השימוש בMALDI-TOF המוני ספקטרומטריית ומסד נתונים מותאמים אישית לאפיון חיידקים ילידים למערת סביבה ייחודית (Kartchner מערות, AZ, ארה"ב)

Summary

This work details procedures for rapid identification of bacteria using MALDI-TOF MS. The identification procedures include spectrum acquisition, database construction, and follow up analyses. Two identification methods, similarity coefficient-based and biomarker-based methods, are presented.

Abstract

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, strain levels. Commercially available and open source software tools have been developed to facilitate identification; however, no universal/standardized data analysis pipeline has been described in the literature. Here, we provide a comprehensive and detailed demonstration of bacterial identification procedures using a MALDI-TOF mass spectrometer. Mass spectra were collected from 15 diverse bacteria isolated from Kartchner Caverns, AZ, USA, and identified by 16S rDNA sequencing. Databases were constructed in BioNumerics 7.1. Follow-up analyses of mass spectra were performed, including cluster analyses, peak matching, and statistical analyses. Identification was performed using blind-coded samples randomly selected from these 15 bacteria. Two identification methods are presented: similarity coefficient-based and biomarker-based methods. Results show that both identification methods can identify the bacteria to the species level.

Introduction

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus, species, and in some cases, strain levels^1-4. MALDI-TOF MS ionizes biological molecules (typically proteins) that originate from cell surfaces, intracellular membranes, and ribosomes from bacterial whole cells or protein extracts^1,5. The resulting peaks form characteristic patterns or “fingerprints” of the bacteria analyzed¹. Identification of bacteria is based on these mass-to-charge “fingerprints”.

Two of the most commonly used identification strategies are library-based and bioinformatics-based strategies¹. Library-based approaches involve comparing the mass spectra of unknowns to previously collected mass spectra of known bacteria in databases/libraries for identification. Commercially available software, such as BioNumerics, Biotyper, and SARAMIS software packages, as well as open source software tools, such as SpectraBank⁶, are available to facilitate the comparison and quantification of similarity between mass spectra of unknowns and reference bacteria. Bioinformatics-based approaches usually rely on fully sequenced genomes of bacteria for identification. In contrast to library-based approaches which do not involve identification of the biological nature of particular peaks, bioinformatics-based approaches involve protein identification¹.

The majority of recent MALDI fingerprint-based studies have used library-based approaches to identify bacteria¹. Library-based approaches require construction of databases and comparison of the similarity between mass spectra. Studies show that many experimental procedures, such as medium^3,7, cultivation time⁸, sample preparation method³, and matrix used⁹, affect the mass spectra obtained. Furthermore, some closely-related species and strains generate spectra with only subtle differences. Thus, library-based approaches require rigorously standardized procedures to generate highly reproducible mass spectra between replicates. Minor variations in protocols may compromise the efficacy of identification, especially at the subspecies and strain levels^1,3,10. However, neither manufacturer-provided reference databases nor reported custom databases include visually documented procedures for database construction and/or application of a data analysis pipeline. For this reason, the objective of this work was to develop, apply, and demonstrate a comprehensive and detailed procedure for library-based bacterial identification using MALDI-TOF MS.

In this demonstration, mass spectra of 15 bacteria isolated from a karstic environment (Kartchner Cavern, AZ, USA) were collected and imported into software to construct a model database. Data processing and the analysis pipeline were detailed using the model database. Finally, mass spectra of blind-coded bacteria which were randomly selected from these 15 bacteria were collected again and compared to the reference spectra in the model database for identification. Results show that bacteria can be correctly identified either based on similarity coefficients or potential biomarkers/peak classes.

Protocol

זהירות: חיידקים לא מזוהים מכל סביבה עשויים להיות פתוגניים ויש לטפל בם בזהירות תוך שימוש בפרוטוקולי בטיחות ביולוגי מתאימים. עבודה עם תרבויות חיות חייבת להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגי Class II באמצעות בטיחות ביולוגית רמה 2 (BSL-2) נהלים. מידע נוסף על-2 BSL נהלים נגיש במדריך CDC / NIH שכותרתו, "הבטיחות הביולוגית במיקרוביולוגים ויו-רפואיים מעבדות," דפים 33-38. המסמך זמין באופן מקוון http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf. ציוד מגן אישי מתאים (PPE), כוללים חלוקי מעבדה / שמלות, משקפי מגן, כפפות וnitrile או לטקס, חייב להיות משוחק. שיטות מיקרוביולוגיות סטנדרטית ואמצעי זהירות יש אחריו, ופסולת ביולוגית מסוכנת חייבת להיות מושלכת כראוי.

חיידקים המשמשים בהפגנה זו היו מבודדים ממערות Kartchner,AZ, ארצות הברית, מארבע סביבות, כולל speleothem היבש, זרימת אבן, speleothem הלח וטפטוף נטיפים (טבלת 1). כל הבידודים זוהו על ידי רצף 16S rDNA והמשיכו ב -80 מעלות צלזיוס ב -25% גליצרול-R ₂ B בינוניים. כל הניסויים הושלמו בRT.

הערה: אנו ממליצים על השימוש באותה שיטת הכנת מדגם לרכוש ספקטרה ההמונית לבניית מסד נתונים וספקטרה ההמונית של אלמונים. שיטת הכנת מדגם הוכחה בעבר להשפיע על איכות ספקטרום ושחזור ^3. באמצעות מדגם שיטת הכנה שונה עלול לגרום לזיהוי שגוי של אלמונים, רזולוציה הטקסונומית במיוחד כאשר גבוהה יותר (לדוגמא, ברמת המתח) הוא רצוי.

1. הפקדת ביעד MALDI

זהירות: מספר פרוטוקולים להשיג תמציות חלבון דורשות שימוש בחומצות וממסים אורגניים שחייבים להיות מנוצל בהתאם לguidelines ומידע כלול בגיליונות שלהם בהתאמה חומרי בטיחות (MSDS). PPE המתאים חייב להיות משוחק וישתנה בהתאם לסוג ונפח של כימיקלים המשמש (למשל, חלוקי מעבדה / שמלות, כפפות, משקפי מגן, ויש להשתמש בציוד להגנת נשימה בעת עבודה עם כמויות משמעותיות של ממסים רעילים, דליקים, כגון אצטוניטריל, וחומצות המאכלות, כגון חומצות פורמית וtrifluoroacetic).

1. הפקדת 1 μl תמצית חלבון המכילה לא תאי קיימא (שהושגו תוך שימוש בפרוטוקולים מתאימים, שתוארו קודם לכן ^11-13) על צלחת יעד MALDI נירוסטה ולאפשר לו להתייבש. כיסוי תמצית החלבון המיובש עם פתרון מטריצת μl 1 (α-cyano-4-הידרוקסי-cinnamic פתרון חומצה), ולאפשר לו להתייבש.
2. עבור כל לשכפל ביולוגי, במקום מספר מתאים של משכפל טכני (5 עד 20 חזרות טכניות). כאן, במקום 10 חזרות טכניות לכל לשכפל ביולוגי ו -3 משכפל ביולוגי were מוכן.
   הערה: אנו ממליצים על שימוש בצלחת יעד פלדת MALDI מלוטש בעת השימוש בשיטת הכנת מדגם מיצוי חלבון. שימוש בצלחות יעד פלדת קרקע עלולה לגרום להתפשטות וערבוב מכוון של המדגמים השונים מחוץ לבארות מדגם בודדות.
3. פיקדון סטנדרטי μl 1 calibrant לצלחת היעד ולאפשר לו להתייבש. שכבה עם פתרון מטריצת μl 1 ולאפשר לו להתייבש.
4. פתרון הפקדה 2 μl מטריצה ​​לצלחת היעד כביקורת שלילית.

2. Mass ספקטרה רכישה

1. השתמש בספקטרומטר מסת MALDI-TOF מצויד בליזר חנקן (ננומטר = λ 337) ומופעל באמצעות תוכנת הברוקר FlexControl.
2. לאסוף כל ספקטרום המוני במצב ליניארי חיובי על ידי הצטברות של 500 יריות לייזר ב -100 מרווחי זריקה. הגדר את מתח מקור יון 1 עד 20 קילו וולט; מקור יון 2 מתח ל18.15 קילו וולט; ומתח העדשה 9.05 קילו וולט. שים לב שהפרמטרים אלה הם מכשיר-ספציפייםפיק ועשוי לחייב את התאמה במכשירים אחרים כדי לקבל תוצאות אופטימליות.
3. הגדר את טווח מסה לתשלום עבור הערכת ספקטרום אוטומטית 2-20 kDa לכל תשלום. השתמש באלגוריתם זיהוי שיא centroid. הגדר את סף הרזולוציה המינימאלי של 100 Da. הגדר את יחס האות לרעש (S: N) סף ב2. הגדרת סף עוצמת המינימום ב -100.

בניית מסד נתונים 3.

1. עיצוב מסד נתונים
   1. ליצור מסד נתונים חדשים בBioNumerics 7.1 באמצעות "אשף מסד הנתונים החדש".
   2. צור סוג ספקטרום ניסוי, למשל, MALDI, באמצעות פקודות בלוח "סוגי הניסוי".
   3. צור הרמות באמצעות "פנל עיצוב מסד נתונים". להוסיף רמות חדשות באמצעות "הרמה> הוסף רמה חדשה ..." הפקודה בתפריט "מאגר המידע". כאן, ליצור רמה, רמה "מינים" "לשכפל ביולוגי" "ו" לשכפל טכני "רמה, respectivאיליי.
2. יבוא ועיבוד מקדים ספקטרה ההמונית גלם
   1. לייצא את הספקטרום המוני גלם כקבצי txt באמצעות FlexAnalysis על ידי לחיצה על הפקודה "יצוא> ספקטרום המוני" בתפריט "הקובץ".
   2. ייבא את ספקטרום הגלם ההמוני (קבצי txt) לתוך מסד הנתונים ברמה הטכנית משכפל.
   3. Preprocess ספקטרה ההמונית הגלם.
      1. יבוא ודגימה מחדש (באמצעות אלגוריתם מתאים ריבועית).
      2. לבצע חיסור בסיסי (עם דיסק מתגלגל עם גודל של 50 נקודות).
      3. לחשב רעש [Transformation אדוה הרציף (CWT)], חלקה (Kaiser חלון עם גודל חלון של 20 נקודות ובטא של 10 נקודות), ולבצע חיסור שני בנקודת ההתחלה (מתגלגל דיסק עם גודל של 200 נקודות).
      4. זיהוי פסגות [CWT עם אות מינימום יחס רעש (S: N) של 10].
   4. לאחר העיבוד מקדים, להציל את הדפוסים אופייניים של כל ספקטרום המוני, כגון רשימות שיא המכילות שיאגדלים, עוצמות שיא, S: N, וכו ', במסד הנתונים.
3. יצירת ספקטרה ההמונית מרוכבים
   1. צור ספקטרום מורכב מ ספקטרום עיבוד מקדים באמצעות הפקודה "סכם ..." בתפריט "ניתוח". בחר "לשכפל הביולוגי" כרמת יעד.
   2. כאן, לשלב ספקטרה ההמונית של 10 חזרות טכניות של אותו המושבה להניב ספקטרום המוני מרוכבים למושבה ש, וכתוצאה מכך שלוש ספקטרה ההמונית מרוכבים לבודד שברמה "לשכפל ביולוגי".
   3. כאן, לסכם את הספקטרום מרוכבים שלוש כדי ליצור ספקטרום מרוכבים אחד הלמבודד ברמת "המינים".
      הערה: ספקטרום מרוכבים הוא ממוצע נקודה-by-נקודה הטכנית משכפל. משכפל עם דמיון (מתאם פירסון) לממוצע נמוך מ 95% (ברירת מחדל) אינם נכללים במרוכבים. פסגות על ספקטרום מרוכבים נקראות רק אם הם קיימים ב -75% (הגדרת ברירת מחדל) של משכפל הכלול. למשכפל הביולוגי, הגדרות אלה היו 90 ו -60%, בהתאמה.

ניתוח 4. Mass ספקטרום נתונים

1. בחר את הערכים במסד הנתונים וליצור השוואה על ידי לחיצה על הפקודה "צור השוואה חדשה" בפנל "השוואות".
2. כאן, להשתמש בספקטרום ההמוני ב" לשכפל טכניים "ו / או רמות" לשכפל ביולוגי "להראות השוואות וניתוחים.
3. ניתוח אשכולות מבוסס דמיון ואת קנה מידה רב ממדית (MDS)
   1. ליצור קבוצות עם צבעים. בחר שלוש ספקטרה ההמונית מרוכבים הביולוגית ולחץ על "הקבוצה החדשה צור מבחירה" הפקודה בתפריט "קבוצות" כדי ליצור קבוצה לבודד המקביל. לייעד צבע באופן אוטומטי המשמש לשלוש ספקטרה ההמונית אלה.
   2. לחלופין, להגדיר מדינות שדה עם צבעים מקביל באמצעות הפקודות ב"ערכי פנל מסד הנתונים, "כך שכל קבוצה המבוססת על תחום המוגדר הזה משתמש באותו הצבע שהוגדר עבור קבוצה זו.
   3. לבצע ניתוח אשכולות. לחץ על הפקודה "חשב ניתוח אשכולות" בתפריט "Clustering". בדף הגדרות השוואת 1, בחר את "מתאם פירסון" ולהשאיר את פרמטרים אחרים כברירת מחדל. בעמוד 2, בחר "UPGMA". לאחר מכן לחץ על "סיום".
   4. להשיג עלילת MDS באמצעות "קנה המידה רב-ממדית ..." פקודת בתפריט "סטטיסטיקה".
4. התאמת שיא
   1. לחץ על סוג הקשת "MALDI" בפנל "ניסויים". לאחר מכן בחר "פריסה '> תמונת הצג". ספקטרום מוצג כלהקות ג'ל.
   2. לבצע התאמת שיא באמצעות הפקודה "האם התאמת שיא" בתפריט "ספקטרה".
5. זיהוי של שיעורי שיא
   1. ביצוע ניתוח עיקרי רכיב (PCA). סמן את ""סוג הניסוי ב" MALDI הניסויי" הפנל ולהשתמש "ניתוח המרכיבים עיקריים ..." הפקודה בתפריט "סטטיסטי" לבצע PCA.
   2. בצע אשכולות דו-כיווניים. לחץ על "סטטיסטיקה> כריית מטריקס" ... בחלון "ההשוואה". העצמה של הפסגות המותאמות לכיתות השיא מיוצגת באמצעות צבעים שונים (מפת חום).

זיהוי 5. חיידקים עם מסד נתונים מותאמים אישית

1. שיטה מבוססת מקדם דמיון
   1. צור השוואה וליצור dendrogram מבוסס על ספקטרום המוני ברמה "לשכפל טכני" כמתואר בשלב 4.3.3. שמור את dendrogram להשוואה של דמיון.
   2. בחר ספקטרום מסה לא ידוע, ולחץ על "ניתוח> זהה את הערכים שנבחרו". תיבת הדו-שיח זיהוי מופיעה.
   3. בחר ", המבוסס ההשוואה" הסוג מסווג (או classif מאוחסןIER) ולחץ על "הבא". בעמוד הבא, לבחור את dendrogram נשמר כהשוואת התייחסות ולאחר מכן לחץ על "הבא".
   4. בחר "דמיון בסיסי" כשיטת זיהוי ולאחר מכן לחץ על "הבא".
   5. בחר "דמיון המרבי" כשיטת ניקוד. הקלד בערכי סף מתאימים וערכי הבדל מזערי לכל פרמטר ולאחר מכן לחץ על "הבא".
   6. ברגע שהחישובים הושלמו, חלון ההזדהות מופיע. בפנל "תוצאות", החברים של מסד הנתונים המתאימים ביותר ללא ידוע מופיעים ברשימה.
   7. שמור את פרויקט זיהוי ולאמת את זיהוי באמצעות הפקודה "אימות צולבת ניתוח" בפנל "פרויקט זיהוי".
2. שיטה מבוססת סמן ביולוגי פוטנציאלית
   1. להגדיר שיעורי שיא. בחלון "מטריקס כרייה", בוחר בקבוצה של פסגות שיתוף מאפיינים משותפים ולהגדיר פסגות אלה כספציפייםשיעורי שיא הפיק (סמנים ביולוגיים פוטנציאליים) באמצעות "ספקטרה> ניהול סוגי מעמד שיא ..." ב" חלון ההשוואה ".
   2. כאן, להגדיר שיעורי שיא ספציפיים לכל בודד לכל 15 הבידודים.
   3. בחר את הספקטרום ההמוני של אלמונים ולהתאים את הפסגות של ספקטרום אלה לשיעורי שיא המוגדרים כפי שתואר לעיל.

תוצאות

מסדי נתונים שנבנו בהפגנה זו היו ארבע רמות, מגבוה ביותר לנמוך ביותר, הכולל את "כל הרמות",, "לשכפל ביולוגי" "מינים" ו- "לשכפל טכני", בהתאמה (איור 1 א). הרמה "הטכנית לשכפל" הכילה את כל ספקטרום העיבוד המקדים של משכפל טכני. "לשכפל הביולוגי...

Discussion

הפגנה זו הראתה נהלים מפורטים של אפיון וזיהוי של חיידקים באמצעות MALDI-TOF MS ומסד נתונים מותאמים אישית. בהשוואה לשיטות מולקולריות מסורתיות, למשל, שיטות טביעת אצבע רצף 16S rDNA, מבוססות MS MALDI-TOF להקל זיהוי מהיר יותר של חיידקים שונים. בגלל חוסנה, בטכניקה זו נעשתה שימוש נרחב כדי לא...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid	ACROS Organics	163440050	≥ 97%, CAS 28168-41-8
Bruker FlexControl software	Bruker Daltonics		version 3.0
Bruker FlexAnalysis software	Bruker Daltonics		version 3.0
Bionumerics software	Applied Maths		version 7.1