세 가지 차원 콜라겐 매트릭스 내에서 세포의 이동 분석

요약

세포 이동은 암과 같은 상처 치료 및 면역 반응 및 병태 생리 학적 과정으로, 생리의 과다에 관여하는 생물학적 현상이다. 3D-콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석은 3 차원 형상의 생리적 환경 내에서 다른 세포 유형의 이동성 특성을 분석하는 다용도 공구이다.

초록

이주 할 수있는 능력은 다양한 세포 유형의 특징이며 배아 발생, 상처 치유, 및 면역 반응을 포함한 여러 생리 과정에서 중요한 역할을한다. 그러나, 세포 이동은 또한 확산 전이성을 시작하는 일차 종양으로부터 분리하는이 암세포를 활성화 암에서 중요한 메커니즘이다. 과거 내의 다양한 세포 이동 분석법은 다른 세포 유형의 이동성 동작을 분석하기 위해 개발되어왔다. 세포 locomotory 문제가 현저하게 이차원 (2D) 사이의 차이 및 3 차원 (3D) 환경 그것은 3D 환경 내에 포함 된 세포의 이동의 분석은 더 중요한 세포 이동을 수율 것이라고 가정 할 수 있으므로 데이터. 기재된 3D 콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석의 장점은 세포 외 매트릭스의 주요 구성 요소를 나타내는 콜라겐 섬유의 생리적 3D 네트워크 내에 내장된다는 점이다. 으로 인해시간 경과 비디오 현미경 리얼 셀 마이그레이션 프로 이동성 인자 또는 저해제에 응답하여 여러 이주 파라미터뿐만 아니라 변형의 결정을 허용 측정된다. 다양한 세포 유형의 세포 및 종양 세포를 림프구 / 백혈구를 포함한,이 기술을 이용하여 줄기를 분석 할 수있다. 마찬가지로, 또한, 셀의 클러스터 또는 타원체가 콜라겐으로 격자 셀 클러스터 / 타원체부터 단일 세포의 이주의 분석 콜라겐 매트릭스 수반 내에 내장 될 수있다. 우리는 3D 콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석은 생리와 같은 3D 환경에서 세포의 이동을 분석 할 수있는 다양한 방법이라고 결론 지었다.

서문

세포 융합 (개요는 ^{1, 2 참조)} 세포의 이동이 배아 발달, 상처 치유 및 면역 반응 (검토를 위해 ^{3 참조)을} 포함하여 생리 학적 과정의 과다에 참여하는 다른 생물학적 현상처럼. 그러나, 마이그레이션 할 수있는 기능은 종양 세포가 (검토를 위해 ^{3,4 참조)} 전이하기위한 전제 조건이기도하다.

세포 이동은, 복잡하고 다양한 리간드 (예, 사이토 카인, 케모카인, 성장 인자, 호르몬, 세포 외 매트릭스 성분) 수용체 (예를 들면, 수용체 티로신 키나제에 의해 개시 여러 신호 전달 경로의 작용에 의해 지시된다 아직 완전히 이해 과정 궁극적 있도록 지연 및 초점 접착 단지의 재 조립과 함께 액틴 세포 골격의 수반의 재구성을 일으키는 케모카인 수용체, 인테그린)의 상호 작용 ^{5 6 신호} 인테그린은 매개.

시험 관내 여러 생체 세포 이동 분석에서 세포의 이동을 분석하는 분석 실험 ^8-10, 입체감을 (치유 보이든 챔버 / 트랜스 웰 어 세이 ^7, 내찰 분석 / 상처를 포함한 과거 수십 년 동안 개발되어왔다 3D) 콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석 ^(11)뿐만 아니라의 intravital 영상 / 현미경 (검토를 위해 ^{12 참조).} 이러한 세포 이동 분석 각각의 장점과 단점, 예를 들어, 관련된 비용 및 장비의 필요성, 취급 또는 획득 한 데이터의 신뢰성을 가지고 있습니다.

보이든 챔버 / 트랜스 웰의 분석 및 스크래치 분석 / 상처 치유 분석 모두 체외 ^7-10에서 세포의 이동을 측정하기 쉽고, 저렴한 비용과 잘 발달 된 분석이다. 소위 상부 구획 ⁷ - 보이든 챔버에서 / 트랜스 웰 분석 세포를 삽입 함유 기공 (약 8 μm의 직경)의 상단에 씨앗을 품고있다. 선택, 삽입은 세포 외 m로 코팅 될 수있다ATRIX 성분, 예를 들면, 피브로넥틴, 콜라겐 등이 더 생리적 환경을 모방한다. 마찬가지로, 내피 세포함으로써 내피 세포 장벽 ^(13)을 흉내 낸, 삽입물의 상단에 성장 될 수있다. 이러한 성장 인자 및 케모카인과 같은 미디어 보충제, 은닉 하부 구획으로 정의 된 시간 간격 동안 기공 통과 한 이들 세포는, 세포 이동 (또는 혈관 외 유출)을 정량화 판독로서 사용된다.

스크래치 분석에 / 상처 치유 분석 세포를 플레이트에 접종하고 배양이 ^10로 성장하고 있습니다. 실험 설정 판의 의존도에서 피브로넥틴 등의 세포 외 기질 구성 요소와 사전에 코팅 될 수있다. 스크래치의 각 측면에서 세포 단층 단일 세포를 긁어 상처 스크래치 / 생성 한 후 / 상처 이에 의해 ¹⁰ 치유 / 충전 격차로 마이그레이션 할 수 있습니다. 스크래치 / 상처의 양면 사이의 거리가 결정된다시간 의존성과 셀 ^(10)의 활동에 대한 이동성 판독로서 사용된다. 그러나, 시간이 경과 비디오 현미경 및 단일 셀 ^(10)를 추적과 분석을 결합하는 것이 좋습니다 및 세포 이동 (또한 스크래치 / 상처의 충전 / 치유 될 수있는) 세포의 증식을 구별합니다.

그러나, 보이든 챔버 / 트랜스 웰 분석 및 분석 치유 스크래치 분석 / 상처 모두, 생리 같은 셀룰러 환경에 관하여 다소 불완전하다. 보이든 챔버 / 트랜스 웰 어 세이 세포 어 세이에 스크래치 세포를 치유 분석 / 상처 이차원 프레 코트 플라스틱 접시에 시딩 반면, 플라스틱 기공을 통해 이전한다. 마찬가지로, 잘 이동성 동작은 2 차원 환경에서 3D ⁽³⁾ 사이에 현저하게 다르다는 것을 인식한다. 예를 들어, 섬유 아세포의 입체 매트릭스 유착이 특징에 초점 및 섬유 성 유착 다를αvβ3 인테그린 α5β1과, paxillin, 다른 세포 골격 성분, 국소 유착 키나제 ^(14)의 티로신 인산화의 콘텐츠 - 차원에서의 기판. 마찬가지로, 3 차원 환경 내에 포함 된 세포는 또한 변경된 이동성 동작 ^(15)을 표시. 따라서보다 정확하게 세포의 이동을 분석하기 위해 마이그레이션 분석은 3D 생리 학적 또는 생리 학적 같은 환경 내에서 단일 세포의 이동을 측정 할 수 있도록 권장한다.

의 intravital 영상 / 현미경 3D 생리 학적 맥락에서 세포의 이동을 측정하기위한 황금 표준입니다. 이것은 지금까지 인해 가능하다, 그러나 또한 림프절 ¹⁷ 내의 혈관 외 유출 ¹⁶ 또는 림프구 거래 동안 종양 세포 및 내피 세포와 같은 다른 세포 유형 간의 상호 작용, 세포 외 기질 세포의 상호 작용에 속하지 않는 예컨대 2 광자 같은 향상된 형광 현미경 기법공 초점 레이저 주사 현미경, 형광 ^{​​단백질을} 발현 유도체 ^12,16,17 중요한 형광 염료 및 형질 전환 마우스의 변종의 사용. 또한,의 intravital 영상 / 현미경은 수동 및 자동 셀 ^{(18) 추적과} 결합 될 수있다. 그러나, 2 광자 공 초점 레이저 주사 현미경의 필요성뿐만 아니라 동물 (적절한 형질 전환 동물 모델)의 촬상의 intravital / 현미경 오히려 비용 집약적 기술이다.

보이든 챔버 / 트랜스 웰 분석 및 내찰 분석 / 상처 치유 분석의 한계를 극복하고 3D 콜라겐 매트릭스 이주 분석법 ^{11,19 개발} 된 3 차원 환경 내에서 다른 세포 유형의 마이그레이션을 분석하기. 이에 따라, 이주 세포 3D 콜라겐 섬유 네트워크, 생체에 더 비슷해이 상황에 포함된다. 공동으로, 시간 경과 비디오 현미경 실제 세포의 이동에 의한는 determi 수 있도록 측정여러 마이그레이션 매개 변수뿐만 아니라 프로 철새 요인 또는 억제제에 대한 응답에서의 변화의 나라. 다양한 세포 유형의 림프구 및 백혈구 ^11,20, 조혈 모 / ^21-24 전구 세포 및 종양 세포를 포함 ^5,25-29이 기술을 사용하여 분석 할 수있다. 단셀 외에도 클러스터 셀 또는 타원체는 ^{30,31 격자} 콜라겐으로 셀 클러스터 / 타원체부터 단일 세포의 이주의 분석 콜라겐 매트릭스 수반 내에 내장 될 수있다.

생체 내 상황에 가까운 결과에 항복 시험 관내 방법 -이 프로토콜은 3 차원 환경 내에서 다른 세포 유형의 이동성 동작을 분석 할 수있는 간단하지만 강력한 방법에 대한 개요를 제시한다.

프로토콜

마이그레이션 챔버의 1 준비

1. 혼합물까지 혼합하고 열이 녹아 : 파라핀 왁스 / 석유 젤리 (1 일)을 준비합니다. 페인트 브러시를 사용하고 파라핀 왁스 / 바셀린의 2-3 층 그릴 (1 : 1)도 1B-1D에 따라 유리 슬라이드의 중간에 섞는다.
   참고 : 우리는 일반적으로 유리 슬라이드를 사용하는 (76 X 26 X 1.0 ~ 1.5 mm (W / D / H))
2. 그리는 동안 응고를 방지하기 위해 유리 슬라이드에 급속히 용융 파라핀 왁스 / 석유 젤리 믹스를 적용. 파라핀 왁스 / 바셀린 층은 길이가 약 2-2.5 cm, 폭 0.3 ~ 0.5 cm이다 확인. 파라핀 왁스 / 바셀린 층의 두께는 약 0.1-0.15 cm이어야한다.
3. 응고 된 파라핀 왁스 / 석유 젤리 믹스에 커버 슬립을 추가하고 2-3 층 왁스 / 석유 젤리 믹스를 파라핀 (그림 1E, 1F)로 밀봉. 일반적인 세​​포의 이동 실험에 4-8 마이그레이션 챔버를 사용합니다. 장소 마이그레이션 챔버 전랙 위쪽 위치에 n.

콜라겐 서스펜션 셀 믹스의 2 준비

1. 수확 (예, 0.25 % 트립신 / EDTA)와 관심의 세포를 계산합니다. 완전한 태아 혈청 (FCS)를 포함하는 미디어, 항생제의 세포를 재현 탁하고 보충제를 추천했다. 4-8 1.5 ml의 반응 관 4-6 × ¹⁰⁴ 세포 (세포의 총 수가 분석 될 세포 유형에 따라)를 함유하는 20 ㎕의 세포 현탁액을 준비하고 완전한 미디어 50 μL까지 채운다.
   NOTE : 추가의 화합물 (예, 성장 인자, 케모카인, 억제제 등)를 세포 현탁액에 첨가된다. 세포 현탁액의 최종 부피가 50 μl를 초과하지 않도록 적절한 스톡 용액을 사용한다.
2. 네 세포 이동의 실험을 위해 452 ㎕의 최종 콜라겐 현탁액의 총량을 준비합니다. 50 ㎕의 10 배 MEM (pH가 5.1-5.5) 및 7.5 % 탄산 수​​소 나트륨 용액 27 μL (pH가 9.0-9.5 추가) 1.5 ml의 반응 관과 완전히 혼합한다. 강렬한 보라색 (pH가 9.0-9.5)에 노란색 - 오렌지에서 솔루션 컬러 턴을 준수하십시오. 10 배 MEM / 탄산 수​​소 나트륨 용액에 375 ㎕의 액체 콜라겐 현탁액을 첨가하고 잘 섞는다. 최종 콜라겐 현탁액의 pH가 약 7.5이어야한다 (자주색 색상으로 표시).
   주 : 7.5 % 중탄산 나트륨 용액의 pH를 확인한다. pH가 약 7.5 장소 인큐베이터에서 오픈 뚜껑 중탄산 나트륨 용액 인 경우 (37 ° C, 5 % CO ₂₎ CO _2로 포화 및 산도 (약 9.0-9.5)으로 증가한다. 콜라겐 현탁 세포 믹스의 pH는 콜라겐 네트워크의 안정성을 위해 중요하다. 너무 낮 으면 콜라겐 격자는 세포 이동 실험 동안에 붕괴한다.
   참고 :이 프로토콜의 경우, 소 뒷다리에서 액체 콜라겐 (pH가 1.9-2.2)를 사용 (2.9-3.3 ㎎ / ㎖ 콜라겐을, 95 % 콜라겐 타입 I, 5 %의 콜라겐 유형 IV). 추가하여 콜라겐 격자 제제 프로토콜의 예로이러한 돼지 나 쥐와 같은 다른 소스로부터 콜라겐 유형 I은 ^{(32, 33)에} 제시되어있다. 이 1.67 밀리그램 / 격자의 ML의 궁극적 인 콜라겐 농도를 변경하므로 사용 된 솔루션의 볼륨을 변경하지 마십시오. 더 높거나 낮은 콜라겐 농도 콜라겐 섬유의 밀도 및 세포 이동성 동작 ³⁴ 병용 그들 사이의 평균 거리에 영향을 미친다.
3. 50 ㎕의 세포 현탁액의 최종 콜라겐 현탁액 100 μl를 추가하고 thoroughly.The 최종 콜라겐 서스펜션 (1.67 ㎎ / ㎖ 콜라겐)을 혼합하면 약간 점성이다. 정확한 양 (100 μL)를 전송하려면, 세포 현탁액에 전송하기 전에 한번 상하 최종 콜라겐 용액을 피펫.
   NOTE : 콜라겐 현탁 세포 믹스 pH 값을 7.5로 변경했다 배 MEM / 중탄산 나트륨 용액과 결합되면 콜라겐 섬유가 바로 중합 시작.
4. 일의 최종 콜라겐 서스펜션 세포 믹스로 이동마이그레이션 챔버에 전자 반응 튜브. 부드럽게 동일하게 마이그레이션 챔버 (그림 1H)의 하단에있는 콜라겐 서스펜션 세포 믹스를 배포 마이그레이션 실을 누릅니다. 랙에 수직으로 마이그레이션 챔버를 놓고 30 분 동안 품어 (37 ° C, 5 % CO ₂₎ 콜라겐 섬유의 중합을 허용합니다.
5. 중합 된 콜라겐 격자 약간 혼탁하지만 여전히 밝은 자주색 색상되고 있음을 알 수 있습니다. 관심 보충제 완전 배지 또는 전체 매체와 마이그레이션 챔버를 입력하고 파라핀 왁스 / 석유 젤리 믹스 (그림 1I, 1J)와 마이그레이션 챔버를 밀봉하십시오.

3 녹화 및 세포 이동의 분석

이 섹션에서는 수동 셀 추적하여 시간 경과 비디오 현미경과 세포 이동의 분석에 의해 세포 이동의 기록에 대해 설명합니다.

1. 현미경 및 현미경 스테이지 난방에 전환터. 37 ° C까지 온도를 조정합니다. 10X 목표를 사용합니다. 현미경 이주 챔버를 배치하고 시야에 약 50 개 이상의 세포를 집중한다.
2. 멀티 카메라 비디오 감시 소프트웨어 응용 프로그램을 사용하여 저속 모드에서 기록 세포 이동. 예를 들어, 적절한 형식으로 세포의 이동 영화를 저장, "* .AVI"또는 "*의 .MOV". 이러한 세포 유형과 실험 조건으로서, 지원 정보가 데이터베이스에 포함 된 세포 이동 무비 파일을 링크.
   참고 : 우리는 시간 경과에 0.75 초 실시간으로 1 분 같다는 것을 의미 1:80의 시간 경과 계수를 사용하여 최대 2 시간 동안 림프구와 HSPCs를 기록하고 있습니다. 종양 세포는 느리게 이동하는 세포이며, 따라서 하나의 시간 경과 계수를 이용하여, 적어도 16 시간 동안 기록된다 : 1,800 (시간 경과에 0.5 초 실시간으로 15 분 동일하다).
3. ImageJ에 소프트웨어 플러그인과 같은 적절한 세포 추적 소프트웨어 응용 프로그램을 사용하여 세포의 이동 영화를 분석(개요 ^18에 제시되어있다). 편견 분석을 위해이 세포가 활성화 여부 철새인지 세포가 무작위로 지식없이 선택 될 것입니다 매우 중요하다.
   참고 : 수동 (핵에 위치한다) 마우스 커서 정확하게 세포 이동에 따라 실험 당 적어도 30 세포의 경로를 추적하는 자체 개발하는 소프트웨어 애플리케이션을 사용하고있다. 추적하는 동안, 추적 셀 XY 좌표가 자동 중고 저속 모드에 따라 결정된다. 종양 세포에 대한 XY 좌표가 (15 분 실시간 같음) 각 0.5 초를 결정하는 반면 림프구 / HSPCs의 XY 좌표는, (1 분 실시간 같음) 각각 825 초 결정된다.
4. 일반적인 세​​포의 이동 실험을 위해 세포 당 60 XY 좌표의 총을 결정합니다. 이는 종양 세포 림프구 / HSPCs 15 시간 실시간으로 1 시간 실시간으로 동일하다. A "는"셀 TW 사이에서 이동되지 않았 음을 나타냅니다오 시점, "수치"반면 "픽셀"셀이이 시점 (그림 2A) 사이에 이동 한의 거리를 나타냅니다.
   참고 : 수동 셀 추적 경험이 필요합니다. 특히 빠른 마이그레이션 세포 추적하기 어렵고 각 세포 유형 전시 보충 요인에 의해 유발 될 수있는 별개의 이동성 동작. 추적하는 동안 세포 분열 가지 경우에서 무작위로 추적을 계속하는 한 딸 셀을 선택합니다. 시력 필드에서 마이그레이션하거나 추적을 소홀히하지 않는 상태에서 사망하지만, 분석을 위해 고려 세포.

(4) 데이터 분석

1. 예를 들어, 적절한 소프트웨어 어플리케이션, 스프레드 시트 프로그램을 이용하여 세포의 추적 데이터를 분석한다.
   1. 자기 설계 스프레드 템플릿으로 원시 데이터 (도 2a)을 트래킹 셀을 복사하여 셀 트래킹 데이터를 분석한다. 대표, "수치"의 합을 곱총 거리는 셀은 "μM"로 "픽셀"을 변환하는 보정 계수 이주로했다.
   2. 이 세포 이동의 매개 변수를 결정하고 활동적인 운동 (그림 2C, 2D)의 시간 (이동 속도에 해당) locomotory 활동.
   3. 비 세포와 같은 이동 (거짓 양성 세포의 수를 줄이기 위해 임계 레벨)보다 낮은 25 μm의 마이그레이션 한 셀을 식별한다. ","이러한 세포의 "수치"를 교체합니다.
      참고 : 매개 변수 "locomotory 활동"(또는 이동 속도가)이 시점 (그림 2D) 사이에서 이동 한 추적 세포 인구의 세포의 비율을 나타냅니다. A "의 수치는" ","반면, 이동 셀로서 정의되어 움직이지 않는 세포로 정의된다. 파라미터 "활성 이동 시간"(활성화 시간)은 셀 재에 마이그레이션 총 시간의 비율을 나타내고관찰 기간 (도 2c)의 시간 프레임에 만큼은. "수치" ","세포가 이동되지 않았 음을 나타냅니다 반면 셀, 이동 한 것을 나타냅니다. 이 매개 변수는 더 이상 이동하지 않은 세포의 수를 결정하기 위해 사용된다.
2. 통계적 유의성 및 디스플레이 세포의 이동 데이터를 계산합니다.
   1. 맨 - 휘트니 U 시험을 사용하여 세포 (이동 속도)의 평균 locomotory 활성의 유의 한 차이를 계산한다. P-값 <상당한 0.05를 생각해 보자.
   2. XY-다이어그램, 상자 그림 다이어그램, 또는 막대 차트 다이어그램만큼 셀들의 평균 locomotory 활성을 보여준다. 막대 차트 다이어그램으로 또는 히스토그램과 같은 활성 이동이나 속도의 시간과 같은 단일 셀 기반의 데이터를, 표시합니다.
      참고 : 선택한 스프레드 시트 소프트웨어 응용 프로그램이 상자 그림 차트 또는 히스토그램 차트 도구가 포함되지 않은 경우 온라인 검색은 적합 TU를 찾고 수행해야torials.

결과

시간 경과 비디오 - 현미경 및 컴퓨터 보조 셀 추적과 함께 사용되는 3D-콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석은 모두 인구 기반 파라미터 (예 locomotory 활성을 의미한다)을 포함하는 다양한 세포 이동 파라미터 및 단일 셀 기반 파라미터들의 결정을 허용 (예를 들어, 활성 이동, 속도, 거리의 시간은 마이그레이션). 얻어진 세포 트래킹 데이터 세트, 데이터 처리 및 데이터 프리젠 테이션?...

토론

마이그레이션 할 수있는 능력은 종양 세포 ^4의 특징이다. 기본 종양에서 분리하고 거의 모든 암 환자의 사망의 주요 원인이되는 보조 병변을 배정 할 수 없습니다 주위의 결합 조직 종양 세포를 통해 마이그레이션 할 수있는 기능없이. 이 때문에 관계의 많은 연구는 암 세포의 이동에 초점을 맞추고있다. 이 연구의 목적은 효율적으로함으로써 손상 또는 전이 형성을 늦추고, 종양 세포의 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leica DM IL inverted microscope	Leica, Wetzlar, Germany
Microscope stage heater	Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany
JVC C1431 video camera	JVC, Bad Vilbel, Germany
Axis 241Q video server	Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 Computer	Apple Macintosh
iMac	Apple Macintosh
FileMaker Pro	FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany
Multi-camera video surveillance software(Security Spy)	Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0	RunRev Ltd., Edinburgh, UK
Paraffin	Applichem GmbH, Darmstadt, Germany	A4264
Petroleum jelly	local drug store
Purecol (liquid collagen)	Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands		contains 2.9 - 3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)
10x MEM	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M0275
7.5% sodium bicarbonate solution	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	S8761
EGF	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	E9644
U73122	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	662035	dissolve first in CHCl3; reconstitute in DMSO just prior to use