Analyse der Zellmigration in eine dreidimensionale Kollagenmatrix

Zusammenfassung

Die Zellmigration ist ein biologisches Phänomen, das in einer Vielzahl von physiologischen beteiligt ist, wie der Wundheilung und Immunreaktionen und pathophysiologischen Prozessen, wie Krebs. Die 3D-Kollagen-Matrix Migrationstest ist ein vielseitiges Werkzeug, um die Migrationseigenschaften der verschiedenen Zelltypen innerhalb in einer 3D-physiologischen Umgebung wie zu analysieren.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit zur Migration ist ein Markenzeichen von verschiedenen Zelltypen spielt eine entscheidende Rolle bei verschiedenen physiologischen Prozessen, einschließlich der embryonalen Entwicklung, Wundheilung, und Immunantworten. Allerdings ist die Zellmigration auch ein wichtiger Mechanismus in der Krebs Aktivierung dieser Krebszellen aus dem Primärtumor lösen metastasiertem beginnen die Verbreitung. In den letzten Jahren wurden verschiedene Zellmigrationsassays wurden entwickelt, um das Migrationsverhalten der verschiedenen Zelltypen zu analysieren. Weil das Bewegungsverhalten von Zellen unterscheidet sich deutlich zwischen einem zweidimensionalen (2D) und dreidimensionale (3D) Umgebung angenommen werden kann, dass die Analyse der Migration von Zellen, die in einer 3D-Umgebung eingebettet wäre eine signifikante Zellmigration ergeben werden in Daten. Der Vorteil der beschriebenen 3D Kollagenmatrix-Migrationstest ist, dass Zellen in einer physiologischen 3D-Netzwerk von Kollagenfasern, die die Hauptkomponente der extrazellulären Matrix. DurchZeitraffer-Videomikroskopie echten Zellmigration wird gemessen, die die Bestimmung von mehreren Parametern Migration sowie deren Veränderungen in Reaktion auf pro-Migrationsfaktoren oder Inhibitoren. Verschiedene Zelltypen können unter Verwendung dieser Technik, einschließlich Lymphozyten / Leukozyten, Stammzellen und Tumorzellen untersucht werden. Ebenso könnte auch Zellhaufen oder Sphäroiden innerhalb der Kollagenmatrix gleichzeitig mit Analyse der Abwanderung von Einzelzellen aus dem Zellverband / Sphäroid in die Kollagengitter eingebettet werden. Wir schließen daraus, dass die 3D-Kollagen-Matrix-Migrationstest ist ein vielseitiges Verfahren, um die Migration von Zellen in einem physiologischen artigen 3D-Umgebung zu analysieren.

Einleitung

Wie Zellfusion (für eine Übersicht siehe ^1,2) Zellmigration ist ein weiteres biologisches Phänomen, das in einer Vielzahl von physiologischen Prozessen einschließlich der Embryonalentwicklung, Wundheilung und Immunreaktionen (für eine Übersicht siehe ³⁾ beteiligt ist. Jedoch ist die Fähigkeit zur Migration auch eine Voraussetzung für die Tumorzellen zu metastasieren (für einen Überblick siehe ^3,4).

Die Zellmigration ist ein komplexer, noch nicht vollständig verstanden Prozess, der durch das Zusammenspiel mehrerer Signaltransduktionswege durch verschiedene Liganden (zB Cytokine, Chemokine, Wachstumsfaktoren, Hormone, extrazelluläre Matrixkomponenten)-Rezeptor (zB Rezeptor-Tyrosin-Kinasen initiiert gerichtet ist, Chemokin-Rezeptoren, Integrine) Wechselwirkungen ⁵ wodurch letztlich die Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts gleichzeitig mit De- und Remontage von focal adhesion Komplexe und Integrin-vermittelten Signal ^6.

Um die Zellmigration mehrere in-vitro-und in vivo-Zellmigrationsassays analysiert haben in den vergangenen Jahrzehnten entwickelt worden, einschließlich der Boyden-Kammer / Transwell-Assay ^7, Kratztest / Wundheilungs Test ^8-10, dreidimensionale ( 3D) Kollagen-Matrix Migrationsassay ¹¹ sowie Intravital Imaging / Mikroskopie (für eine Übersicht siehe ^12). Jeder dieser Zellmigrationsassays hat Vor-und Nachteile, zB über Kosten und Notwendigkeit der Ausrüstung, Handhabung oder Zuverlässigkeit der gewonnenen Daten.

Sowohl der Boyden-Kammer / Transwell-Assay und die Kratztest / Wundheilungstest sind einfach, preiswert und gut entwickelten Assays zur Zellmigration in vitro ^7-10 messen. Der so genannten oberen Fach ⁷ - in der Boyden-Kammer / Transwell-Assay Zellen sind auf der Oberseite eines Einsatzes enthalten Poren (etwa 8 um Durchmesser) ausgesät. Optional könnte der Einsatz mit extrazellulären m beschichtet werdenatrix Komponenten, zB Fibronektin, Kollagen etc. nachahmen eine physiologische Umgebung. Ebenso könnte Endothelzellen auf der Oberseite des Einsatzes gehalten werden, wodurch eine endotheliale Zellbarriere ¹³ nachahmt. Jene Zellen, die durch die Poren in einem definierten Zeitintervall in das untere Kompartiment beherbergen, Medien und Ergänzungen, wie Wachstumsfaktoren und Chemokine durchlaufen haben, werden als Auslese verwendet, um die Zellmigration (oder Extravasation) quantifizieren.

Der Kratztest / Wundheilungs Assay Zellen werden in Platten ausgesät und bis zur Konfluenz ¹⁰ gewachsen. In Abhängigkeit von den experimentellen Aufbau konnte Platten mit extrazellulären Matrixkomponenten, wie Fibronectin vorbeschichtet werden. Nach dem Erstellen eines Kratzer / durch Abkratzen der Zellmonoschicht einzelne Zellen von jeder Seite der Kratzwund / Wunde kann in die Lücke wandern, wodurch Füllen / Heil es ^10. Der Abstand zwischen den beiden Seiten der Ritz / Wunden bestimmtin Abhängigkeit von der Zeit und als Auslesung der Migrationsaktivität der Zellen ¹⁰ verwendet. Jedoch zwischen Zellproliferation und Zellmigration zu unterscheiden (die auch bei der Abfüllung / Heilung der Kratzer / Wunde führen kann), wird empfohlen, den Test mit Zeitraffer-Videomikroskopie und Einzelzellverfolgung ¹⁰ zu kombinieren.

Jedoch sowohl die Boyden-Kammer / Transwell-Assay und Kratztest / Wundheilungs Assay, sind eher unvollkommen über physiologische artigen zellulären Umgebung. In der Boyden-Kammer / Transwell-Testzellen haben, um durch eine Kunststoffporen wandern, während der Kratztest / Wundheilungs Assay Zellen werden auf einer zweidimensionalen vorbeschichtete Kunststoff-Platte ausgesät. Ebenso ist es allgemein bekannt, dass das Migrationsverhalten unterscheidet sich deutlich zwischen einer zweidimensionalen und 3D Umgebung ^3. Zum Beispiel dreidimensionale Matrix Verwachsungen von Fibroblasten unterscheiden Brenn und fibrilläre Adhäsionen gekennzeichnet, daß auf beidendimensionalen Substraten in ihrem Inhalt und α5β1 avb3 Integrine, Paxillin, anderen Zytoskelett-Komponenten und Tyrosin-Phosphorylierung von Focal Adhesion Kinase ^14. Ebenso angezeigt Zellen innerhalb einer 3D-Umgebung eingebettet auch ein verändertes Zugverhalten ^15. Somit Zellmigration genauer analysieren Migrationsassay wird empfohlen ermöglicht die Migration der einzelnen Zellen in einem 3D-physiologische oder physiologisch-ähnliche Umgebung zu messen.

Intravital Imaging / Mikroskopie ist die Gold-Standard für die Messung der Zellmigration in einer 3D-physiologischen Kontext. Dies gilt nicht nur gehören extrazelluläre Matrix-Zell-Wechselwirkungen, sondern auch die Interaktionen zwischen verschiedenen Zelltypen, wie beispielsweise Tumorzellen und Endothelzellen während Extravasation ¹⁶ oder Lymphozyten-innerhalb des Lymphknotens ^17, welche bis zum heutigen Tag ist möglich durch verbesserte Fluoreszenzmikroskopietechniken, wie beispielsweise 2-PhotonenKonfokale Laser-Scanning-Mikroskopie wird die Verwendung von lebensFluoreszenzFarbstoffe und transgenen Mausstämme, die fluoreszierende Proteine ​​Derivate ^12,16,17. Zusätzlich könnten Intravital Imaging / Mikroskopie mit manuellen und automatisierten Zellverfolgung ¹⁸ kombiniert werden. Wegen der Notwendigkeit einer 2-Photonen konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie sowie Tiere (und entsprechende transgene Tiermodelle) intravitalen Imaging / Mikroskopie ist jedoch ein recht kostenintensiven Technik.

Um die Einschränkungen der Boyden-Kammer / Transwell-Assay und der Kratztest / Wundheilungs Assay zu überwinden und die Migration von verschiedenen Zelltypen innerhalb einer 3D-Umgebung die 3D-Kollagen-Matrix-Migration-Assay wurde entwickelt ^11,19 analysieren. Dadurch wandern Zellen in einer 3D Kollagenfasernetzwerk, das mehrere ähnelt der Situation in vivo eingebettet. Gemeinsam, durch Zeitraffer-Videomikroskopie echten Zellmigration gemessen werden, wodurch die BestimNation von mehreren Migrationsparameter sowie deren Veränderungen in Reaktion auf pro-Migrationsfaktoren oder Inhibitoren. Verschiedene Zelltypen können unter Verwendung dieser Technik, einschließlich Lymphozyten und Leukozyten ^11,20, hämatopoetische Stammzellen / Vorläuferzellen ^21-24, und Tumorzellen ^5,25-29 analysiert werden. Neben den einzelnen Zellen auch Cluster Zelle oder Sphäroiden konnte innerhalb der Kollagenmatrix gleichzeitig mit Analyse der Auswanderung von Einzelzellen aus dem Zellverband / Sphäroid in die Kollagen eingebettet Gitter ^30,31 werden.

Dieses Protokoll bietet einen Überblick über eine einfache, aber leistungsfähige Technik, um das Migrationsverhalten von verschiedenen Zelltypen innerhalb einer 3D-Umgebung zu analysieren - ein in vitro-Verfahren ergibt in den Ergebnissen, die in der Nähe der in vivo Situation.

Protokoll

1. Vorbereitung der Migration Chambers

1. Bereiten Sie eine Paraffinwachs / Vaseline (1: 1)-Mix und Hitze, bis die Mischung geschmolzen ist. Mit Hilfe eines Pinsel und ziehen 2-3 Schichten der Paraffinwachs / Vaseline (1: 1) mischen in der Mitte der Glasträger in Übereinstimmung mit den 1B-1D.
   HINWEIS: Wir sind mit gemeinsamen Glasobjektträger (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (B / T / H))
2. Gelten die geschmolzene Paraffin / Vaseline Mischung schnell auf dem Objektträger zu vermeiden, um eine Verfestigung während des Zeichnens. Sicherstellen, dass das Paraffinwachs / Vaseline-Schicht ist etwa 2-2,5 cm lang und 0,3-0,5 cm in der Breite. Die Dicke der Paraffinwachs / Vaseline-Schicht sollte etwa 0,1-0,15 cm.
3. Fügen Sie ein Deckglas auf dem erstarrten Paraffin / Vaseline-Mix und verschließen Sie diese mit zwei zu drei Lagen Paraffinwachs / Vaseline-Mix (1E, 1F). Verwenden Sie 4-8 Migrationskammern für eine gemeinsame Zellmigration Experiment. Ort Migrationskammern in eine aufrechte Position in einem Rack.

2. Herstellung der Kollagensuspension Zell Mix

1. Ernte (zB mit 0,25% Trypsin / EDTA) und zählen Zellen von Interesse. Resuspendieren der Zellen in Komplettmedium, das fötales Kälberserum (FCS), Antibiotika und empfohlenen Ergänzungsmittel. Vorbereitung 4-8 1,5 ml Reaktionsgefäße und 20 ul Zellsuspension, die 4-6 × 10 ⁴ Zellen (die Gesamtzahl der Zellen von den Zelltyp zu analysieren) und füllen bis zu 50 ul mit komplettem Medium.
   HINWEIS: Zusätzliche Verbindungen (zB Wachstumsfaktoren, Chemokine, Inhibitoren, etc.) zu der Zellsuspension gegeben. Verwenden Sie geeignete Lager-Lösungen, so dass das endgültige Volumen der Zellsuspension 50 ul nicht überschreiten.
2. Bereiten Sie eine Gesamtmenge von 452 ul endgültige Kollagensuspension für vier Zellmigration Experimenten. Dann werden 50 ul 10x MEM (pH 5,1-5,5) und 27 ul 7,5% iger Natriumhydrogencarbonatlösung (pH 9,0-9,5) In ein 1,5 ml Reaktionsgefäß und gründlich mischen. Beachten Sie die Farbe der Lösung wiederum von gelb-orange bis intensiv violett (pH-Wert 9,0-9,5). Fügen Sie 375 ul Flüssigkeit Kollagensuspension auf die 10x MEM / Natriumhydrogencarbonat-Lösung und gründlich mischen. Der pH-Wert des fertigen Kollagen Suspension sollte über 7,5 liegen (von einer Licht lila Farbe angegeben).
   Hinweis: Prüfen Sie den pH-Wert der 7,5% Natriumhydrogencarbonat-Lösung. Wenn der pH-Wert etwa 7,5 Ort die Natriumbicarbonatlösung mit offenem Deckel in einem Inkubator (37 ° C, 5% CO _2), mit CO ₂ gesättigt und der pH-Wert (etwa 9,0 bis 9,5) zu erhöhen. Der pH-Wert der Kollagensuspension Zellmischung ist von entscheidender Bedeutung für die Stabilität des Kollagen-Netzwerk. Wenn sie zu niedrig ist Kollagengitter während der Zellmigration Experiment kollabieren.
   HINWEIS: Für dieses Protokoll verwenden flüssigen Kollagen (pH-Wert 1,9-2,2) aus Rinderhinter (2,9-3,3 mg / ml Kollagen, 95% Kollagen Typ I, 5% Kollagen Typ IV). Beispiele für weitere Kollagengitter Vorbereitung Protokolle mitKollagen Typ I aus anderen Quellen, wie beispielsweise Schweine-oder Ratten, sind in ^32,33 gegeben. Die Volumina der eingesetzten Lösungen nicht verändern, da dies die ultimative Kollagen-Konzentration von 1,67 mg / ml des Gitters verändern. Eine höhere oder niedrigere Kollagenkonzentration einen Einfluss auf die Dichte der Collagenfasern und dem durchschnittlichen Abstand zwischen ihnen gleichzeitig mit den Zellen Zugverhalten ^34.
3. 100 l des fertigen Kollagen Suspension auf 50 ul Zellsuspension und mischen thoroughly.The endgültige Kollagensuspension (1,67 mg / ml Kollagen) ist etwas zähflüssig. Um die richtige Menge (100 ul) zu übertragen, Pipette die endgültige Kollagenlösung einmal nach oben und unten vor der Übertragung auf der Zellsuspension.
   Hinweis: Wenn der Kollagensuspension Zellmischung ist mit der 10x MEM / Natriumhydrogencarbonat-Lösung und der pH-Wert auf 7,5 geändert kombiniert die Kollagenfasern sofort zu polymerisieren.
4. Die Abschlusskollagensuspension Zelle Mix aus the Reaktionsrohre zu den Migrationskammern. Klopfen Sie leicht die Migration Kammer gleichmäßig verteilen die Kollagensuspension Zellmischung auf dem Boden der Migrationskammer (1H). Zeigen die Migrationskammern in einer aufrechten Position in einem Gestell und Inkubation für 30 min (37 ° C, 5% CO _2), um die Polymerisation der Kollagenfasern erlauben.
5. Beachten Sie, dass die polymerisierte Kollagengitter ist leicht trüb, aber immer noch hell lila Farbe. Füllen die Kammern mit Migrationsvollmedium oder Komplettmedium mit Ergänzungen von Interesse und versiegeln die Migration Kammer mit Paraffinwachs / Vaseline-Mix (Figuren 1I, 1J).

3. Aufnahme und Analyse der Zellmigration

Dieser Abschnitt beschreibt die Aufnahme der Zellmigration durch Zeitraffer-Videomikroskopie und Analyse der Zellmigration durch manuelle Zellverfolgung.

1. Schalten Sie das Mikroskop und den Mikroskoptisch heater. Einstellen der Temperatur auf 37 ° C. Verwenden Sie einen 10X-Objektiv. Zeigen Migrationskammer unter dem Mikroskop und konzentrieren sich etwa 50 Zellen oder mehr in das Blickfeld.
2. Rekordzellmigration im Zeitraffer-Modus mit einer Multi-Kamera-Videoüberwachungs-Software-Anwendung. Sparen Zellmigration Filme in einem geeigneten Format, zB "AVI" oder "MOV". Verbinden die Zellmigration Film-Dateien auf einer Datenbank, die unterstützende Informationen, wie Zelltyp und Versuchsbedingungen.
   HINWEIS: Wir verzeichnen Lymphozyten und HSPCs für bis zu 2 Stunden mit einem Zeitraffer-Faktor von 1:80, was bedeutet, dass 0,75 sec im Zeitraffer gleich 1 min in Echtzeit ist. Tumorzellen sind langsam bewegenden Zellen und somit für mindestens 16 h unter Verwendung einer Zeitrafferfaktor 1 aufgezeichnet: 1,800 (0,5 sec in Zeitraffer gleich 15 min in Echtzeit).
3. Analyse der Zellmigration Filme mit einer geeigneten Zell Tracking-Software-Anwendung, wie ImageJ Software Plugins(Eine Übersicht findet sich in ¹⁸ angegeben). Für eine unvoreingenommene Analyse ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Zellen nach dem Zufallsprinzip, ohne das Wissen ausgewählt werden, ob die Zellen sind wandernde aktiv ist oder nicht.
   HINWEIS: Wir sind mit einem selbst entwickelten Software-Anwendung, um die Wege von mindestens 30 Zellen pro Experiment, indem Sie die beweglichen Zellen genau mit dem Maus-Cursor (die in den Zellkern positioniert ist) manuell zu verfolgen. Während Tracking werden die xy-Koordinaten der Zellen verfolgt automatisch in Übereinstimmung mit der verwendeten Zeitraffermodus bestimmt. Für Lymphozyten / HSPCs xy-Koordinaten bestimmt jede 0,75 sec (gleich 1 Echtzeit-min), während für die Tumorzellen xy-Koordinaten werden jeweils 0,5 sec (entspricht in Echtzeit 15 min) bestimmt.
4. Bestimmen Sie insgesamt 60 xy-Koordinaten pro Zelle für eine typische Zellmigration Experiment. Dies ist gleich 1 h in Echtzeit für Lymphozyten / HSPCs und 15 h in Echtzeit für die Tumorzellen. A "," zeigt an, dass eine Zelle nicht zwischen tw verschobeno Zeitpunkten, wohingegen eine "Zahlenwert" gibt den Abstand in "Pixel" eine Zelle zwischen den Zeitpunkten 2 (2A) bewegt.
   Hinweis: Die manuelle Zellverfolgung erfordert Erfahrung. Besonders schnell wandernden Zellen sind schwer zu verfolgen und zu jeder Zelltyp weisen eine ausgeprägte Wanderverhalten, die ergänzt durch Faktoren ausgelöst werden könnten. Bei der Zellteilung bei der Spurhaltung, zufällig wählen Sie eine Tochterzelle für die Fortsetzung Verfolgung. Zellen, die aus dem Gesichtsfeld wandern oder sterben, während Tracking nicht vernachlässigt werden, sind aber für die Analyse berücksichtigt.

4. Datenanalyse

1. Analysieren Zelle Tracking-Daten unter Verwendung eines geeigneten Software-Anwendung, beispielsweise ein Tabellenkalkulationsprogramm.
   1. Analysieren Zelle Tracking-Daten, indem Sie die Zelle Tracking Rohdaten (2A), in einen selbst entworfenen Tabellenvorlage. Multiplizieren Summe der "Zahlenwerte", wasdie Gesamtstrecke eine Zelle mit einem Korrekturfaktor, um in die "um" konvertieren "Pixel" migriert.
   2. Bestimmen Sie zwei Zellmigration Parameter: Bewegungsaktivität und Zeit der aktiven Bewegung (2C, 2D) (das entspricht Migrationsrate ist).
   3. Identifizieren Sie die Zellen, die weniger als 25 um (Schwellenwert, um die Zahl der falsch-positiven Zellen zu reduzieren) migriert haben als Nicht-Bewegen-Zellen. Ersetzen Sie "Zahlenwerte" dieser Zellen mit ",".
      HINWEIS: Der Parameter "Bewegungsaktivität" (oder Migrationsrate) stellt den Prozentsatz der Zellen der Zellpopulation verfolgt, die zwischen zwei Zeitpunkten (2D) bewegt haben. A "Zahlenwert" als ein Bewegungs Zelle definiert, während "" ist als nicht bewegenden Zelle definiert. Der Parameter "Zeit der aktiven Bewegung" (aktiv) stellt den Prozentsatz der Gesamtzeit eine Zelle in re migriertnung auf den Zeitrahmen des Beobachtungszeitraums (Abbildung 2C). A "numerischen Wert" zeigt an, dass eine Zelle bewegt, während "" zeigt an, dass eine Zelle nicht bewegt hat. Dieser Parameter wird ferner verwendet, um die Anzahl der Zellen, die sich nicht bewegt hat bestimmen.
2. Berechnen statistischer Signifikanz und Anzeigezelle Migrationsdaten.
   1. Berechnen Sie die statistische Signifikanz der mittleren Bewegungsaktivität der Zellen (Migrationsrate) unter Verwendung des Mann-Whitney-U-Test. Betrachten p-Wert <0,05 als signifikant.
   2. Zeigen Sie die mittlere Bewegungsaktivität der Zellen als xy-Diagramm, Boxplot-Diagramm oder als Balkendiagramm. Anzeige Einzelzellbasis Daten wie Zeit der aktiven Bewegung oder Geschwindigkeit, als Balkendiagramm-Diagramm oder als Histogramm.
      HINWEIS: Wenn die gewählte Tabellenkalkulationssoftware Anwendung keine Boxplot Diagramm oder Histogramm-Diagramm-Tool enthält eine Online-Suche sollte für die Suche nach geeigneten tu durchgeführt werdentorials.

Ergebnisse

Das verwendete 3D-Kollagen-Matrix kombiniert mit Migrationsassay Zeitraffer-Video-Mikroskopie und computergestützte Zellverfolgung erlaubt die Bestimmung verschiedener Parameter einschließlich Zellmigration sowohl populationsbasierte Parameter (zB bedeuten, Bewegungsaktivität) und Einzelzellbasis Parameter (zB Zeit der aktiven Bewegung, Geschwindigkeit, Entfernung migriert). Ein Beispiel der erhaltenen Zellverfolgungsdatensätze, Datenverarbeitung und Datendarstellung in Figur 2 wiedergegebe...

Diskussion

Die Fähigkeit zur Migration ist ein Markenzeichen von Tumorzellen ^4. Ohne die Fähigkeit, aus dem Primärtumor zu lösen und durch die umgebende Bindegewebe Tumorzellen wandern können keine Sekundärläsionen, die die Hauptursache für Tod fast aller Krebspatienten zu beimpfen. Wegen dieser Beziehung viele Studien konzentrieren sich auf die Krebszellmigration. Das Ziel dieser Studien ist die Identifizierung neuer Zielmoleküle und die Zielwege, die effektiv blockieren Tumorzellmigration, wodurch Beeinträch...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leica DM IL inverted microscope	Leica, Wetzlar, Germany
Microscope stage heater	Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany
JVC C1431 video camera	JVC, Bad Vilbel, Germany
Axis 241Q video server	Axis communication GmbH, Ismaning, Germany
Mac G5 Computer	Apple Macintosh
iMac	Apple Macintosh
FileMaker Pro	FileMaker GmbH, Unterschleißheim, Germany
Multi-camera video surveillance software(Security Spy)	Bensoftware, London, UK
Runtime Revolution Media 2.9.0	RunRev Ltd., Edinburgh, UK
Paraffin	Applichem GmbH, Darmstadt, Germany	A4264
Petroleum jelly	local drug store
Purecol (liquid collagen)	Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands		contains 2.9 - 3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)
10x MEM	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M0275
7.5% sodium bicarbonate solution	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	S8761
EGF	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	E9644
U73122	Merck Millipore, Darmstadt, Germany	662035	dissolve first in CHCl3; reconstitute in DMSO just prior to use