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  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

This work details procedures for rapid identification of bacteria using MALDI-TOF MS. The identification procedures include spectrum acquisition, database construction, and follow up analyses. Two identification methods, similarity coefficient-based and biomarker-based methods, are presented.

Resumo

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, strain levels. Commercially available and open source software tools have been developed to facilitate identification; however, no universal/standardized data analysis pipeline has been described in the literature. Here, we provide a comprehensive and detailed demonstration of bacterial identification procedures using a MALDI-TOF mass spectrometer. Mass spectra were collected from 15 diverse bacteria isolated from Kartchner Caverns, AZ, USA, and identified by 16S rDNA sequencing. Databases were constructed in BioNumerics 7.1. Follow-up analyses of mass spectra were performed, including cluster analyses, peak matching, and statistical analyses. Identification was performed using blind-coded samples randomly selected from these 15 bacteria. Two identification methods are presented: similarity coefficient-based and biomarker-based methods. Results show that both identification methods can identify the bacteria to the species level.

Introdução

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus, species, and in some cases, strain levels1-4. MALDI-TOF MS ionizes biological molecules (typically proteins) that originate from cell surfaces, intracellular membranes, and ribosomes from bacterial whole cells or protein extracts1,5. The resulting peaks form characteristic patterns or “fingerprints” of the bacteria analyzed1. Identification of bacteria is based on these mass-to-charge “fingerprints”.

Two of the most commonly used identification strategies are library-based and bioinformatics-based strategies1. Library-based approaches involve comparing the mass spectra of unknowns to previously collected mass spectra of known bacteria in databases/libraries for identification. Commercially available software, such as BioNumerics, Biotyper, and SARAMIS software packages, as well as open source software tools, such as SpectraBank6, are available to facilitate the comparison and quantification of similarity between mass spectra of unknowns and reference bacteria. Bioinformatics-based approaches usually rely on fully sequenced genomes of bacteria for identification. In contrast to library-based approaches which do not involve identification of the biological nature of particular peaks, bioinformatics-based approaches involve protein identification1.

The majority of recent MALDI fingerprint-based studies have used library-based approaches to identify bacteria1. Library-based approaches require construction of databases and comparison of the similarity between mass spectra. Studies show that many experimental procedures, such as medium3,7, cultivation time8, sample preparation method3, and matrix used9, affect the mass spectra obtained. Furthermore, some closely-related species and strains generate spectra with only subtle differences. Thus, library-based approaches require rigorously standardized procedures to generate highly reproducible mass spectra between replicates. Minor variations in protocols may compromise the efficacy of identification, especially at the subspecies and strain levels1,3,10. However, neither manufacturer-provided reference databases nor reported custom databases include visually documented procedures for database construction and/or application of a data analysis pipeline. For this reason, the objective of this work was to develop, apply, and demonstrate a comprehensive and detailed procedure for library-based bacterial identification using MALDI-TOF MS.

In this demonstration, mass spectra of 15 bacteria isolated from a karstic environment (Kartchner Cavern, AZ, USA) were collected and imported into software to construct a model database. Data processing and the analysis pipeline were detailed using the model database. Finally, mass spectra of blind-coded bacteria which were randomly selected from these 15 bacteria were collected again and compared to the reference spectra in the model database for identification. Results show that bacteria can be correctly identified either based on similarity coefficients or potential biomarkers/peak classes.

Protocolo

Cuidado: bactérias não identificados a partir de qualquer ambiente pode ser patogênica e devem ser manuseados com cuidado, utilizando protocolos de biossegurança adequadas. Trabalhar com culturas vivas deve ser realizada em uma cabine de segurança biológica Classe II utilizando Biológica nível de segurança 2 (BSL-2) procedimentos. Mais informações sobre BSL-2 procedimentos está disponível no manual do CDC / NIH intitulado, "Biossegurança em microbiológicos e Biomédicas Laboratories", páginas 33-38. O documento está disponível online em http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf . Equipamento adequado de proteção individual (EPI), incluindo jalecos / vestidos, óculos de segurança e de borracha nitrílica ou luvas de látex, deve ser usado. Práticas microbiológicos padrão e precauções devem ser seguidas, e os resíduos de risco biológico deve ser descartado de forma adequada.

As bactérias usadas nesta demonstração foram isolados a partir de Kartchner,AZ, EUA, a partir de quatro ambientes, incluindo speleothem seco, pedra fluxo, espeleotemas úmido e gotejamento estalactite (Tabela 1). Todos os isolados foram identificados por sequenciação de 16S rDNA e mantidos a -80 ° C em glicerol a 25% 2-B R médio. Todas as experiências foram concluídas à TA.

Nota: Recomenda-se utilizar o mesmo método de preparação da amostra para adquirir espectros de massa para a construção do banco de dados e de massa de incógnitas. Método de preparação da amostra foi mostrado anteriormente para afetar a qualidade de espectro e reprodutibilidade 3. Usando um método diferente preparação da amostra pode causar a identificação incorrecta de desconhecidos, especialmente quando maior resolução taxonómica (por exemplo, no nível de tensão) é desejado.

1. Deposição sobre o alvo de MALDI

Cuidado: Vários protocolos para obter extractos de proteínas requerem a utilização de ácidos e solventes orgânicos, que deve ser utilizado de acordo com guidElines e informações contidas em suas respectivas Fichas de Dados de Segurança de Materiais (FDSP). Apropriada PPE deve ser usado e vai variar de acordo com tipo e volume de produtos químicos usados ​​(por exemplo, jalecos / batas, luvas, óculos de segurança e de proteção respiratória devem ser utilizados ao trabalhar com quantidades significativas de solventes inflamáveis, tóxicos, tais como acetonitrilo, e ácidos corrosivos, tais como os ácidos fórmico e trifluoroacético).

  1. Depósito 1 ml extrato de proteína não contendo células viáveis ​​(obtidos utilizando adequadas, protocolos anteriormente descritos 11-13) sobre uma chapa de aço inoxidável alvo MALDI e deixe-a secar. Overlay o extrato de proteína seca com solução de matriz 1 ml (solução de ácido α-4-hidroxi-cinâmico-ciano), e deixe-a secar.
  2. Para cada repetição biológica, manchar um número apropriado de repetições técnicas (5 a 20 repetições técnicas). Aqui, spot 10 repetições técnicos para cada repetição biológica e 3 repetições biológicas were preparado.
    Nota: Recomendamos a utilização de uma placa de MALDI-alvo de aço polido ao usar o método de preparação de amostras extração de proteínas. Usando placas de aço alvo solo pode causar difusão e de mistura não intencional das diferentes amostras fora dos poços individuais da amostra.
  3. Depósito 1 ml de calibração padrão para a placa-alvo e deixe-a secar. Overlay com solução matriz 1 ul e deixe-a secar.
  4. Depósito de solução de matriz 2 uL para a placa de destino como um controlo negativo.

2. Espectros de Massa Aquisição

  1. Use um espectrômetro de massa MALDI-TOF equipado com um laser de nitrogênio (λ = 337 nm) e operado usando software Bruker FlexControl.
  2. Recolha cada espectro de massa no modo linear positiva pelo acúmulo de 500 disparos de laser em incrementos de 100 tiro. Defina a fonte de íons 1 tensão de 20 kV; fonte iónica de 2 a tensão de 18,15 kV; e a tensão de lente e 9,05 kV. Note-se que estes parâmetros são instrumento-especific e pode necessitar de reajuste em outros instrumentos para obter os melhores resultados.
  3. Defina o intervalo de massa-carga para avaliação automática espectro de 2 a 20 kDa por carga. Use o algoritmo de detecção de pico centroid. Defina o limite mínimo de resolução a 100 Da. Defina a relação sinal-ruído (S: N) limiar a 2. Defina o limite mínimo de intensidade em 100.

3. Construção de banco de dados

  1. Design de banco de dados
    1. Criar um novo banco de dados no BioNumerics 7.1 usando o "assistente de banco de dados New".
    2. Criar um tipo de experimento de espectro, por exemplo, Maldi, usando os comandos no painel "Tipos Experiment".
    3. Crie os níveis usando o "painel de banco de dados de design". Adicionar novos níveis usando o "Nível> Adicionar novo nível ..." comando no menu "Banco de Dados". Aqui, criar "Espécies" nível, nível de "replicar Biológica" "e" repetição técnica "nível, respectivEly.
  2. Importação e pré-processamento de espectros de massa crua
    1. Exportar o espectro de massa crua como arquivos .txt usando FlexAnalysis clicando no comando "Export> Espectro de massa" no menu "File".
    2. Importar o espectro de massa crua (.txt) no banco de dados no nível das repetições técnicas.
    3. Preprocess os espectros de massa crua.
      1. Importação e resample (usando um algoritmo de ajuste quadrático).
      2. Realizar uma subtracção da linha de base (com um disco do rolamento com um tamanho de 50 pontos).
      3. Calcule o ruído [Transformation Wavelet Contínua (CWT)], liso (Janela Kaiser com um tamanho de janela de 20 pontos e beta de 10 pontos), e realizar uma segunda subtração de base (disco rolando com tamanho de 200 pontos).
      4. Detectar picos [CWT com um sinal mínimo de ruído (S: N) de 10].
    4. Depois de pré-processamento, salvar padrões característicos de cada espectro de massa, tais como listas de pico contendo picotamanhos, as intensidades dos picos, S: N, etc, no banco de dados.
  3. Criação de espectro de massa compósito
    1. Criar espectros composta a partir de espectros pré-processados ​​usando o comando "Resumir ..." no menu "Análise". Escolha a opção "replicar Biológica", como nível de alvo.
    2. Aqui, combinar os espectros de massa de 10 repetições técnicos da mesma colónia, para se obter um espectro de massa compósito para que colónia, resultando em três espectros de massa compósito para esse isolado no nível "réplica biológica".
    3. Aqui, resumir os três espectros combinados para criar um espectro composto para que o isolado no nível "Espécies".
      Nota: O espectro de compósito é a média de ponto-a-ponto das repetições técnicas. Replica com uma similaridade (correlação de Pearson) com a média de 95% menor do que (configuração padrão) são excluídos do compósito. Os picos nos espectros compósito só são chamados, se estiverem presentes em 75% (configuração padrão) das repetições incluídos. Para as réplicas biológicas, estas definições foram de 90 e 60%, respectivamente.

4. Massa de Análise de Dados do Espectro

  1. Selecione as entradas no banco de dados e criar uma comparação clicando no comando "Criar nova comparação" no painel "As comparações".
  2. Aqui, use o espectro de massa na "repetição técnica" e / ou níveis de "reproduzir Biológica" para mostrar comparações e análises.
  3. Análise de cluster baseada em similaridade e de escala multi-dimensional (MDS)
    1. Crie grupos com cores. Selecione o espectro de massa compósito biológica três e clique no botão "Criar novo grupo da seleção" comando no menu "Grupos" para criar um grupo para o isolado correspondente. Designar uma cor automaticamente utilizado para estes três espectros de massa.
    2. Como alternativa, definir estados de campo com as cores correspondentes, utilizando os comandos no "Base de dados entradas "painel de tal modo que qualquer agrupamento com base neste campo definido usa a mesma cor definida para este grupo.
    3. Realizar análise de cluster. Clique no comando "Calcular análise de cluster" no menu "Clustering". No configurações Comparação Page 1, selecione a opção "correlação de Pearson" e deixar outros parâmetros como padrão. Na página 2, selecione "UPGMA". Em seguida, clique em "Finish".
    4. Obter um enredo MDS usando o "dimensionamento Multi-dimensional ..." comando no menu "Estatísticas".
  4. Coincidindo Peak
    1. Clique no tipo de espectro "Maldi" no painel "Experiências". Em seguida, selecione "Layout> Mostrar imagem". Os espectros são apresentados como bandas de gel.
    2. Executar a correspondência de pico usando o comando "Faça a correspondência de pico" no menu "Spectra".
  5. Identificação de classes de pico
    1. Realizar análise de componentes principais (PCA). Realce o "Maldi "tipo de experimento no" Experimental "painel e use a" Análise de Componentes Principais ... "comando no menu" Estatística "para realizar PCA.
    2. Execute bidirecional clustering. Clique no botão "Estatísticas> mineração Matrix" ... na janela "Comparação". A intensidade dos picos correspondentes às classes de pico é representado usando cores diferentes (mapa de calor).

5. As bactérias Identificação com um banco de dados personalizada

  1. Método baseado em coeficiente de similaridade
    1. Criar uma comparação e gerar um dendrograma baseado no espectro de massa no nível "replicar técnicos", como descrito no passo 4.3.3. Salve o dendrograma para comparação da similaridade.
    2. Selecione um espectro de massa desconhecida, e clique no botão "Análise> Identificar as entradas selecionadas". A caixa de diálogo identificação aparece.
    3. Selecione a opção "Comparação baseada" tipo de classificador (ou um classif armazenadoier) e clique em "next". Na página seguinte, escolha o dendrograma salvo como uma comparação de referência e, em seguida, clique em "next".
    4. Escolha a opção "semelhança Basic" como um método de identificação e clique em "next".
    5. Escolha a opção "semelhança máxima" como método de pontuação. Escreva em valores limiares adequados e os valores mínimos de diferença para cada parâmetro e clique em "next".
    6. Uma vez que os cálculos são concluídas, aparece a janela de identificação. No "Resultados" do painel, os membros do banco de dados que melhor combinam com o desconhecido são listados.
    7. Salve o projeto de identificação e validar a identificação usando o comando "de validação cruzada análise" no painel "projeto de Identificação".
  2. Método baseado biomarcador potencial
    1. Definir classes de pico. Na janela "Matrix Mining", selecionar os conjuntos de picos com características comuns e definir esses picos como especiaulas fic de pico (de potenciais biomarcadores) usando "Spectra> Gerenciar tipos de classe de pico ..." na "janela de comparação".
    2. Aqui, definir classes específicas de pico de cada isolado para todos os 15 isolados.
    3. Escolher os espectros de massa de desconhecidos e combinar os picos destes espectros para as classes de pico definidos como descrito anteriormente.

Resultados

As bases de dados construídos desta manifestação teve quatro níveis, maior para o menor nível, incluindo "todos os níveis", "Espécies", "repetição Biológica" e "repetição técnica", respectivamente (Figura 1A). O nível "técnico replicar" continha todos os espectros pré-processado de repetições técnicas. A "repetição Biológica" e os níveis de "espécies" continha o (resumo) espectros composto. "Todos os níve...

Discussão

Esta demonstração mostrou procedimentos detalhados de caracterização e identificação de bactérias que utilizam MALDI-TOF MS e um banco de dados personalizado. Em comparação com os métodos tradicionais moleculares, por exemplo, métodos de impressão digital de 16S rDNA, baseados em MS MALDI-TOF facilitar a identificação mais rápida de diversas bactérias. Devido à sua robustez, esta técnica é muito utilizada para caracterizar bactérias, vírus, fungos e leveduras do ambiente e em ambientes clínicos

Divulgações

Authors Vranckx and Janssens are employees of Applied Maths NV, the manufacturer of data analysis software used in this video. Applied Maths NV provided select software modules highlighted in this video as well as a portion of the publication costs associated with this video.

Agradecimentos

This work was supported by the New College of Interdisciplinary Arts and Sciences at Arizona State University, Applied Maths NV, and by the National Science Foundation (ROA Supplement to Award No. MCB0604300). Any opinions, findings, and conclusions or recommendations expressed in this material are those of the author(s) and do not necessarily reflect the views of the National Science Foundation.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acidACROS Organics163440050≥ 97%, CAS 28168-41-8
Bruker FlexControl softwareBruker Daltonicsversion 3.0
Bruker FlexAnalysis softwareBruker Daltonicsversion 3.0
Bionumerics softwareApplied Mathsversion 7.1

Referências

  1. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
  2. Siegrist, T. J., et al. Discrimination and characterization of environmental strains of Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). J Microbiol Meth. 68 (3), 554-562 (2007).
  3. Goldstein, J. E., Zhang, L., Borror, C. M., Rago, J. V., Sandrin, T. R. Culture conditions and sample preparation methods affect spectrum quality and reproducibility during profiling of Staphylococcus aureus with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Lett Appl Microbiol. 57 (2), 144-150 (2013).
  4. Benagli, C., et al. A rapid MALDI-TOF MS identification database at genospecies level for clinical and environmental Aeromonas strains. Plos One. 7 (10), (2012).
  5. Sauer, S., Kliem, M. Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 74-82 (2010).
  6. Bohme, K., et al. SpectraBank: An open access tool for rapid microbial identification by MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 33 (14), 2138-2142 (2012).
  7. Walker, J., Fox, A. J., Edwards-Jones, V., Gordon, D. B. Intact cell mass spectrometry (ICMS) used to type methicillin-resistant Staphylococcus aureus: media effects and inter-laboratory reproducibility. J Microbiol Meth. 48 (2-3), 117-126 (2002).
  8. Ruelle, V., El Moualij, B., Zorzi, W., Ledent, P., De Pauw, E. Rapid identification of environmental bacterial strains by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Sp. 18 (18), 2013-2019 (2004).
  9. Sedo, O., Sedlacek, I., Zdrahal, Z. Sample Preparation Methods for Maldi-MS Profiling of Bacteria. Mass Spectrom Rev. 30 (3), 417-434 (2011).
  10. Swatkoski, S., Russell, S., Edwards, N., Fenselau, C. Analysis of a model virus using residue-specific chemical cleavage and MALDI-TOF mass spectrometry. Anal Chem. 79 (2), 654-658 (2007).
  11. Freiwald, A., Sauer, S. Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry. Nat Protoc. 4 (5), 732-742 (2009).
  12. Drevinek, M., Dresler, J., Klimentova, J., Pisa, L., Hubalek, M. Evaluation of sample preparation methods for MALDI-TOF MS identification of highly dangerous bacteria. Lett Appl Microbiol. 55 (1), 40-46 (2012).
  13. Lasch, P., et al. MALDI-TOF mass spectrometry compatible inactivation method for highly pathogenic microbial cells and spores. Anal Chem. 80 (6), 2026-2034 (2008).
  14. Usbeck, J. C., Kern, C. C., Vogel, R. F., Behr, J. Optimization of experimental and modelling parameters for the differentiation of beverage spoiling yeasts by Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) in response to varying growth conditions. Food Microbiol. 36 (2), 379-387 (2013).
  15. Del Chierico, F., et al. MALDI-TOF MS proteomic phenotyping of filamentous and other fungi from clinical origin. J Proteomics. 75 (11), 3314-3330 (2012).
  16. Vitale, R., Roine, E., Bamford, D. H., Corcelli, A. Lipid fingerprints of intact viruses by MALDI-TOF/mass spectrometry. Bba-Mol Cell Biol L. 1831 (4), 872-879 (2013).
  17. Zhang, L., Borror, C. M., Sandrin, T. R. A designed experiments approach to optimization of automated data acquisition during characterization of bacteria with MALDI-TOF mass spectrometry. Plos One. 9 (3), (2014).
  18. Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J ClinMicrobiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).

Reimpressões e Permissões

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