanılarak analiz edilebilir. Tek hücre yanı sıra, aynı zamanda, hücre kümeleri veya sferoidler ^30,31 kafes kalojee Zigotun / sfero ikinci tek hücrelerin göç analizi ile kollajen matris, eşlik eden gömülü olabilir.

In vivo durumu yakın sonuçlar veren bir in vitro yöntemle - Bu protokol, 3D ortamında farklı hücre tiplerinin göç davranışlarını analiz etmek için basit, ama güçlü tekniği hakkında genel bir bakış sunmaktadır.

Protokol

Göç Odaları 1. Hazırlık

1. Karışım kadar karışım ve ısı eridi: Bir parafin / vazelin (1 1) hazırlayın. Bir boya fırçası kullanarak parafin balmumu / petrol peltesi 2-3 katmanları çizmek (1: 1) Şekil 1B-1D uygun olarak cam slayt ortasında karıştırın.
   NOT: Biz ortak cam slaytlar kullanarak (76 x 26 x 1.0-1.5 mm (G / D / Y))
2. Çizim sırasında katılaşma önlemek için cam slayt hızla eridi parafin / vazelin karışımı uygulayın. Parafin / vazelin tabakası uzunluğu yaklaşık 2-2.5 cm genişliğinde ve 0.3-0.5 cm olduğundan emin olun. Parafin mum / petrol jeli tabakanın kalınlığı yaklaşık 0.1-0.15 cm olmalıdır.
3. Katılaşmış parafin / vazelin karışımı bir coverslip ekleyin ve 2-3 katmanları mum / vazelin karışımı parafin (Şekil 1E, 1F) ile kapatın. Ortak bir hücre göçü deneyi için 4-8 geçiş odaları kullanın. Yer göç odaları iBir rafa dik bir pozisyon n tane.

Kolajen Süspansiyon Hücre Mix 2. Hazırlık

1. Hasat (örneğin,% 0.25 tripsin / EDTA) ve ilgili hücreleri sayın. Tam fetal buzağı serumu (FCS) içeren ortama, antibiyotikler hücrelerin tekrar ve ek önerilir. 4-8 1.5 ml'lik tepkime tüpleri ve 4-6 x 10 ⁴ hücreleri (hücre toplam sayısı, analiz edilecek hücre türüne göre değişir) ihtiva eden 20 ul hücre süspansiyonu hazırlamak ve tam ortam maddesi ile 50 ul'ye kadar doldurun.
   Not: ek bileşikler (örneğin, büyüme faktörleri, kemokinler, inhibitörleri, vs), hücre süspansiyonu ilave edilir. Hücre süspansiyonunun nihai hacim 50 ul aşmayacak şekilde uygun bir stok solüsyonları kullanın.
2. Dört hücre göçü deneyleri için 452 ul nihai kollajen süspansiyonun toplam miktar hazırlayın. 50 ul 10x MEM (pH 5,1-5,5) ve% 7.5 sodyum bikarbonat çözeltisi 27 ul (pH 9,0-9,5 ekleme), 1.5 ml'lik tepkime tüpüne ve iyice karıştırın. Yoğun mor (pH 9.0-9.5) sarı-turuncu çözüm renk dönüşü gözlemleyin. 10x MEM / sodyum bikarbonat solüsyonuna 375 ul sıvı kollajen süspansiyonu ekleyin ve iyice karıştırın. Nihai kollajen süspansiyonun pH değeri yaklaşık 7.5 olmalıdır (açık mor bir renk ile belirtilir).
   NOT:% 7.5 sodyum bikarbonat çözeltisi ile pH değeri kontrol edilir. PH, yaklaşık 7.5 bir yerde bir kuluçka makinesi içinde bir açık kapağa sodyum bikarbonat çözeltisi ise (37 ° C,% 5 _{CO2) CO2} ile doyurulmuş ve pH (yaklaşık 9,0-9,5) yükseltmek için. Kollajen hücre süspansiyon karışımı pH kolajen ağının istikrarı için çok önemlidir. Eğer çok düşük ise, kollajen kafes hücre göçü deneyi sırasında çökecektir.
   NOT: Bu protokol için, sığır Arkadan gelen sıvı kolajen (pH 1.9-2.2) kullanın (2.9-3.3 mg / ml kollajen,% 95 kollajen tip I,% 5 kollajen tip IV). Kullanılarak daha fazla kolajen kafes hazırlık protokolleri örnekleriBöyle domuz ya da sıçan gibi diğer kaynaklardan kollajen tip I, ^32,33 verilmiştir. Bu 1.67 mg / ml kafesinin nihai kollajen konsantrasyonunu değiştirmek gibi kullanılan çözeltilerin hacimleri değiştirmez. Daha yüksek ya da daha düşük yoğunluğu kolajen, kolajen liflerinin yoğunluğu ve hücrelerin göç davranışları ³⁴ ile birlikte bunların arasındaki ortalama mesafe üzerinde bir etkisi vardır.
3. 50 ul hücre süspansiyonu nihai kollajen süspansiyonu 100 ul ve thoroughly.The son kollajen süspansiyonu (1,67 mg / ml kolajen) karışımı hafif ağdalıdır. Doğru miktarda (100 ul) aktarmak için, hücre süspansiyonu aktarmadan önce bir kez yukarı ve aşağı nihai kollajen çözüm pipetle.
   Not: kolajen hücre süspansiyon karışımı, pH değeri 7.5 olarak değiştirildi 10x MEM / sodyum bikarbonat çözeltisi ile bir araya sonra kolajen lifleri hemen polimerize başlar.
4. Th nihai kollajen süspansiyon hücre karışımı aktarıngöç odalarına e reaksiyon tüpleri. Hafifçe eşit geçiş odası (Şekil 1 H) alt kollajen hücre süspansiyon karışımı dağıtmak için geçiş bölmesinin dokunun. Rafa dik bir konumda geçiş odaları yerleştirin ve yaklaşık 30 dakika inkübe edilir (37 ° C,% 5 _CO2) kolajen liflerinin polimerleşmesine izin vermek.
5. Polimerize kollajen kafes biraz bulanık ama hala açık mor renk olan dikkat edin. Ilgi takviyeleri ile, tam bir ortamda veya tam ortam ile geçiş odaları kadar doldurun ve parafin balmumu / vazelin karışımı (Şekil 1 i, 1 i) ile geçiş bölmesini sızdırmaz.

3. Kayıt ve Hücre Göç Analizi

Bu bölüm, manuel hücre takibi ile zaman atlamalı görüntü mikroskopi ve hücre göçü analizi ile hücre göçü kaydı tanımlamaktadır.

1. Mikroskop ve mikroskop sahne Västergötland açınter. 37 ° C sıcaklık ayarlayın. 10X objektif kullanın. Mikroskop altında geçiş bölmesi yerleştirin ve görüş alanı, yaklaşık 50 ya da daha fazla hücre odaklanır.
2. Bir çok kamera video izleme yazılımı uygulamasını kullanarak time-lapse modunda kaydedin hücre göçü. Örneğin, uygun bir formatta hücre göçü film kaydet, "* .avi" veya "* .mov". Böyle hücre tipine ve deney şartları, destekleyici bilgileri içeren bir veritabanı hücre göçü film dosyalarını bağlayın.
   NOT: time-lapse 0.75 sn gerçek zamanlı olarak 1 dakika eşit olduğu anlamına gelir 1:80 bir time-lapse faktörü kullanarak kadar 2 saat boyunca lenfositler ve HSPCs kaydediyor. Tümör hücreleri, yavaş hareket eden hücreler ve bu nedenle 1 bir zaman atlamalı faktörü kullanılarak, en az 16 saat boyunca kaydedilir: 1.800 (hızlandırılmış 0.5 sn gerçek zamanlı olarak 15 dakika eşittir).
3. ImageJ yazılım eklentileri gibi uygun bir hücre izleme yazılımı uygulamasını kullanarak hücre göçü film Analiz(Genel ^18'de verilmiştir). Tarafsız bir analiz için hücrelerin aktif ya da değil, göçmen olup olmadığını hücreleri rastgele bilgisi olmadan seçilmiş olacağı önem taşımaktadır.
   NOT: Biz manuel (çekirdeğine yerleştirilmiş) fare imleci ile doğru hareket hücrelerini takip ederek deney başına en az 30 hücre yollarını izlemek için kendi geliştirdiği yazılım uygulamasını kullanıyor. Takip ederken, izlenen hücrelerin xy koordinatları otomatik olarak kullanılan time-lapse moduna göre belirlenmektedir. Tümör hücreleri için xy-koordinatları (15 dk gerçek zamanlı eşit) her 0.5 saniyede tespit edilir ise lenfositlerin / HSPCs xy-koordinatları, (1 dk gerçek zamanlı eşit) her 0.75 sn belirlenir.
4. Tipik bir hücre göçü deney için hücre başına 60 xy-koordinatlarının toplam belirleyin. Bu tümör hücreleri için lenfositler / HSPCs ve 15 saat için gerçek zaman 1 saat gerçek zamana eşittir. A "," hücre tw arasında taşınamaz olduğunu gösteriro zaman noktaları, bir "sayısal değer" ise "piksel" hücre 2 zaman noktalarında (Şekil 2A) arasında taşındı yılında mesafeyi gösterir.
   NOT: Manuel hücre izleme deneyimi gerektirir. Özellikle hızlı göç edici hücrelerin izlemek için zor olan ve her hücre tipi sergi takviye faktörler tarafından tetiklenebilir belirgin bir göç davranışları. Izleme sırasında hücre bölünmesi durumunda, rastgele izleme devam için bir kızı hücre seçin. Görüş alanının dışına göç veya izleme ihmal değil iken ölmek, ama analiz için kabul edilir Hücreler.

4. Veri Analizi

1. Örneğin uygun bir yazılım uygulaması, bir elektronik tablo programı kullanılarak hücre izleme verilerini analiz edin.
   1. Bir öz-tasarlanmış elektronik tablo şablonu içine ham verileri (Şekil 2A) izleme hücreyi, kopyalayarak hücre izleme verilerini analiz edin. Temsil eden, "sayısal değerleri" toplamı çarpıntoplam mesafe bir hücre "um" içine "piksel" dönüştürmek için bir düzeltme faktörü ile göç etti.
   2. İki hücre göçü parametrelerini belirlemek: ve aktif hareket (Şekil 2C, 2D) zamanında (göç hızına eşdeğerdir) lokomotor aktivite.
   3. Hareketsiz hücreleri (yanlış-pozitif hücrelerin sayısını azaltmak için eşik değeri) 25 um den daha az göç eden hücrelerin belirlenmesi. "," Ile bu hücrelerin "sayısal değerlerini" değiştirin.
      NOT: parametre "lokomotor aktivite" (ya da göç oranı) iki kez puan (Şekil 2B) arasındaki taşındı izlenen hücre popülasyonunun hücrelerinin yüzdesini temsil eder. Bir "sayı" "," ise, hareket eden bir hücre olarak tanımlanan bir hareketsiz hücre olarak tanımlanmıştır. Parametre "aktif hareket zamanı" (zaman aktif) bir hücre yeniden göç etti toplam süre yüzdesini temsilgözlem dönemi (Şekil 2C) zaman dilimine Lation. Bir "sayısal değer" "," bir hücre hareket değil belirtirken, bir hücre, hareket ettiğini gösterir. Bu parametre, daha fazla hareket değil hücrelerin sayısını belirlemek için kullanılır.
2. Istatistiksel olarak anlamlı ve ekran hücre göç verileri hesaplayın.
   1. Mann-Whitney U testi kullanılarak hücreler (göç oranı) ortalama lokomotor aktivite istatistiksel olarak anlamlı hesaplayın. P-değeri
   2. Xy-diyagramı, Boxplot diyagram, ya da bir çubuk grafik diyagram olarak hücrelerin ortalama lokomotor aktivitesini gösterir. Bir çubuk grafik diyagram veya bir histogram gibi aktif hareket veya hız saati gibi tek bir hücre tabanlı veri, görüntüleme.
      NOT: seçilen tablosu programı uygulaması Boxplot grafik veya çubuk grafik grafik aracı içermiyorsa bir online arama uygun TU arıyor için yapılmalıdırtorials.

Sonuçlar

Zaman atlamalı video mikroskobu ve bilgisayar destekli izleme hücre ile birlikte, kullanılan 3D-kollajen matris, göç deneyi popülasyon bazlı parametre (örneğin, lokomotor aktivitesi ortalama) dahil olmak üzere çeşitli hücre göçü parametreleri ve tek bir hücre bazlı parametrelerinin belirlenmesine izin verir (örneğin, aktif hareket, hız, mesafe zaman göç). Elde edilen hücre izleme veri setleri, veri işleme ve veri sunumu bir örneği Şekil 2'de verilmektedi...

Tartışmalar

Göç yeteneği tümör hücrelerinin ⁴ bir özelliğidir. Primer tümörün ayırmak ve neredeyse tüm kanser hastalarının ölüm ana nedeni olan ikincil lezyonlar, tohum mümkün olmayacaktır çevreleyen bağ dokusu tümör hücrelerine yoluyla göç yeteneği olmadan. Çünkü bu ilişkinin pek çok çalışma kanser hücresi göçü üzerinde duruluyor. Bu çalışmaların amacı, verimli bir şekilde ve böylece zarar veya metastaz oluşumu yavaşlatan, tümör hücresi göçünü bloke yeni hedef mol...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leica DM IL inverted microscope	Leica, Wetzlar, Germany
Microscope stage heater	Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany
JVC C1431 video camera	JVC, Bad Vilbel, Germany
Axis 241Q video server	Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 Computer	Apple Macintosh
iMac	Apple Macintosh
FileMaker Pro	FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany
Multi-camera video surveillance software(Security Spy)	Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0	RunRev Ltd., Edinburgh, UK
Paraffin	Applichem GmbH, Darmstadt, Germany	A4264
Petroleum jelly	local drug store
Purecol (liquid collagen)	Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands		contains 2.9 - 3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)
10x MEM	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M0275
7.5% sodium bicarbonate solution	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	S8761
EGF	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	E9644
U73122	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	662035	dissolve first in CHCl3; reconstitute in DMSO just prior to use