L'utilisation de MALDI-TOF spectrométrie de masse et une base de données personnalisée pour caractériser les bactéries indigènes à un environnement unique Cave (Kartchner, AZ, USA)

Résumé

This work details procedures for rapid identification of bacteria using MALDI-TOF MS. The identification procedures include spectrum acquisition, database construction, and follow up analyses. Two identification methods, similarity coefficient-based and biomarker-based methods, are presented.

Résumé

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, strain levels. Commercially available and open source software tools have been developed to facilitate identification; however, no universal/standardized data analysis pipeline has been described in the literature. Here, we provide a comprehensive and detailed demonstration of bacterial identification procedures using a MALDI-TOF mass spectrometer. Mass spectra were collected from 15 diverse bacteria isolated from Kartchner Caverns, AZ, USA, and identified by 16S rDNA sequencing. Databases were constructed in BioNumerics 7.1. Follow-up analyses of mass spectra were performed, including cluster analyses, peak matching, and statistical analyses. Identification was performed using blind-coded samples randomly selected from these 15 bacteria. Two identification methods are presented: similarity coefficient-based and biomarker-based methods. Results show that both identification methods can identify the bacteria to the species level.

Introduction

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus, species, and in some cases, strain levels^1-4. MALDI-TOF MS ionizes biological molecules (typically proteins) that originate from cell surfaces, intracellular membranes, and ribosomes from bacterial whole cells or protein extracts^1,5. The resulting peaks form characteristic patterns or “fingerprints” of the bacteria analyzed¹. Identification of bacteria is based on these mass-to-charge “fingerprints”.

Two of the most commonly used identification strategies are library-based and bioinformatics-based strategies¹. Library-based approaches involve comparing the mass spectra of unknowns to previously collected mass spectra of known bacteria in databases/libraries for identification. Commercially available software, such as BioNumerics, Biotyper, and SARAMIS software packages, as well as open source software tools, such as SpectraBank⁶, are available to facilitate the comparison and quantification of similarity between mass spectra of unknowns and reference bacteria. Bioinformatics-based approaches usually rely on fully sequenced genomes of bacteria for identification. In contrast to library-based approaches which do not involve identification of the biological nature of particular peaks, bioinformatics-based approaches involve protein identification¹.

The majority of recent MALDI fingerprint-based studies have used library-based approaches to identify bacteria¹. Library-based approaches require construction of databases and comparison of the similarity between mass spectra. Studies show that many experimental procedures, such as medium^3,7, cultivation time⁸, sample preparation method³, and matrix used⁹, affect the mass spectra obtained. Furthermore, some closely-related species and strains generate spectra with only subtle differences. Thus, library-based approaches require rigorously standardized procedures to generate highly reproducible mass spectra between replicates. Minor variations in protocols may compromise the efficacy of identification, especially at the subspecies and strain levels^1,3,10. However, neither manufacturer-provided reference databases nor reported custom databases include visually documented procedures for database construction and/or application of a data analysis pipeline. For this reason, the objective of this work was to develop, apply, and demonstrate a comprehensive and detailed procedure for library-based bacterial identification using MALDI-TOF MS.

In this demonstration, mass spectra of 15 bacteria isolated from a karstic environment (Kartchner Cavern, AZ, USA) were collected and imported into software to construct a model database. Data processing and the analysis pipeline were detailed using the model database. Finally, mass spectra of blind-coded bacteria which were randomly selected from these 15 bacteria were collected again and compared to the reference spectra in the model database for identification. Results show that bacteria can be correctly identified either based on similarity coefficients or potential biomarkers/peak classes.

Protocole

Attention: les bactéries non identifiés de ne importe quel environnement peuvent être pathogènes et doivent être manipulés avec prudence en utilisant des protocoles de biosécurité appropriées. Travailler avec des cultures vivantes doit être effectuée dans une armoire de biosécurité de classe II en utilisant de sécurité biologique de niveau 2 (BSL-2) procédures. Plus d'informations sur BSL-2 procédures est disponible dans le manuel CDC / NIH intitulé «prévention des risques biotechnologiques en laboratoires microbiologiques et biomédicaux», pages 33-38. Le document est disponible en ligne à http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf . Équipement de protection individuelle (EPI), y compris les sarraus de laboratoire / robes, des lunettes de sécurité et des gants en nitrile ou en latex, doit être porté. Pratiques et précautions microbiologiques standards doivent être respectées, et des déchets biologiques dangereux doivent être éliminés de façon appropriée.

Bactéries utilisées dans cette démonstration ont été isolés à partir Kartchner,AZ, États-Unis, à partir de quatre environnements, y compris spéléothème sèche, la pierre de flux, spéléothème humide et stalactite goutte à goutte (tableau 1). Tous les isolats ont été identifiés par séquençage de l'ADNr 16S et conservés à -80 ° C dans 25% de glycérol-R milieu _2B. Toutes les expériences ont été réalisées à température ambiante.

Note: Nous vous recommandons d'utiliser la même méthode de préparation d'échantillon d'acquérir des spectres de masse pour la construction de base de données et les spectres de masse d'inconnues. Méthode de préparation des échantillons a été montré précédemment affecter la qualité du spectre et la reproductibilité ^3. En utilisant une méthode de préparation d'échantillon différent peut provoquer une mauvaise identification d'inconnus, surtout quand résolution taxonomique plus élevé (par exemple, au niveau de la souche) est souhaitée.

1. dépôt sur la cible MALDI

Attention: Plusieurs protocoles d'obtenir des extraits de protéines nécessitent l'utilisation d'acides et de solvants organiques qui doivent être utilisé conformément aux guidElines et informations contenues dans leurs fiches respectives de données de sécurité des matériaux (MSDS). EPI approprié doit être porté et variera en fonction des type et le volume des produits chimiques utilisés (par exemple, sarraus de laboratoire / robes, des gants, des lunettes de sécurité, et la protection respiratoire doit être utilisée lorsque vous travaillez avec des quantités importantes de solvants toxiques et inflammables, tels que l'acétonitrile, et des acides corrosifs, tels que les acides formique et trifluoroacétique).

1. Dépôt de 1 pi d'extrait de protéine ne contenant pas de cellules viables (obtenues à l'aide de protocoles appropriés, décrits précédemment ^{11 à 13)} sur une plaque de cible MALDI en acier inoxydable et le laisser sécher. Superposer l'extrait protéinique séchée avec une solution de matrice ul (α-cyano-4-hydroxy-cinnamique solution d'acide), et laisser sécher.
2. Pour chaque répétition biologique, repérer un nombre approprié de répétitions techniques (5-20 réplicats techniques). Ici, repérer 10 répétitions techniques pour chaque répétition biologique et trois répétitions biologiques were préparé.
   Note: Nous recommandons d'utiliser un MALDI plaque cible en acier poli en utilisant la méthode de préparation des échantillons d'extraction de protéines. Utilisation des plaques cibles de masse d'acier peut provoquer une contamination accidentelle et la propagation des différents échantillons à l'extérieur du puits d'échantillon individuels.
3. Dépôt 1 ul norme d'étalonnage sur la plaque cible et laisser sécher. Superposition avec une solution de matrice de pi et laisser sécher.
4. Dépôt solution de 2 ul de matrice sur la plaque cible en tant que témoin négatif.

2. Acquisition spectres de masse

1. Utilisez un spectromètre de masse MALDI-TOF équipé d'un laser d'azote (λ = 337 nm) et exploité en utilisant un logiciel Bruker FlexControl.
2. Recueillir chaque spectre de masse en mode linéaire positive par l'accumulation de 500 tirs laser par incréments de 100 tir. Régler la tension source d'ions 1 à 20 kV; tension de la source d'ions 2 18,15 kV; et la tension de la lentille à 9,05 kV. A noter que ces paramètres sont instrument spécific et pourrait nécessiter un ajustement sur d'autres instruments pour obtenir des résultats optimaux.
3. Définissez la plage de masse-charge pour l'évaluation automatisée du spectre 2-20 kDa par charge. Utiliser l'algorithme de détection de pic centroïde. Réglez le seuil minimum de la résolution à 100 Da. Réglez le rapport signal sur bruit (S: N) seuil à 2. Réglez le seuil d'intensité minimum à 100.

3. Base de données Construction

1. la conception de base de données
   1. Créer une nouvelle base de données dans BioNumerics 7.1 utilisant le "Nouvel assistant de base de données".
   2. Créer un type d'expérimentation du spectre, par exemple, Maldi, en utilisant les commandes dans le panneau "Types de Experiment".
   3. Créez les niveaux en utilisant le "panneau de conception de base de données". Ajouter de nouveaux niveaux en utilisant le "Niveau> Ajouter nouveau niveau ..." commande dans le menu "Base de données". Ici, créer des "espèces" niveau ", réplique biologique" niveau "et" répétition technique "niveau, respectivEly.
2. Importation et prétraitement des spectres de masse brute
   1. Exporter les spectres de masse brute sous forme de fichiers .txt utilisant Flexanalysis en cliquant sur le "Exporter> Spectre de masse" dans le menu "Fichier".
   2. Importez les spectres de masse brute (fichiers .txt) dans la base de données dans le niveau des répétitions techniques.
   3. Prétraiter les spectres de masse brute.
      1. Importation et rééchantillonnage (en utilisant un algorithme d'ajustement quadratique).
      2. Effectuer une soustraction de ligne de base (avec un disque de roulement avec une taille de 50 points).
      3. Calculer le bruit [transformation en ondelettes continue (CWT)], lisse (Kaiser Fenêtre avec une taille de fenêtre de 20 points et bêta de 10 points), et effectuer une seconde soustraction de base (laminage disque avec la taille de 200 points).
      4. Détecter des pics [CWT avec un signal minimum sur bruit (S: N) 10].
   4. Après prétraitement, mémoriser les motifs caractéristiques de chaque spectre de masse, tels que les listes de pointe contenant pictailles, des intensités de pointe, S: N, etc., dans la base de données.
3. Création spectre de masse composite
   1. Créer spectres composite à partir des spectres prétraités à l'aide de la commande "Résumer ..." dans le menu "Analyse". Choisissez l'option "répétition biologique» comme niveau cible.
   2. Ici, combiner les spectres de masse de 10 répétitions techniques de la même colonie pour obtenir un spectre de masse composite pour cette colonie, résultant en trois spectres de masse composite pour que isolat au niveau "répliqué biologique".
   3. Ici, résumer les trois spectres composite pour créer une spectre composite pour qui isolent au niveau «espèces».
      Remarque: Le spectre composite est la moyenne de point par point des répétitions techniques. Réplique d'une similitude (de corrélation de Pearson) à la moyenne inférieure à 95% (réglage par défaut) sont exclus du composite. Les pics sur le spectre composite sont appelés seulement se ils sont présents dans 75% (réglage par défaut) des répétitions incluses. Pour les répétitions biologiques, ces paramètres étaient de 90 et 60%, respectivement.

Analyse 4. Spectre de masse de données

1. Sélectionnez les entrées dans la base de données et de créer une comparaison en cliquant sur la commande "Créer un nouveau rapport" dans le panneau "comparaisons".
2. Ici, utiliser les spectres de masse à la "répétition technique" et / ou les niveaux "répétés biologique" pour montrer des comparaisons et des analyses.
3. Analyse de cluster basé similarité et l'analyse multidimensionnelle (MDS)
   1. Créer des groupes avec des couleurs. Sélectionnez les trois biologique spectre de masse composite et cliquez sur "Créer un nouveau groupe de la sélection" commande dans le menu "Groupes" pour créer un groupe pour l'isolat correspondante. Désigner une couleur automatiquement utilisé pour ces trois spectres de masse.
   2. Alternativement, définir des états de terrain avec des couleurs correspondantes en utilisant les commandes dans le "Base de données entrées panel "de telle sorte que tout groupement basée sur ce champ défini utilise la même couleur définie pour ce groupe.
   3. Effectuer une analyse cluster. Cliquez sur la commande "Calculer l'analyse de cluster» dans le menu «Clustering». Sur la comparaison des paramètres Page 1, sélectionnez le «corrélation de Pearson" et laissez les autres paramètres par défaut. À la page 2, sélectionnez "UPGMA". Puis cliquez sur "Terminer".
   4. Obtenir un complot MDS utilisant la "mise à l'échelle multidimensionnelle ..." commande dans le menu "Statistiques".
4. Appariement pic
   1. Cliquez sur le type de spectre "Maldi" dans le panneau "expériences". Ensuite, sélectionnez "Mise en page> Voir l'image". Spectra sont présentés comme des bandes de gel.
   2. Effectuer une comparaison pic en utilisant la commande "faire de la correspondance pic" dans le menu "Spectra".
5. Identification des classes de pointe
   1. Effectuer l'analyse en composantes principales (ACP). Mettez en surbrillance le "Maldi "type de l'expérience dans le" expérimentale "panneau et utiliser le" Analyse en Composantes Principales ... "dans le menu" statistique "pour effectuer PCA.
   2. Effectuer regroupement dans les deux sens. Cliquez sur le "Statistiques> minière Matrix" ... dans la fenêtre "Comparaison". L'intensité des pics appariés aux classes de pointe est représenté en utilisant des couleurs différentes (carte de chaleur).

5. Les bactéries d'identification avec une base de données personnalisée

1. Méthode fondée sur la similarité coefficient-
   1. Créer une comparaison et de générer un dendrogramme basé sur des spectres de masse au niveau "répliqué technique" tel que décrit à l'étape 4.3.3. Enregistrez le dendrogramme de comparaison de similitude.
   2. Sélectionnez un spectre de masse inconnue, et cliquez sur le "Analyse> Identifier entrées sélectionnées". La boîte de dialogue d'identification apparaît.
   3. Sélectionnez le "Comparaison basée" type de classificateur (ou un classif stockéeIER) et cliquez sur "suivant". Sur la page suivante, choisissez le dendrogramme enregistré comme une comparaison de référence, puis cliquez sur "Suivant".
   4. Choisissez l'option "similitude de base" comme une méthode d'identification et puis cliquez sur "Suivant".
   5. Choisissez l'option "similitude maximale» comme méthode de notation. Tapez les valeurs de seuil appropriées et valeurs de différence minimum pour chaque paramètre, puis cliquez sur "Suivant".
   6. Une fois les calculs sont terminés, la fenêtre d'identification apparaît. Dans le panneau "Résultats", les membres de la base de données qui correspondent le mieux l'inconnu sont répertoriés.
   7. Enregistrez le projet d'identification et valider l'identification en utilisant le "analyse de validation croisée" dans le panneau "projet d'identification".
2. Méthode basée sur les biomarqueurs potentiel
   1. Définir des classes de pointe. Dans la fenêtre «Matrix Mining", sélectionner des ensembles de pics des caractéristiques communes et de définir ces pics que spéciles classes fic de pointe (biomarqueurs potentiels) en utilisant "Spectra> Gérer les types de classe de pointe ..." dans la fenêtre "Comparaison".
   2. Ici, définir des classes de pointe spécifiques pour chaque isolent pour tous les 15 isolats.
   3. Sélectionner les spectres de masse d'inconnues et faire correspondre les sommets de ces spectres pour les classes de pointe définis comme précédemment décrit.

Résultats

Les bases de données construites à cette manifestation avaient quatre niveaux, du plus haut au plus bas niveau, y compris "tous les niveaux", "répétition biologique" "Species" et "répétition technique", respectivement (figure 1A). La "répétition technique" niveau contenait tous les spectres prétraitée de répétitions techniques. La "répétition biologique" et les niveaux «espèce» contenaient le composite (résumé) spectres. &quo...

Discussion

Cette démonstration a montré des procédures détaillées de caractérisation et d'identification des bactéries utilisant MALDI-TOF MS et une base de données personnalisée. En comparaison avec les méthodes moléculaires classiques, par exemple, les méthodes d'empreintes digitales MS-séquençage de l'ADNr 16S, MALDI-TOF de faciliter une identification plus rapide des diverses bactéries. En raison de sa robustesse, cette technique est largement utilisée pour caractériser les bactéries, les virus, l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid	ACROS Organics	163440050	≥ 97%, CAS 28168-41-8
Bruker FlexControl software	Bruker Daltonics		version 3.0
Bruker FlexAnalysis software	Bruker Daltonics		version 3.0
Bionumerics software	Applied Maths		version 7.1