Análise da migração celular dentro de uma matriz de colagénio tridimensional

Resumo

A migração celular é um fenómeno biológico que está envolvido numa variedade de parâmetros fisiológicos, tais como a cicatrização de feridas e de respostas imunes, e processos patofisiológicos, como o cancro. O ensaio de migração matriz 3D-colagénio é um instrumento versátil para analisar as propriedades migratórias de diferentes tipos de células dentro de um ambiente fisiológico semelhante a 3D.

Resumo

A capacidade de migrar é uma característica de vários tipos celulares e desempenha um papel crucial em diversos processos fisiológicos, incluindo o desenvolvimento embrionário, a cicatrização de feridas, e respostas imunes. Contudo, a migração celular é também um mecanismo de chave no cancro permitindo estas células cancerosas para separar a partir do tumor primário para iniciar a propagação metastática. Nos últimos anos vários ensaios de migração de células foram desenvolvidas para analisar o comportamento migratório das diferentes tipos de células. Porque o comportamento locomotor de células difere marcadamente entre uma a duas dimensões (2D) e do ambiente tridimensional (3D), pode presumir-se que a análise da migração de células que são incorporados dentro de um ambiente 3D produziria na migração de células mais significativa dados. A vantagem do ensaio de migração de matriz de colagénio 3D é descrito que as células estão embutidos dentro de uma rede 3D fisiológica de fibras de colagénio que representam a principal componente da matriz extracelular. Devidotime-lapse microscopia vídeo migração celular real é medido permitindo a determinação de vários parâmetros de migração, bem como suas alterações em resposta a fatores ou inibidores da pro-migratórias. Vários tipos de células podem ser analisadas usando esta técnica, incluindo linfócitos / leucócitos, as células estaminais e as células tumorais. Da mesma forma, também grupos de células ou esferóides poderia ser incorporado dentro da matriz de colágeno concomitante com a análise da emigração de células individuais do grupo de células / esferóide na malha de colágeno. Conclui-se que o ensaio de migração 3D matriz de colagénio é um método versátil para analisar a migração de células dentro de um ambiente fisiológico 3D-like.

Introdução

Como a fusão celular (para uma síntese ver ^1,2) migração de células de um outro fenómeno biológico que está envolvido numa variedade de processos fisiológicos, incluindo o desenvolvimento embrionário, a cicatrização de feridas e respostas imunes (para revisão ver ^3). No entanto, a capacidade de migrar também é um pré-requisito para as células tumorais de metástases (para revisão ver ^3,4).

A migração celular é um complexo, não processo ainda totalmente compreendido que é dirigido pela interação de diversas vias de transdução de sinal iniciada por vários ligante (por exemplo, citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento, hormônios, componentes da matriz extracelular) do receptor (por exemplo, receptores tirosina-quinase, receptores de quimiocinas, integrinas) interações ^cinco causando finalmente a reorganização do citoesqueleto de actina concomitante com mento e montagem de complexos de adesão focal e integrina mediada sinalização ^6.

Para analisar a migração de células de vários in vitro e in vivo, os ensaios de migração de células foram desenvolvidas nas últimas décadas, incluindo o ensaio de câmara de Boyden / transwell ^7, zero ensaio / ferida ensaio ^8-10, tridimensional (cura 3D) ensaio de migração de ¹¹ matriz de colagénio, bem como intravital imagiologia / microscopia (para revisão, ver ^12). Cada um destes ensaios de migração celular tem prós e contras, por exemplo, em matéria de custos e necessidade de equipamentos, manipulação e confiabilidade dos dados obtidos.

Tanto a câmara de ensaio Boyden / transwell e o ensaio de ensaio de risco / a cicatrização de feridas são fácil, baixo custo e ensaios bem desenvolvidos para medir a migração de células in vitro ^7-10. Na câmara de Boyden / transpo� células de ensaio são semeadas em cima de um inserto contendo poros (cerca de 8 um de diâmetro) - o chamado compartimento superior ^7. Opcional, a pastilha pode ser revestida com m extracelularAtrix componentes, por exemplo, fibronectina, colagénio, etc, para simular um ambiente mais fisiológico. Da mesma forma, as células endoteliais podem ser cultivadas no topo do inserto, imitando assim uma barreira de células endoteliais ^13. Aquelas células que passaram através dos poros durante um intervalo de tempo definido para o compartimento inferior que alberga os meios e suplementos, tais como factores de crescimento e quimiocinas, são utilizados como um limite ler para quantificar a migração de células (ou extravasamento).

No ensaio de risco / células de ensaio de cicatrização de feridas são semeadas em placas e são cultivadas até à confluência ^{de 10.} Em dependência das placas de ajuste experimentais poderia ser pré-revestido com componentes da matriz extracelular, como a fibronectina. Depois de criar um risco / ferida por raspagem das células em monocamada de células individuais a partir de cada lado da raiz / ferida pode migrar para dentro do fosso, enchendo desse modo / ^curando-10. A distância entre os dois lados do Scratch / feridas é determinadaem dependência do tempo e é utilizado como um limite para ler a actividade migratória das células ^10. No entanto, para discriminar entre a proliferação de células (que também pode resultar em enchimento / cura do arranhão / ferida) e a migração das células, recomenda-se combinar o ensaio com videomicroscopia de lapso de tempo e de uma única célula de rastreamento ^10.

No entanto, tanto o ensaio Boyden câmara / transwell e zero ensaio / ferida teste de cura, são bastante imperfeito, relativo a um ambiente celular fisiológica semelhante. Na câmara de Boyden / células de ensaio Transwell ter para migrar através de um poro de plástico, enquanto que no ensaio de risco / ensaio de cicatrização da ferida células são semeadas num prato de plástico pré-revestidos bidimensional. Do mesmo modo, é bem reconhecido que o comportamento migratório difere marcadamente entre um ambiente bidimensional e 3D ^3. Por exemplo, aderências tridimensional de matriz de fibroblastos diferem das adesões focais e fibrilares caracterizados em doissubstratos dimensionais no seu conteúdo de α5β1 e integrinas aVp3, paxilina, outros componentes do citoesqueleto, e fosforilação de tirosina-quinase de adesão focal ^14. Da mesma forma, as células embutidas dentro de um ambiente 3D também exibido um comportamento migratório alterado ^15. Assim, para analisar a migração de células de forma mais precisa de um ensaio de migração é recomendado que permite medir a migração de células individuais dentro de um ambiente fisiológico ou fisiológico semelhante a 3D.

Imaging / microscopia intravital é o padrão-ouro para medir a migração de células dentro de um contexto fisiológico 3D. Isto não só pertencem a interacções célula-matriz extracelular, mas também às interacções entre os diferentes tipos de células, tais como células de tumor e células endoteliais durante o extravasamento ¹⁶ ou o tráfico de linfócitos no nódulo linfático ^17, o qual, até à data, é possível devido à melhoria das técnicas de microscopia de fluorescência, tais como 2-fótonsA microscopia confocal de varrimento laser, o uso de corantes fluorescentes vitais e estirpes de ratos transgénicos que expressam proteínas fluorescentes derivados ^12,16,17. Além disso, a imagem / microscopia intravital poderia ser combinada com rastreamento de células manual e automatizado ^18. No entanto, por causa da necessidade de um microscópio confocal de varrimento laser 2-fotão, bem como os animais (e em modelos animais transgénicos adequados) imagiologia / microscopia intravital é uma técnica bastante dispendioso.

Para ultrapassar as limitações da câmara de ensaio Boyden / transwell e o ensaio de cicatrização zero ensaio / ferida e para analisar a migração de diferentes tipos de células dentro de um ambiente de 3D ​​do ensaio de migração de matriz de colagénio 3D foi desenvolvido ^11,19. Desse modo, as células migram estão embutidos dentro de uma rede de fibras colágenas 3D, o que mais se assemelha à situação in vivo. Conjuntamente, devido ao lapso de tempo microscopia vídeo migração celular real é medido permitindo a determinação de vários parâmetros de migração, bem como suas alterações, em resposta a fatores ou inibidores de pro-migratórias. Vários tipos de células podem ser analisados ​​utilizando esta técnica, incluindo linfócitos e leucócitos ^11,20, tronco hematopoiéticas / progenitoras ^21-24 e células tumorais ^5,25-29. Além de células individuais também célula ou agregados esferóides poderia ser incorporado no interior da matriz de colagénio com concomitante análise da emigração de células isoladas a partir do agrupamento de células / esférica para o colagénio treliça ^30,31.

Este protocolo apresenta uma visão geral sobre uma técnica simples, mas poderosa para analisar o comportamento migratório de diferentes tipos de células dentro de um ambiente 3D - um método in vitro resultando em resultados que estão perto a situação in vivo.

Protocolo

1 Preparação das Câmaras de Migração

1. Prepara-se uma geleia de parafina / petróleo (1: 1) mistura e aquecimento até que a mistura tenha derretido. Usando um pincel e desenhar 2-3 camadas da geleia de parafina / petróleo (1: 1) misturar no meio da placa de vidro, em conformidade com as Figuras 1B-1D.
   NOTA: Nós estamos usando lâminas de vidro comum (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (W / D / H))
2. Aplicar a mistura de geléia de cera de parafina / petróleo derreteu rapidamente sobre a lâmina de vidro para evitar a solidificação enquanto desenha. Certifique-se a camada de geléia de cera de parafina / petróleo é de cerca de 2-2,5 cm de comprimento e 0,3-0,5 cm de largura. A espessura da camada de geleia de parafina / petróleo deve ser de cerca de 0,1-0,15 cm.
3. Adicionar uma lamela para a cera de parafina solidificada / petróleo mix geléia e selá-lo com duas a três camadas de parafina mix geléia de cera / petróleo (Figuras 1E, 1F). Use 4-8 câmaras de migração para uma experiência de migração celular comum. Câmaras lugar de migração iN posição vertical em um rack.

2 Preparação do Colágeno Suspensão Mix celular

1. Colheita (por exemplo, com 0,25% de tripsina / EDTA) e contagem de células de interesse. Ressuspender as células em meio completo contendo soro fetal de vitelo (FCS), antibióticos e os suplementos recomendados. Prepare 4-8 1,5 ml tubos de reacção e 20 ul de suspensão de células contendo 4-6 x 10 ⁴ células (o número total de células depende do tipo de célula a ser analisada), e encher até 50 ul com meio completo.
   NOTA: Outros compostos (por exemplo, factores de crescimento, quimiocinas, inibidores, etc) são adicionados à suspensão de células. Utilizar soluções de reserva apropriadas de tal modo que o volume final da suspensão de células não exceda 50 ul.
2. Prepare um montante total de 452 suspensão de colagénio último ul por quatro experimentos de migração celular. Adicionar 50 ul de 10x MEM (pH 5,1-5,5) e 27 ul de solução de bicarbonato de sódio a 7,5% (pH de 9,0-9,5) Para um tubo de ensaio 1,5 ml e misture bem. Observe a cor da solução passar de amarelo-laranja para roxo intenso (pH 9,0-9,5). Adicionar suspensão de colagénio 375 mL de líquido para o / solução de bicarbonato de sódio 10x MEM e misture bem. O pH da suspensão de colagénio final deverá ser de cerca de 7,5 (indicado por uma cor púrpura clara).
   Nota: Verifique o pH da solução de bicarbonato de sódio a 7,5%. Se o pH é cerca de 7,5 lugar a uma solução de bicarbonato de sódio, com uma tampa aberta de uma incubadora (37 ° C, 5% CO ₂₎ para ser saturada com CO ₂ e aumentar o pH (cerca de 9,0-9,5). O pH da mistura de células em suspensão de colagénio é essencial para a estabilidade da rede de colagénio. Se ele for muito baixa, o colagénio reticulado entrará em colapso durante a experiência de migração de células.
   NOTA: Para este protocolo, utilize o colágeno líquido (pH 1,9-2,2) da traseira bovina (2,9-3,3 mg / ml de colágeno e 95% de colágeno tipo I, 5% de colágeno tipo IV). Exemplos de protocolos de preparação adicional de colagénio reticulado usandocolágeno tipo I a partir de outras fontes, tais como suínos ou rato, são dadas em ^32,33. Não mude os volumes das soluções utilizadas como isso irá alterar a concentração final de colagénio de 1,67 mg / ml do látice. A concentração de colagénio mais elevado ou mais baixo tem um impacto sobre a densidade de fibras de colagénio e a distância média entre eles concomitante com as células de comportamento migratório ^34.
3. Adicionar 100 ul da suspensão de colagénio final para 50 mL de suspensão de células e misturar thoroughly.The suspensão de colagénio final (1,67 mg / ml de colagénio) é ligeiramente viscoso. Para transferir o valor correcto (100 ul), pipetar a solução de colagénio final, uma vez para cima e para baixo, antes de transferi-lo para a suspensão de células.
   NOTA: Uma vez que a mistura de células em suspensão de colágeno é combinado com a solução de bicarbonato de sódio / 10x MEM eo valor de pH foi alterado para 7,5 fibras de colágeno começar imediatamente a polimerização.
4. Transferir a mistura de células em suspensão de colagénio final the tubos de reação para as câmaras de migração. Bater levemente na câmara de migração para distribuir igualmente a mistura de células em suspensão de colagénio na parte inferior da câmara de migração (Figura 1H). Colocar as câmaras de migração em posição vertical numa prateleira e incubar durante cerca de 30 min (37 ° C, 5% CO ₂₎ para permitir que a polimerização das fibras de colagénio.
5. Observe que a estrutura de colágeno polimerizado é um pouco turva, mas continua a ser luz de cor roxa. Encha as câmaras de migração com meio completo ou médio completo com suplementos de interesse e selar a câmara de migração com a mistura de geléia de cera de parafina / petróleo (Figuras 1I, 1J).

3. registro e análise da migração celular

Esta seção descreve a gravação da migração de células por microscopia de lapso de tempo vídeo e análise da migração celular por rastreamento de células manual.

1. Ligue o microscópio eo hea estágio do microscópioter. Ajustar a temperatura para 37 ° C. Use uma objetiva de 10X. Coloque câmara de migração sob um microscópio e concentrar aproximadamente 50 ou mais células no campo de visão.
2. Migração celular Grave no modo de lapso de tempo usando um aplicativo de software de vigilância de vídeo multi-câmera. Salve filmes de migração celular em um formato apropriado, por exemplo, "* avi" ou "* mov". Vincular os arquivos de filmes de migração celular para um banco de dados contendo informações de apoio, tais como tipo de célula e condições experimentais.
   NOTA: Estamos gravando linfócitos e hspCs por até 2 horas usando um fator de lapso de tempo de 1:80, o que significa que 0,75 s em time-lapse é igual a 1 min em tempo real. As células tumorais são células de movimento lento e são, assim, registada por pelo menos 16 horas usando um factor de lapso de tempo de 1: 1.800 (0,5 seg no lapso de tempo é igual a 15 minutos em tempo real).
3. Analisar filmes de migração celular, usando um aplicativo de software de rastreamento de células apropriado, como plugins de software ImageJ(Uma visão geral é dado em ^18). Para uma análise imparcial, é de crucial importância que as células serão selecionados aleatoriamente, sem o conhecimento se as células são migratórias ativa ou não.
   NOTA: Nós estamos usando um aplicativo de software de auto-desenvolvimento para controlar manualmente os caminhos de pelo menos 30 células por experimento, seguindo as células de movimento com precisão com o cursor do mouse (que está posicionada para o núcleo). Durante a perseguição, os xy coordenadas das células controladas são automaticamente determinados de acordo com o modo de lapso de tempo utilizado. Para linfócitos / hspCs xy coordenadas são determinadas cada 0,75 segundos (igual a 1 min em tempo real), enquanto que para as células tumorais XY coordenadas são determinadas cada 0,5 segundos (igual a 15 min em tempo real).
4. Determine um total de 60 xy coordenadas por célula para uma experiência de migração celular comum. Este é igual a 1 hora em tempo real para os linfócitos / hspCs e 15 h de tempo real para as células tumorais. Um "," uma célula indica que não se moveu entre two pontos de tempo, ao passo que um "valor numérico" indica a distância em "pixels" de uma célula se tenha mudado entre dois pontos de tempo (Figura 2A).
   NOTA: rastreamento de celular manual requer experiência. Células que migram rápido Particularmente são difíceis de detectar e de cada tipo de célula apresentam um comportamento migratório distinto que pode ser desencadeada por fatores suplementados. Em caso de divisão celular ao seguir, escolha aleatoriamente uma célula filha para o acompanhamento contínuo. As células que migram para fora do campo de visão ou morrem enquanto o rastreamento não são negligenciados, mas que foram considerados para a análise.

Análise 4. Dados

1. Analisar os dados de rastreamento de celular, usando um aplicativo de software adequado, por exemplo, um programa de planilha.
   1. Analisar os dados de rastreamento de celular, copiando o rastreamento de dados brutos (Figura 2A) celular, em um modelo de planilha auto-concebidos. Multiplique soma dos "valores numéricos", representandoa distância total de uma célula migrou com um fator de correção para converter "pixel" em "? M".
   2. Determinar dois parâmetros de migração de células: A actividade locomotora (que é equivalente à taxa de migração) e tempo de movimento activo (Figuras 2C, 2D).
   3. Identificar as células que migraram menor do que 25 um (nível limiar para reduzir o número de células de falsos-positivos) como células que não se mover. "Substituir" valores numéricos destas células com ",".
      NOTA: O parâmetro (ou taxa de migração) "atividade locomotora" representa a porcentagem de células da população de células controladas que se mudaram entre dois pontos no tempo (Figura 2D). Um "valor numérico" é definida como uma célula em movimento, ao passo que "," é definido como uma célula não-móveis. O parâmetro "tempo de movimento ativo" (ativa) representa a porcentagem do tempo total de uma célula migrou em relação ao período de tempo do período de observação (Figura 2C). Um "valor numérico" indica que uma célula se desloca, ao passo que "," indica que a célula não se moveu. Este parâmetro é mais utilizado para determinar o número de células que não se tenha mudado.
2. Calcule significância estatística e de visualização de dados de migração celular.
   1. Calcula significância estatística da actividade locomotora significativo da células (taxa de migração) usando o teste de Mann-Whitney. Considere p <0,05 como significativo.
   2. Mostrar a atividade locomotora médio de células como xy-diagrama, BoxPlot diagrama, ou como um diagrama de gráfico de barras. Mostrar os dados baseados em células individuais, tais como o tempo de movimento ou de velocidade ativo, como um diagrama de gráfico de barras ou como um histograma.
      NOTA: Se o aplicativo de planilha escolhido não contém uma tabela ou gráfico histograma ferramenta BoxPlot uma pesquisa on-line deve ser realizada para procurar tu adequadotorials.

Resultados

O ensaio de migração matriz 3D-colagénio utilizado combinado com lapso de tempo de video-microscopia de rastreamento e de células assistida por computador permite a determinação de vários parâmetros, incluindo a migração de células, tanto do parâmetro de base populacional (por exemplo, a média de actividade locomotora) e parâmetros baseados em células individuais (por exemplo, tempo de movimento ativo, velocidade, distância migrados). Um exemplo dos conjuntos de dados de rastreio de cé...

Discussão

A capacidade de migrar é uma característica de células tumorais ^4. Sem a capacidade de separar a partir do tumor primário e migração das células tumorais através de tecidos conjuntivos circundantes não irá ser capaz de propagar lesões secundárias, que são a principal causa de morte de quase todos os pacientes com cancro. Devido a esta relação muitos estudos estão se concentrando na migração de células cancerosas. O objectivo destes estudos é a identificação de novas moléculas de alvo e ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leica DM IL inverted microscope	Leica, Wetzlar, Germany
Microscope stage heater	Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany
JVC C1431 video camera	JVC, Bad Vilbel, Germany
Axis 241Q video server	Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 Computer	Apple Macintosh
iMac	Apple Macintosh
FileMaker Pro	FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany
Multi-camera video surveillance software(Security Spy)	Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0	RunRev Ltd., Edinburgh, UK
Paraffin	Applichem GmbH, Darmstadt, Germany	A4264
Petroleum jelly	local drug store
Purecol (liquid collagen)	Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands		contains 2.9 - 3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)
10x MEM	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M0275
7.5% sodium bicarbonate solution	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	S8761
EGF	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	E9644
U73122	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	662035	dissolve first in CHCl3; reconstitute in DMSO just prior to use