JoVE Logo
Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

This work details procedures for rapid identification of bacteria using MALDI-TOF MS. The identification procedures include spectrum acquisition, database construction, and follow up analyses. Two identification methods, similarity coefficient-based and biomarker-based methods, are presented.

Resumen

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, strain levels. Commercially available and open source software tools have been developed to facilitate identification; however, no universal/standardized data analysis pipeline has been described in the literature. Here, we provide a comprehensive and detailed demonstration of bacterial identification procedures using a MALDI-TOF mass spectrometer. Mass spectra were collected from 15 diverse bacteria isolated from Kartchner Caverns, AZ, USA, and identified by 16S rDNA sequencing. Databases were constructed in BioNumerics 7.1. Follow-up analyses of mass spectra were performed, including cluster analyses, peak matching, and statistical analyses. Identification was performed using blind-coded samples randomly selected from these 15 bacteria. Two identification methods are presented: similarity coefficient-based and biomarker-based methods. Results show that both identification methods can identify the bacteria to the species level.

Introducción

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus, species, and in some cases, strain levels1-4. MALDI-TOF MS ionizes biological molecules (typically proteins) that originate from cell surfaces, intracellular membranes, and ribosomes from bacterial whole cells or protein extracts1,5. The resulting peaks form characteristic patterns or “fingerprints” of the bacteria analyzed1. Identification of bacteria is based on these mass-to-charge “fingerprints”.

Two of the most commonly used identification strategies are library-based and bioinformatics-based strategies1. Library-based approaches involve comparing the mass spectra of unknowns to previously collected mass spectra of known bacteria in databases/libraries for identification. Commercially available software, such as BioNumerics, Biotyper, and SARAMIS software packages, as well as open source software tools, such as SpectraBank6, are available to facilitate the comparison and quantification of similarity between mass spectra of unknowns and reference bacteria. Bioinformatics-based approaches usually rely on fully sequenced genomes of bacteria for identification. In contrast to library-based approaches which do not involve identification of the biological nature of particular peaks, bioinformatics-based approaches involve protein identification1.

The majority of recent MALDI fingerprint-based studies have used library-based approaches to identify bacteria1. Library-based approaches require construction of databases and comparison of the similarity between mass spectra. Studies show that many experimental procedures, such as medium3,7, cultivation time8, sample preparation method3, and matrix used9, affect the mass spectra obtained. Furthermore, some closely-related species and strains generate spectra with only subtle differences. Thus, library-based approaches require rigorously standardized procedures to generate highly reproducible mass spectra between replicates. Minor variations in protocols may compromise the efficacy of identification, especially at the subspecies and strain levels1,3,10. However, neither manufacturer-provided reference databases nor reported custom databases include visually documented procedures for database construction and/or application of a data analysis pipeline. For this reason, the objective of this work was to develop, apply, and demonstrate a comprehensive and detailed procedure for library-based bacterial identification using MALDI-TOF MS.

In this demonstration, mass spectra of 15 bacteria isolated from a karstic environment (Kartchner Cavern, AZ, USA) were collected and imported into software to construct a model database. Data processing and the analysis pipeline were detailed using the model database. Finally, mass spectra of blind-coded bacteria which were randomly selected from these 15 bacteria were collected again and compared to the reference spectra in the model database for identification. Results show that bacteria can be correctly identified either based on similarity coefficients or potential biomarkers/peak classes.

Protocolo

Precaución: las bacterias no identificados de cualquier entorno pueden ser patógenos y deben ser manejados con precaución el uso de protocolos de bioseguridad adecuadas. Trabaja con cultivos vivos debe realizarse en una cabina de seguridad biológica Clase II utilizando procedimientos de seguridad biológica de nivel 2 (BSL-2). Más información acerca de BSL-2 procedimientos está disponible en el manual CDC / NIH titulado, "Bioseguridad en laboratorios microbiológicos y biomédicos", páginas 33-38. El documento está disponible en línea en http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf . Equipos de protección personal (PPE), incluyendo batas de laboratorio / batas, gafas de seguridad y guantes de nitrilo o látex, se debe usar. Prácticas y precauciones análisis microbiológico de base deben seguir, y residuos biológicos peligrosos deben desecharse adecuadamente.

Las bacterias utilizadas en esta demostración se aislaron de las Cavernas Kartchner,AZ, EE.UU., a partir de cuatro ambientes, incluyendo espeleotema seco, piedra flujo, espeleotemas húmedo y goteo estalactita (Tabla 1). Todos los aislamientos fueron identificados por secuenciación de 16S rDNA y se mantuvieron a -80 ° C en 25% de glicerol-R medio 2 B. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente.

Nota: Se recomienda utilizar el mismo método de preparación de muestras para adquirir espectros de masas para la construcción de bases de datos y los espectros de masas de incógnitas. Método de preparación de la muestra se ha demostrado previamente para afectar a la calidad del espectro y reproducibilidad 3. Utilizando un método de preparación de la muestra diferente puede causar una incorrecta identificación de incógnitas, especialmente cuando mayor resolución taxonómica (por ejemplo, a nivel de cepa) que se desea.

1. Deposición en el Target MALDI

Precaución: Varios protocolos para obtener extractos de proteínas requieren el uso de ácidos y disolventes orgánicos que deben utilizarse de acuerdo con GUIDElines y la información contenida en sus respectivas Hojas de Datos de Seguridad de Materiales (MSDS). Apropiada PPE debe usar y puede variar en función del tipo y volumen de los productos químicos utilizados (por ejemplo, batas de laboratorio / batas, guantes, gafas de seguridad y de protección respiratoria deben ser usados ​​cuando se trabaja con cantidades significativas de disolventes inflamables, tóxicos, tales como acetonitrilo, y ácidos corrosivos, tales como ácidos fórmico y trifluoroacético).

  1. Depósito 1 l extracto de proteína que no contiene células viables (obtenidos mediante su caso, los protocolos descritos anteriormente 11-13) en una placa de MALDI objetivo acero inoxidable y permitir que se seque. Superposición del extracto de proteína seca con solución de matriz 1 l (α-ciano-4-hidroxi-cinámico solución de ácido), y deje que se seque.
  2. Para cada biológica replicar, detectar un número apropiado de repeticiones técnica (de 5 a 20 repeticiones técnicos). Aquí, detectar 10 repeticiones técnica para cada biológica replicar y 3 repeticiones biológica were preparado.
    Nota: Se recomienda el uso de una placa de acero objetivo MALDI pulido cuando se utiliza el método de preparación de la muestra de extracción de proteínas. El uso de placas de puntería de acero de tierra puede causar la difusión y mezcla involuntaria de las diferentes muestras fuera de pocillos de muestras individuales.
  3. Depósito 1 l estándar de calibrador en el plato blanco y deje que se seque. Superposición con solución de matriz 1 l y deje que se seque.
  4. Depósito de solución de matriz 2 l en la placa del objetivo como un control negativo.

2. Los espectros de masas Adquisición

  1. Utilice un espectrómetro de masas MALDI-TOF equipado con un láser de nitrógeno (λ = 337 nm) y operado utilizando software Bruker FlexControl.
  2. Recoge cada espectro de masas en modo lineal positiva por acumulación de 500 disparos de láser en incrementos de 100 tiro. Ajuste el voltaje de la fuente de iones de 1 a 20 kV; fuente de iones 2 voltaje a 18.15 kV; y la tensión de la lente a 9.05 kV. Tenga en cuenta que estos parámetros son instrumento específic y podría requerir un ajuste en otros instrumentos para obtener resultados óptimos.
  3. Ajuste el rango de masa-carga para la evaluación automatizada del espectro de 2 a 20 kDa por carga. Utilice el algoritmo de detección de pico centroide. Ajuste el umbral mínimo de resolución de 100 Da. Establecer la relación señal a ruido (S: N) umbral en 2. Establezca el umbral mínimo de intensidad a 100.

3. Base de datos de construcción

  1. Diseño de base de datos
    1. Crear una nueva base de datos en BioNumerics 7.1 utilizando el "Asistente para nueva base de datos".
    2. Cree un tipo de experimento espectro, por ejemplo, Maldi, mediante los comandos del "Tipos de experimentos" del panel.
    3. Crear los niveles utilizando el "panel de diseño de base de datos". Añadir nuevos niveles utilizando el "Nivel> Añadir nuevo nivel ..." comando en el menú "Base de datos". Aquí, crear "especies" de nivel, el nivel de "réplica biológica" "y" técnica de reproducir "nivel, respectively.
  2. Importación y procesamiento previo de los espectros de masa cruda
    1. Exportación de los espectros de masa cruda como archivos .txt utilizando FlexAnalysis haciendo clic en el "Exportar> Espectro de masas" comando en el menú "Archivo".
    2. Importar los espectros de masa cruda (archivos .txt) en la base de datos en el nivel de los técnicos repeticiones.
    3. Preproceso los espectros de masa cruda.
      1. Importación y volver a muestrear (utilizando un algoritmo de ajuste cuadrática).
      2. Realice una sustracción de línea de base (con un disco de rodadura con un tamaño de 50 puntos).
      3. Calcule el ruido [continua transformación Wavelet (CWT)], lisa (Kaiser ventana con un tamaño de ventana de 20 puntos y beta de 10 puntos), y llevar a cabo una segunda base de referencia resta (disco rodando con tamaño de 200 puntos).
      4. Detectar picos [CWT con un mínimo de señal a ruido (S: N) de 10].
    4. Después de preprocesamiento, guardar patrones característicos de cada espectro de masas, como las listas de pico que contienen picotamaños pico de intensidad, S: N, etc., en la base de datos.
  3. Creación de los espectros de masas de material compuesto
    1. Crear espectros compuesto a partir de espectros previamente con el comando "Resumir ..." en el menú "Análisis". Elija la opción "réplica biológica" como nivel objetivo.
    2. Aquí, se combinan los espectros de masas de 10 repeticiones técnica de la misma colonia para producir un espectro de masas de material compuesto para esa colonia, resultando en tres espectros de masas de material compuesto para que aíslan en el nivel "biológica replicar".
    3. Aquí, un resumen de los tres espectros compuesto para crear un espectro compuesto para que aíslan a nivel "Especies".
      Nota: El espectro compuesto es el medio punto por punto de los técnicos repeticiones. Replica con una similitud (correlación de Pearson) con la media de inferior al 95% (ajuste predeterminado), se excluyen del compuesto. Picos en los espectros de material compuesto sólo se llaman si están presentes en el 75% (ajuste por defecto) de las réplicas incluidos. Para las réplicas biológicas, estos valores fueron 90 y 60%, respectivamente.

Análisis 4. Espectro de masas de datos

  1. Seleccione las entradas de la base de datos y crear una comparación haciendo clic en el comando "Crear nueva comparación" en el "comparaciones" del panel.
  2. En este caso, utilizar los espectros de masas en la "técnica de reproducir" y / o niveles "biológica replicar" para mostrar comparaciones y análisis.
  3. Análisis cluster basado en la similitud y escalamiento multidimensional (MDS)
    1. Crear grupos con colores. Seleccione los tres biológica espectros de masas compuesto y haga clic en "Crear nuevo grupo de selección" comando en el menú "Grupos" para crear un grupo para el aislamiento correspondiente. Designar un color que se utiliza automáticamente para estos tres espectros de masas.
    2. Alternativamente, definir estados de campo con los colores correspondientes utilizando los comandos en el "Base de datos de entradas del panel "de tal manera que cualquier agrupación basado en este campo definido utiliza el mismo color definido para este grupo.
    3. Realizar análisis de conglomerados. Haga clic en el comando "Calcular el análisis cluster" en el menú "Clustering". En la configuración de página de comparación 1, seleccione la "correlación de Pearson" y dejar otros parámetros por defecto. En la página 2, seleccione "UPGMA". Luego haga clic en "Finalizar".
    4. Obtener una parcela MDS usando el "escalamiento multidimensional ..." comando en el menú "Estadísticas".
  4. Juego Pico
    1. Haga clic en el tipo de espectro "Maldi" en el "experimentos" del panel. A continuación, seleccione "Diseño> Mostrar imagen". Los espectros se muestran como bandas de gel.
    2. Realizar juego pico con el comando "Haz coincidente pico" en el menú de "espectros".
  5. Identificación de clases de pico
    1. Realizar un análisis de componentes principales (PCA). Resalta el "Maldi "tipo de experimento en el" Experimental "panel y utilizar el" Análisis de Componentes Principales ... "comando en el menú" Estadística "para realizar PCA.
    2. Realizar bidireccional agrupación. Haga clic en el "Estadísticas> minería Matrix" ... en la ventana "Comparación". La intensidad de los picos adaptados a las clases de pico se representa usando diferentes colores (mapa de calor).

5. Las bacterias de identificación con una base de datos personalizada

  1. Método basado en el coeficiente de similitud
    1. Crear una comparación y generar un dendrograma basado en los espectros de masas a nivel de "réplica técnicos" como se describe en el paso 4.3.3. Guarde el dendrograma para la comparación de similitud.
    2. Seleccione un espectro de masa desconocida, y haga clic en el "Análisis> Identificar las entradas seleccionadas". Aparecerá el cuadro de diálogo de identificación.
    3. Seleccione el tipo de clasificador "en base de comparación" (o una classif almacenadaier) y haga clic en "Siguiente". En la página siguiente, elija el dendrograma guardado como una comparación de referencia y haga clic en "Siguiente".
    4. Elija la opción "similitud básica" como un método de identificación y luego haga clic en "Siguiente".
    5. Elija la opción "similitud máxima" como método de puntuación. Escriba los valores mínimos apropiados y valores mínimos de diferencia para cada parámetro y haga clic en "Siguiente".
    6. Una vez terminados los cálculos, aparecerá la ventana de identificación. En la "Resultados" del panel, se enumeran los miembros de la base de datos que mejor se adapten a lo desconocido.
    7. Guarde el proyecto de identificación y validación de la identificación mediante el comando "validación cruzada análisis" en el panel de "proyecto de identificación".
  2. Método basado en el potencial biomarcador
    1. Definir las clases altas. En la ventana "Matrix Minería", seleccionar conjuntos de picos que comparten características comunes y definir estos picos como especíclases pico fic (biomarcadores potenciales) utilizando "Espectros> Administrar tipos de clase pico ..." en la "ventana de comparación".
    2. Aquí, definir clases pico específicas para cada aislamiento para todos los 15 aislamientos.
    3. Seleccionar los espectros de masas de incógnitas y combinar los picos de estos espectros a las clases Pico definido como se describe anteriormente.

Resultados

Las bases de datos construidos en esta demostración tenían cuatro niveles, de mayor a menor nivel, incluyendo "Todos los niveles", "Especies", "réplica biológica" y "técnica de reproducir", respectivamente (Figura 1). La "técnica de reproducir" nivel contenía todos los espectros preprocesado de técnicos repeticiones. El "biológica replicar" y los niveles de "especies" contenían el compuesto (resumen) espectros. "Todos l...

Discusión

Esta demostración mostró procedimientos detallados de caracterización e identificación de bacterias usando MALDI-TOF MS y una base de datos personalizada. En comparación con los métodos moleculares tradicionales, por ejemplo, los métodos de secuenciación de 16S rDNA de huellas digitales, basados ​​en MS MALDI-TOF facilitan más rápida identificación de diversas bacterias. Debido a su robustez, esta técnica se utiliza ampliamente para caracterizar las bacterias, los virus, los hongos y la levadura del medi...

Divulgaciones

Authors Vranckx and Janssens are employees of Applied Maths NV, the manufacturer of data analysis software used in this video. Applied Maths NV provided select software modules highlighted in this video as well as a portion of the publication costs associated with this video.

Agradecimientos

This work was supported by the New College of Interdisciplinary Arts and Sciences at Arizona State University, Applied Maths NV, and by the National Science Foundation (ROA Supplement to Award No. MCB0604300). Any opinions, findings, and conclusions or recommendations expressed in this material are those of the author(s) and do not necessarily reflect the views of the National Science Foundation.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acidACROS Organics163440050≥ 97%, CAS 28168-41-8
Bruker FlexControl softwareBruker Daltonicsversion 3.0
Bruker FlexAnalysis softwareBruker Daltonicsversion 3.0
Bionumerics softwareApplied Mathsversion 7.1

Referencias

  1. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
  2. Siegrist, T. J., et al. Discrimination and characterization of environmental strains of Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). J Microbiol Meth. 68 (3), 554-562 (2007).
  3. Goldstein, J. E., Zhang, L., Borror, C. M., Rago, J. V., Sandrin, T. R. Culture conditions and sample preparation methods affect spectrum quality and reproducibility during profiling of Staphylococcus aureus with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Lett Appl Microbiol. 57 (2), 144-150 (2013).
  4. Benagli, C., et al. A rapid MALDI-TOF MS identification database at genospecies level for clinical and environmental Aeromonas strains. Plos One. 7 (10), (2012).
  5. Sauer, S., Kliem, M. Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 74-82 (2010).
  6. Bohme, K., et al. SpectraBank: An open access tool for rapid microbial identification by MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 33 (14), 2138-2142 (2012).
  7. Walker, J., Fox, A. J., Edwards-Jones, V., Gordon, D. B. Intact cell mass spectrometry (ICMS) used to type methicillin-resistant Staphylococcus aureus: media effects and inter-laboratory reproducibility. J Microbiol Meth. 48 (2-3), 117-126 (2002).
  8. Ruelle, V., El Moualij, B., Zorzi, W., Ledent, P., De Pauw, E. Rapid identification of environmental bacterial strains by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Sp. 18 (18), 2013-2019 (2004).
  9. Sedo, O., Sedlacek, I., Zdrahal, Z. Sample Preparation Methods for Maldi-MS Profiling of Bacteria. Mass Spectrom Rev. 30 (3), 417-434 (2011).
  10. Swatkoski, S., Russell, S., Edwards, N., Fenselau, C. Analysis of a model virus using residue-specific chemical cleavage and MALDI-TOF mass spectrometry. Anal Chem. 79 (2), 654-658 (2007).
  11. Freiwald, A., Sauer, S. Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry. Nat Protoc. 4 (5), 732-742 (2009).
  12. Drevinek, M., Dresler, J., Klimentova, J., Pisa, L., Hubalek, M. Evaluation of sample preparation methods for MALDI-TOF MS identification of highly dangerous bacteria. Lett Appl Microbiol. 55 (1), 40-46 (2012).
  13. Lasch, P., et al. MALDI-TOF mass spectrometry compatible inactivation method for highly pathogenic microbial cells and spores. Anal Chem. 80 (6), 2026-2034 (2008).
  14. Usbeck, J. C., Kern, C. C., Vogel, R. F., Behr, J. Optimization of experimental and modelling parameters for the differentiation of beverage spoiling yeasts by Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) in response to varying growth conditions. Food Microbiol. 36 (2), 379-387 (2013).
  15. Del Chierico, F., et al. MALDI-TOF MS proteomic phenotyping of filamentous and other fungi from clinical origin. J Proteomics. 75 (11), 3314-3330 (2012).
  16. Vitale, R., Roine, E., Bamford, D. H., Corcelli, A. Lipid fingerprints of intact viruses by MALDI-TOF/mass spectrometry. Bba-Mol Cell Biol L. 1831 (4), 872-879 (2013).
  17. Zhang, L., Borror, C. M., Sandrin, T. R. A designed experiments approach to optimization of automated data acquisition during characterization of bacteria with MALDI-TOF mass spectrometry. Plos One. 9 (3), (2014).
  18. Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J ClinMicrobiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Ciencias AmbientalesN mero 95Identificaci nbacterias ambientalesMALDI TOF espectrometr a de masasBioNumericshuella digitalbase de datosel coeficiente de similitudbiomarcador

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados