JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

This work details procedures for rapid identification of bacteria using MALDI-TOF MS. The identification procedures include spectrum acquisition, database construction, and follow up analyses. Two identification methods, similarity coefficient-based and biomarker-based methods, are presented.

Özet

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, strain levels. Commercially available and open source software tools have been developed to facilitate identification; however, no universal/standardized data analysis pipeline has been described in the literature. Here, we provide a comprehensive and detailed demonstration of bacterial identification procedures using a MALDI-TOF mass spectrometer. Mass spectra were collected from 15 diverse bacteria isolated from Kartchner Caverns, AZ, USA, and identified by 16S rDNA sequencing. Databases were constructed in BioNumerics 7.1. Follow-up analyses of mass spectra were performed, including cluster analyses, peak matching, and statistical analyses. Identification was performed using blind-coded samples randomly selected from these 15 bacteria. Two identification methods are presented: similarity coefficient-based and biomarker-based methods. Results show that both identification methods can identify the bacteria to the species level.

Giriş

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus, species, and in some cases, strain levels1-4. MALDI-TOF MS ionizes biological molecules (typically proteins) that originate from cell surfaces, intracellular membranes, and ribosomes from bacterial whole cells or protein extracts1,5. The resulting peaks form characteristic patterns or “fingerprints” of the bacteria analyzed1. Identification of bacteria is based on these mass-to-charge “fingerprints”.

Two of the most commonly used identification strategies are library-based and bioinformatics-based strategies1. Library-based approaches involve comparing the mass spectra of unknowns to previously collected mass spectra of known bacteria in databases/libraries for identification. Commercially available software, such as BioNumerics, Biotyper, and SARAMIS software packages, as well as open source software tools, such as SpectraBank6, are available to facilitate the comparison and quantification of similarity between mass spectra of unknowns and reference bacteria. Bioinformatics-based approaches usually rely on fully sequenced genomes of bacteria for identification. In contrast to library-based approaches which do not involve identification of the biological nature of particular peaks, bioinformatics-based approaches involve protein identification1.

The majority of recent MALDI fingerprint-based studies have used library-based approaches to identify bacteria1. Library-based approaches require construction of databases and comparison of the similarity between mass spectra. Studies show that many experimental procedures, such as medium3,7, cultivation time8, sample preparation method3, and matrix used9, affect the mass spectra obtained. Furthermore, some closely-related species and strains generate spectra with only subtle differences. Thus, library-based approaches require rigorously standardized procedures to generate highly reproducible mass spectra between replicates. Minor variations in protocols may compromise the efficacy of identification, especially at the subspecies and strain levels1,3,10. However, neither manufacturer-provided reference databases nor reported custom databases include visually documented procedures for database construction and/or application of a data analysis pipeline. For this reason, the objective of this work was to develop, apply, and demonstrate a comprehensive and detailed procedure for library-based bacterial identification using MALDI-TOF MS.

In this demonstration, mass spectra of 15 bacteria isolated from a karstic environment (Kartchner Cavern, AZ, USA) were collected and imported into software to construct a model database. Data processing and the analysis pipeline were detailed using the model database. Finally, mass spectra of blind-coded bacteria which were randomly selected from these 15 bacteria were collected again and compared to the reference spectra in the model database for identification. Results show that bacteria can be correctly identified either based on similarity coefficients or potential biomarkers/peak classes.

Protokol

Dikkat: Herhangi bir ortamdan kimliği belirsiz bakteriler patojenik olabilir ve uygun biyogüvenlik protokollerini kullanarak dikkatle ele alınması gerekir. Canlı kültürlerle çalışmak Biyolojik Güvenlik Seviyesi 2 (BSL-2) prosedürler kullanılarak Sınıf II biyogüvenlik kabini yapılmalıdır. BSL-2 prosedürleri hakkında daha fazla bilgi sayfaları 33-38 "Mikrobiyolojik ve Biyomedikal Laboratuvarlar, Biyogüvenlik" CDC / NIH başlıklı el kitabında, mevcuttur. Belge online kullanılabilir http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf . Laboratuar kat / önlük, gözlük, ve nitril veya lateks eldiven dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE), giyilmelidir. Standart mikrobiyolojik uygulamalar ve önlemler takip edilmelidir, ve biyolojik tehlikeli atıklar uygun atılmalıdır.

Bu tasvirde kullanılan bakteriler Kartchner Caverns izole edilmiştir,AZ, ABD, kuru speleothem, akış taş, nemli speleothem ve sarkıt damla (Tablo 1) olmak üzere dört ortamlarda, gelen. Tüm izolatlar 16S rDNA sekanslama ile tanımlanır ve% 25 gliserol-R2 B ortamında -80 ° C 'de muhafaza edilmiştir. Bütün deneyler, oda sıcaklığında tamamlanmıştır.

Not: Biz veritabanı inşaat ve bilinmeyenler kütle spektrumları için kütle spektrumları elde etmek aynı numune hazırlama yöntemi kullanmanızı öneririz. Numune hazırlama yöntemi, spektrum kalitesi ve tekrarlanabilirlik 3 etkiler, daha önce gösterilmiştir. Farklı bir örnek hazırlama yöntemi kullanılarak istenen (soy düzeyinde, örneğin,) bilinmeyenler yanlış kimlik, özellikle yüksek taksonomik çözünürlük neden olabilir.

MALDI Hedef 1. Biriktirme

Dikkat: Birçok protokol protein ekstreleri guid uygun olarak kullanılabilir olması gerekir asitler ve organik çözücülerin kullanımını gerektirmez elde etmek üzerekendi Malzemeler Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) yer alan rehber ilkeleriniz ve bilgi. Uygun KKD giyilmelidir ve kullanılan kimyasalların türüne ve hacmine bağlı olarak değişiklik olacaktır (örn, asetonitril gibi zehirli, yanıcı solventler önemli miktarlarda, çalışırken / önlük, eldiven, koruyucu gözlük ve solunum koruma kullanılması gerekir laboratuvar mont, ve formik ve triflüoroasetik asitler gibi aşındırıcı asitler).

  1. Paslanmaz çelik MALDI hedef plaka üzerine ve kurumasına izin (uygun, daha önce açıklanan protokolleri 11-13 kullanılarak elde edilen) hiçbir canlı hücreleri içeren protein ekstresi ul Mevduat 1. 1 ul matris solüsyonuna (α-siyano-4-hidroksi-sinnamik asit çözeltisi) ile kurutuldu, bir protein ekstresi Yerleşimi ve kurutun.
  2. Her biyolojik tekrarında için, teknik çoğaltır (5 ila 20 teknik çoğaltır) uygun sayıda nokta. Burada, her bir biyolojik tekrarında için 10 teknik çoğaltır ve 3 biyolojik çoğaltır w noktaere hazırladı.
    Not: Protein ekstraksiyon numune hazırlama yöntemi kullanırken bir cilalı MALDI çelik hedef plaka kullanmanızı öneririz. Zemin çelik hedef plakaları kullanılarak yayılan ve bireysel örnek kuyuların dışında farklı örneklerinin kasıtsız karıştırma neden olabilir.
  3. Depozito 1 ul kalibrant hedef plakası üzerine standart ve kurumaya bırakın. 1 ul matris çözümü ile Yerleşimi ve kurumaya bırakın.
  4. Bir negatif kontrol olarak, hedef plaka üzerinde birikmesine 2 ul matris çözeltisi.

2. Kütle Spektrumu Toplama

  1. Bir azot lazer (λ = 337 nm) ile donatılmış bir MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanarak ve Bruker FlexControl yazılımı kullanılarak işletilmektedir.
  2. 100 atış artışlarla 500 lazer çekim birikimi ile pozitif doğrusal modda her kitle spektrumu toplayın. 20 kV iyon kaynağı 1 gerilim ayarlayın; iyon kaynağı 2 gerilimi 18.15 kV; ve 9.05 kV objektif gerilimi. Bu parametreler enstrüman-spesifik olduğunu unutmayınve fic optimum sonuçlar elde etmek için, diğer araçlara ayarlama gerektirebilir.
  3. Şarj başına 2 ila 20 kDa gelen otomatik spektrum değerlendirilmesi için kütle-ücret aralığını ayarlayın. Sentroid pik algılama algoritması kullanın. 100 Da minimum çözünürlük eşiğini ayarlayın. 100 minimum yoğunluk eşiği ayarlayın 2 de eşik: gürültü oranı (N S) sinyali ayarlayın.

3. Veritabanı İnşaat

  1. Veritabanı tasarımı
    1. "Yeni veritabanı sihirbazını" kullanarak BioNumerics 7.1 yeni bir veritabanı oluşturun.
    2. "Deney Türleri" panelinde komutlarını kullanarak bir spektrum deney türü, örneğin, MALDI oluşturun.
    3. "Veritabanı tasarım paneli" kullanarak seviyeleri oluşturun. Kullanarak yeni seviyeleri ekle "Veritabanı" menüsünden komutu "Seviye> yeni bir seviyeye Ekle ...". Burada, "Türler" seviye "Biyolojik çoğaltmak" düzeyi "ve" Teknik çoğaltmak "seviye, respectiv oluşturmakely.
  2. İthalat ve ham kitle spektrumları önişleme
    1. "Dosya" menüsünden "Export> Kütle spektrumu" komutunu tıklayarak FlexAnalysis kullanarak txt dosyaları gibi ham kitle spektrumları verin.
    2. Teknik çoğaltır düzeyinde veritabanına ham kütle spektrumları (.txt dosyaları) İthalat.
    3. Ham kütle spektrumları preprocess.
      1. İthalat ve yeniden örnekleme (bir kuadratik uydurma algoritması kullanarak).
      2. (50 puan arasında bir boyutu olan bir dönme diski ile birlikte), bir taban çıkarır.
      3. (Bir pencere 20 puan büyüklüğü ve 10 puan beta Kaiser Pencere) gürültü [Sürekli Dalgacık Dönüşümü (CVVT)], pürüzsüz hesaplayınız, ve ikinci bir temel çıkarma (200 puan boyutu diski haddeleme) gerçekleştirin.
      4. [: 10 (N S) gürültü oranı minimum sinyal ile CWT] doruklarına algılar.
    4. Ön işleme sonra, böyle bir zirveye içeren pik listeleri gibi her kitle spektrum karakteristik desenler, kaydetmekboyutları, tepe yoğunlukları, S: veri tabanında bulunan, N, vb.
  3. Kompozit kitle spektrumları oluşturma
    1. "Analiz" menüsünden "... özetler" komutunu kullanarak ön işlenmiş spektrumları kompozit spektrumları oluşturun. Hedef seviye olarak "Biyolojik çoğaltmak" seçiniz.
    2. Burada, "Biyolojik çoğaltmak" düzeyde olduğu izolat için üç kompozit kütle spektrumları sonuçlanan, o koloni için bir kompozit kütle spektrumu elde etmek üzere aynı koloninin 10 teknik çoğaltır kütle spektrumları birleştirir.
    3. Burada, bu "Türler" düzeyinde izole için bir kompozit spektrumu oluşturmak için üç kompozit spektrumları özetler.
      Not: Kompozit spektrum teknik çoğaltır noktası-by-noktaya ortalamasıdır. Daha düşük% 95 (varsayılan ayar) ortalama bir benzerlik (Pearson korelasyon) ile çoğaltır kompozit dışındadır. Bunlar (% 75 mevcutsa, bileşik spektrumları zirveleri sadece adlandırılırdahil çoğaltır varsayılan ayar). Biyolojik çoğaltır için, bu ayarlar sırasıyla, 90 ve% 60 idi.

4. Kütle Spektrumu Veri Analizi

  1. Veritabanında girdileri seçin ve "Karşılaştırmalar" panelinde "Yeni bir karşılaştırma oluştur" komutunu tıklayarak bir karşılaştırma oluşturmak.
  2. Burada, karşılaştırmalar ve analizler göstermek için "Teknik tekrarında" ve / veya "Biyolojik çoğaltmak" seviyelerde kütle spektrumları kullanın.
  3. Benzerlik tabanlı küme analizi ve çok boyutlu ölçekleme (MDS)
    1. Renklerle grupları oluşturun. Üç biyolojik kompozit kitle spektrumları seçin ve ilgili izolat için bir grup oluşturmak için "Gruplar" menüsünden komut "seçim Oluştur yeni grup" tıklayın. Otomatik olarak bu üç kütle spektrumları için kullanılan bir renk belirleyin.
    2. Alternatif olarak, komutları kullanarak gelen renkler ile saha durumlarını tanımlamak "Bu tanımlanmış alana dayalı herhangi bir gruplaşma, bu grup için belirlenmiş aynı renk kullanan şekilde Veritabanı girişleri "paneli.
    3. Küme analizi yapın. "Kümelenme" menüsünden "küme analizi Hesapla" komutunu tıklayın. Karşılaştırma ayarları Page 1 tarihinde, "Pearson korelasyon" seçin ve varsayılan olarak diğer parametreleri bırakın. 2. sayfada, "UPGMA" seçeneğini seçin. Ardından "Finish" tıklayınız.
    4. "İstatistik" menüsünde bir MDS kullanarak komplo "Çok boyutlu ölçekleme ..." komutunu edinin.
  4. Tepe eşleştirme
    1. "Deneyler" panelinde spektrum türü "Maldi" üzerine tıklayın. Ardından "Düzen> Show görüntü" seçeneğini seçin. Spectra jel bantlar olarak gösterilmektedir.
    2. "Spectra" menüsünden "zirve eşleştirme yapın" komutunu kullanarak pik eşleştirme gerçekleştirin.
  5. Pik sınıfların tanımlanması
    1. Temel bileşen analizi (PCA) gerçekleştirin. Vurgulayın "Maldi Deneysel "deney tip" "paneli ve kullanımı" PCA gerçekleştirmek için İstatistiksel "menüsünden" komutu "Temel Bileşenler Analizi ....
    2. İki yönlü kümeleme gerçekleştirin. "Karşılaştırma" penceresinde "İstatistik> Matrix madencilik" ... tıklayınız. pik sınıflara eşleşen piklerin yoğunluğu farklı renkler (ısı haritası) kullanılarak temsil edilir.

Özel bir veritabanı ile 5. Bakteri Tanımlama

  1. Benzerlik katsayısı tabanlı yöntem
    1. Bir karşılaştırma oluşturun ve adım 4.3.3 açıklandığı gibi "Teknik çoğaltmak" düzeyinde kütle spektrumları dayalı bir dendrogram oluşturur. Benzerlik karşılaştırma için dendrogram kaydedin.
    2. "Seçili girdileri tanımlamak> Analizi" bilinmeyen bir kitle spektrumu seçin ve tıklatın. kimlik iletişim kutusu görüntülenir.
    3. "Karşılaştırma merkezli" sınıflandırıcı türü (veya depolanmış Klasmanı seçinier) ve "sonraki" butonuna tıklayınız. Bir sonraki sayfada, bir referans karşılaştırma olarak kaydedilir dendrogram seçin ve ardından "next" tıklayın.
    4. Bir tanımlama yöntemi olarak "Temel benzerlik" seçin ve sonra "next" butonuna tıklayınız.
    5. Skorlama yöntemi olarak "Maksimum benzerlik" seçiniz. Her parametre için uygun eşik değerleri ve minimum fark değerlerini yazın ve ardından "sonraki" butonuna tıklayınız.
    6. Hesaplamalar tamamlandıktan sonra, kimlik penceresi görüntülenir. "Sonuçlar" panelinde, iyi bilinmeyen maç veritabanının üyeleri listelenir.
    7. Kimlik Projeyi kaydedin ve "Kimlik projesi" panelinde "çapraz-doğrulama analizi" komutunu kullanarak kimlik doğrulamak.
  2. Potansiyel biyobelirtecin-tabanlı yöntem
    1. Pik sınıfları tanımlar. "Matrix Madencilik" penceresinde, ortak özelliklere paylaşan piklerin setleri seçmek ve speci olarak bu zirveleri tanımlamakfic zirve sınıfları (olası belirteçler) kullanarak "Spectra> zirve sınıf türleri ... Yönet" "Karşılaştırma penceresinde" de.
    2. Burada, 15 izolatın için izole her biri için özel zirve sınıfları tanımlar.
    3. Bilinmeyenlerin kütle spektrumları seçin ve daha önce tarif edildiği gibi tanımlanan tepe sınıflar bu spektrumları tepe eşleşir.

Sonuçlar

Bu gösteriye inşa veritabanları "Türler", "Biyolojik tekrarında" ve "Teknik tekrarında", sırasıyla (Şekil 1A), olmak üzere "Tüm seviyeler" en yüksekten en düşük seviyesine dört düzeyleri, vardı. "Teknik tekrarlanan" düzey teknik çoğaltır tüm ön işlenmiş spektrumları içeriyordu. "Biyolojik tekrarlanan" ve "Türler" düzeyleri kompozit (özet) spektrumları içeriyordu. "Tüm seviyeler" tüm teknik ...

Tartışmalar

Bu gösteri karakterizasyonu ve MALDI-TOF MS ve özel veritabanı kullanılarak bakterilerin tanımlanması detaylı prosedürler gösterdi. Örneğin, geleneksel moleküler yöntemler ile karşılaştırıldığında, 16S rDNA dizileme, MALDI-TOF MS tabanlı parmak yöntemleri, çeşitli bakterilerin daha hızlı belirlenmesini kolaylaştırmaktadır. Nedeniyle sağlamlığı nedeniyle bu teknik yaygın ortamdan ve klinik 1,14-16 bakteriler, virüsler, mantarlar ve maya karakterize etmek için kullanılır. ...

Açıklamalar

Authors Vranckx and Janssens are employees of Applied Maths NV, the manufacturer of data analysis software used in this video. Applied Maths NV provided select software modules highlighted in this video as well as a portion of the publication costs associated with this video.

Teşekkürler

This work was supported by the New College of Interdisciplinary Arts and Sciences at Arizona State University, Applied Maths NV, and by the National Science Foundation (ROA Supplement to Award No. MCB0604300). Any opinions, findings, and conclusions or recommendations expressed in this material are those of the author(s) and do not necessarily reflect the views of the National Science Foundation.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acidACROS Organics163440050≥ 97%, CAS 28168-41-8
Bruker FlexControl softwareBruker Daltonicsversion 3.0
Bruker FlexAnalysis softwareBruker Daltonicsversion 3.0
Bionumerics softwareApplied Mathsversion 7.1

Referanslar

  1. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
  2. Siegrist, T. J., et al. Discrimination and characterization of environmental strains of Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). J Microbiol Meth. 68 (3), 554-562 (2007).
  3. Goldstein, J. E., Zhang, L., Borror, C. M., Rago, J. V., Sandrin, T. R. Culture conditions and sample preparation methods affect spectrum quality and reproducibility during profiling of Staphylococcus aureus with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Lett Appl Microbiol. 57 (2), 144-150 (2013).
  4. Benagli, C., et al. A rapid MALDI-TOF MS identification database at genospecies level for clinical and environmental Aeromonas strains. Plos One. 7 (10), (2012).
  5. Sauer, S., Kliem, M. Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 74-82 (2010).
  6. Bohme, K., et al. SpectraBank: An open access tool for rapid microbial identification by MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 33 (14), 2138-2142 (2012).
  7. Walker, J., Fox, A. J., Edwards-Jones, V., Gordon, D. B. Intact cell mass spectrometry (ICMS) used to type methicillin-resistant Staphylococcus aureus: media effects and inter-laboratory reproducibility. J Microbiol Meth. 48 (2-3), 117-126 (2002).
  8. Ruelle, V., El Moualij, B., Zorzi, W., Ledent, P., De Pauw, E. Rapid identification of environmental bacterial strains by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Sp. 18 (18), 2013-2019 (2004).
  9. Sedo, O., Sedlacek, I., Zdrahal, Z. Sample Preparation Methods for Maldi-MS Profiling of Bacteria. Mass Spectrom Rev. 30 (3), 417-434 (2011).
  10. Swatkoski, S., Russell, S., Edwards, N., Fenselau, C. Analysis of a model virus using residue-specific chemical cleavage and MALDI-TOF mass spectrometry. Anal Chem. 79 (2), 654-658 (2007).
  11. Freiwald, A., Sauer, S. Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry. Nat Protoc. 4 (5), 732-742 (2009).
  12. Drevinek, M., Dresler, J., Klimentova, J., Pisa, L., Hubalek, M. Evaluation of sample preparation methods for MALDI-TOF MS identification of highly dangerous bacteria. Lett Appl Microbiol. 55 (1), 40-46 (2012).
  13. Lasch, P., et al. MALDI-TOF mass spectrometry compatible inactivation method for highly pathogenic microbial cells and spores. Anal Chem. 80 (6), 2026-2034 (2008).
  14. Usbeck, J. C., Kern, C. C., Vogel, R. F., Behr, J. Optimization of experimental and modelling parameters for the differentiation of beverage spoiling yeasts by Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) in response to varying growth conditions. Food Microbiol. 36 (2), 379-387 (2013).
  15. Del Chierico, F., et al. MALDI-TOF MS proteomic phenotyping of filamentous and other fungi from clinical origin. J Proteomics. 75 (11), 3314-3330 (2012).
  16. Vitale, R., Roine, E., Bamford, D. H., Corcelli, A. Lipid fingerprints of intact viruses by MALDI-TOF/mass spectrometry. Bba-Mol Cell Biol L. 1831 (4), 872-879 (2013).
  17. Zhang, L., Borror, C. M., Sandrin, T. R. A designed experiments approach to optimization of automated data acquisition during characterization of bacteria with MALDI-TOF mass spectrometry. Plos One. 9 (3), (2014).
  18. Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J ClinMicrobiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

evre BilimleriSay 95Kimlikevre bakteriMALDI TOF k tle spektrometresiBioNumericsparmak iziveritabanbenzerlik katsay sBiyomarker

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır