Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии и пользовательскую базу данных для характеристики бактерий из числа коренных народов уникального пещерного окружающей среды (Kartchner Пещеры, AZ, США)

Резюме

This work details procedures for rapid identification of bacteria using MALDI-TOF MS. The identification procedures include spectrum acquisition, database construction, and follow up analyses. Two identification methods, similarity coefficient-based and biomarker-based methods, are presented.

Аннотация

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, strain levels. Commercially available and open source software tools have been developed to facilitate identification; however, no universal/standardized data analysis pipeline has been described in the literature. Here, we provide a comprehensive and detailed demonstration of bacterial identification procedures using a MALDI-TOF mass spectrometer. Mass spectra were collected from 15 diverse bacteria isolated from Kartchner Caverns, AZ, USA, and identified by 16S rDNA sequencing. Databases were constructed in BioNumerics 7.1. Follow-up analyses of mass spectra were performed, including cluster analyses, peak matching, and statistical analyses. Identification was performed using blind-coded samples randomly selected from these 15 bacteria. Two identification methods are presented: similarity coefficient-based and biomarker-based methods. Results show that both identification methods can identify the bacteria to the species level.

Введение

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus, species, and in some cases, strain levels^1-4. MALDI-TOF MS ionizes biological molecules (typically proteins) that originate from cell surfaces, intracellular membranes, and ribosomes from bacterial whole cells or protein extracts^1,5. The resulting peaks form characteristic patterns or “fingerprints” of the bacteria analyzed¹. Identification of bacteria is based on these mass-to-charge “fingerprints”.

Two of the most commonly used identification strategies are library-based and bioinformatics-based strategies¹. Library-based approaches involve comparing the mass spectra of unknowns to previously collected mass spectra of known bacteria in databases/libraries for identification. Commercially available software, such as BioNumerics, Biotyper, and SARAMIS software packages, as well as open source software tools, such as SpectraBank⁶, are available to facilitate the comparison and quantification of similarity between mass spectra of unknowns and reference bacteria. Bioinformatics-based approaches usually rely on fully sequenced genomes of bacteria for identification. In contrast to library-based approaches which do not involve identification of the biological nature of particular peaks, bioinformatics-based approaches involve protein identification¹.

The majority of recent MALDI fingerprint-based studies have used library-based approaches to identify bacteria¹. Library-based approaches require construction of databases and comparison of the similarity between mass spectra. Studies show that many experimental procedures, such as medium^3,7, cultivation time⁸, sample preparation method³, and matrix used⁹, affect the mass spectra obtained. Furthermore, some closely-related species and strains generate spectra with only subtle differences. Thus, library-based approaches require rigorously standardized procedures to generate highly reproducible mass spectra between replicates. Minor variations in protocols may compromise the efficacy of identification, especially at the subspecies and strain levels^1,3,10. However, neither manufacturer-provided reference databases nor reported custom databases include visually documented procedures for database construction and/or application of a data analysis pipeline. For this reason, the objective of this work was to develop, apply, and demonstrate a comprehensive and detailed procedure for library-based bacterial identification using MALDI-TOF MS.

In this demonstration, mass spectra of 15 bacteria isolated from a karstic environment (Kartchner Cavern, AZ, USA) were collected and imported into software to construct a model database. Data processing and the analysis pipeline were detailed using the model database. Finally, mass spectra of blind-coded bacteria which were randomly selected from these 15 bacteria were collected again and compared to the reference spectra in the model database for identification. Results show that bacteria can be correctly identified either based on similarity coefficients or potential biomarkers/peak classes.

протокол

Внимание: Неизвестные бактерии из любой среды может быть патогенным и должны быть обработаны с осторожностью, используя соответствующие протоколы биобезопасности. Работа с живыми культурами должны быть выполнены в корпусе класса II биобезопасности с помощью биологической безопасности уровня 2 (BSL-2) процедуры. Более подробная информация о BSL-2 процедур доступен в руководстве CDC / NIH под названием "биобезопасности в микробиологических и биомедицинских лабораториях," страниц 33-38. Документ доступен в Интернете по адресу http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf . Соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), в том числе халатах / платья, защитные очки и нитрильных или латексные перчатки, должны носить. Стандартные микробиологические методы и меры предосторожности должны быть соблюдены, и биологически опасные отходы должны быть уничтожены соответственно.

Бактерии, используемые в этой демонстрации были выделены из Kartchner пещеры,AZ, USA, один из четырех сред, в том числе сухой Натёчные образования, расход камня, влажной Натёчные образования и сталактитов капельно (таблица 1). Все изоляты были идентифицированы 16S рДНК последовательности и выдерживают при -80 ° С в 25% глицерин-R ₂ B среде. Все эксперименты были выполнены при комнатной температуре.

Примечание: Мы рекомендуем использовать тот же метод подготовки пробы приобрести масс-спектры для строительства базы данных и масс-спектров неизвестных. Пример способ получения, как было показано ранее, чтобы повлиять на качество спектра и воспроизводимость ^3. Использование другого метода подготовки образца может привести к неправильной идентификации неизвестных, особенно при более высоких таксономических разрешение (например, на уровне деформации) желательно.

1. Нанесение на MALDI мишени

Внимание: несколько протоколов, чтобы получить белковые экстракты требуют использования кислот и органических растворителей, которые должны быть использованы в соответствии с GUIDelines и информация, содержащиеся в соответствующих листов по безопасности применения материалов (MSDS). Соответствующие средства индивидуальной защиты должны носить и будет варьироваться в зависимости от типа и объема используемых химикатов (например, халатах / платья, перчатки, защитные очки и средства защиты органов дыхания должны быть использованы при работе со значительными количествами токсичных, легковоспламеняющихся растворителей, таких как ацетонитрил, и коррозионные кислоты, такие как муравьиная и трифторуксусной кислоты).

1. Депозит 1 мкл белкового экстракта, не содержащего жизнеспособные клетки (полученные с использованием соответствующих, описанных ранее протоколов ^11-13) на нержавеющей стали MALDI целевой пластины и дайте ему высохнуть. Наложение сухого экстракта белка с раствором матрицы 1 мкл (α-циано-4-гидрокси-коричной кислотный раствор), и дайте ему высохнуть.
2. Для каждого биологического репликации, место соответствующее количество технических повторов (от 5 до 20 технические Копировщиков). Здесь, место 10 технических повторов для каждого биологического репликации и 3 биологических повторяет Wпрежде чем подготовлены.
   Примечание: Мы рекомендуем использовать полированную MALDI стали мишень при использовании метода пробоподготовки экстракции белка. Использование шлифованной стали целевые пластины может привести к распространению и непреднамеренное смешение различных проб за пределами отдельных образцов скважин.
3. Депозит 1 мкл калибрующего стандарт на целевой пластине и дайте ему высохнуть. Наложение с матричным раствором 1 мкл и дайте ему высохнуть.
4. Депозит 2 мкл раствора матрицы на целевой пластине в качестве отрицательного контроля.

2. Масс-спектр Приобретение

1. Используйте масс-спектрометра MALDI-TOF оснащен лазерным азота (λ = 337 нм) и управляется с помощью программного обеспечения Bruker Flexcontrol.
2. Соберите каждый масс-спектр в положительном линейном режиме накоплением 500 лазерных выстрелов в 100 с шагом выстрел. Установите напряжение источника ионов 1 до 20 кВ; ионный источник 2 напряжения 18,15 кВ; и объектив напряжения 9,05 кВ. Обратите внимание, что эти параметры являются инструментом, удельнаяFIC и может потребовать корректировки на другие инструменты для получения оптимальных результатов.
3. Установите диапазон массы к заряду для автоматизированного оценки спектра от 2 до 20 кДа на одной зарядке. Используйте центра тяжести алгоритм пик обнаружения. Установите минимальное разрешение порог в 100 Da. Установите сигнал-шум (S: N) порога, при 2. Установите порог минимальной интенсивностью 100.

3. База данных Строительство

1. Проектирование базы данных
   1. Создать новую базу данных в BioNumerics 7,1 с помощью «Мастера нового базы данных".
   2. Создать спектра типа эксперимента, например, MALDI, с помощью команд "Типы эксперимент" панели.
   3. Создавайте уровни с помощью "проектирования баз данных панели". Добавить новые уровни с помощью «уровня> Добавить новый уровень ..." в меню "База данных". Здесь, создавать «видов» уровне, уровне «Биологические REPLICATE" "и" Технические REPLICATE "Level respectivЭли.
2. Импорт и предварительной обработки спектров сырой массы
   1. Экспорт сырой масс-спектры, как .txt файлов с помощью FlexAnalysis, нажав на команду "Экспорт> Масс-спектр" в меню "Файл".
   2. Импорт сырой масс-спектры (файлы с расширением .txt) в базе данных по уровню технических повторяет.
   3. Предварительная обработка спектров сырой массы.
      1. Импорт и частоты дискретизации (используя квадратичную алгоритм подбора).
      2. Выполнение базового вычитание (с прокатки диска с размером 50 пунктов).
      3. Вычислить шум [Непрерывный вейвлет-преобразования (CWT)], гладкая (Kaiser окно с размером окна 20 пунктов и бета 10 очков), а также выполнять второй Вычитание (прокат диск с размером 200 точек).
      4. Обнаружение пиков [CWT с минимальным отношением сигнала к шуму (S: N) из 10].
   4. После предварительной обработки, сохранения характерные модели каждого масс-спектра, такие как пик списков, содержащих пикразмеры, пик интенсивности, S: N, и т.д., в базе данных.
3. Создание составного масс-спектров
   1. Создать составной спектры от предварительно обработаных спектров с помощью команды "подвести итог ..." в меню "Анализ". Выберите «Биологический копировщика" как целевого уровня.
   2. Здесь, объединить масс-спектры 10 технических повторов одного и того же колонии для получения композитного масс-спектр для этого колонии, в результате чего три композитных масс-спектров для этого изолята на уровне «Биологические реплик".
   3. Здесь приводится краткое описание трех композитный спектры для создания одного составного спектра для этой изолировать на уровне «видов».
      Примечание: композитный спектр средняя точка за точкой технических повторяет. Репликация с подобия (корреляции Пирсона) в среднем ниже, чем 95% (значение по умолчанию) исключены из композита. Пики на спектрах композитного только вызывается, если они присутствуют в 75% (настройка по умолчанию) включенных повторов. Для биологических повторностей, эти параметры были 90 и 60%, соответственно.

Анализ 4. Массовая спектральных данных

1. Выберите записи в базе данных и создать сравнение, нажав на команду «Создать новый сравнение" в "Сравнения" панели.
2. Вот, используйте масс-спектры в разделе "Технические репликации" и / или "Биологическое повторных" уровней, чтобы показать сравнения и анализа.
3. Сходство на основе кластерного анализа и многомерное шкалирование (MDS)
   1. Создание групп с цветами. Выберите биологических спектров двух композитных масс и нажмите кнопку "Создать новую группу из выделения" команды в меню "Группы", чтобы создать группу для соответствующего изолята. Назначить цвет автоматически, используемые для этих трех масс-спектров.
   2. Кроме того, определить состояний поля с соответствующими цветов с помощью команды в "База данных записей "панели, таких, что любая группировка на основе этого определенного поля используется тот же цвет, определенный для этой группы.
   3. Выполните кластерный анализ. Выберите команду "Вычислить кластерный анализ" в меню "кластеризации". На настроек сравнения Страница 1, выберите "корреляции Пирсона" и оставить другие параметры по умолчанию. На странице 2, выберите "UPGMA". Затем нажмите кнопку "Готово".
   4. Получить участок MDS, используя "многомерного шкалирования ..." в меню "Статистика".
4. Пик соответствия
   1. Щелкните на типе спектра "MALDI" в "Опыты" панели. Затем выберите "Макет> Показать изображение". Спектры показаны как гель полос.
   2. Выполните пик соответствия, используя команду "Do пик соответствия" в меню "Spectra".
5. Идентификация пиков классов
   1. Выполните анализ главных компонент (PCA). Выделите "MALDI "типа эксперимент в" экспериментальной "панели и использовать" Основные компоненты Анализ ... "в меню" Статистическом "для выполнения СПС.
   2. Выполните двустороннюю кластеризацию. Нажмите "Статистика> Горно-матрицы" ... в окне "Сравнение". Интенсивность пиков подобранных к пиковым классов представлены с использованием различных цветов (тепловая карта).

5. Бактерии Идентификация с пользовательской базы данных

1. Сходство коэффициентный метод на основе
   1. Создать сравнение и генерировать дендрограмму на основе масс-спектров на уровне "Технические реплик», как описано в шаге 4.3.3. Сохраните дендрограмму для сравнения сходства.
   2. Выберите неизвестный масс-спектр, и нажмите кнопку "Анализ> Определить выбранные записи". Появится диалоговое окно идентификации.
   3. Выберите "Сравнение на основе" тип классификатору (или хранимой объявлМЭО) и нажмите "Далее". На следующей странице выберите сохраненный дендрограмму в качестве эталонного сравнения, а затем нажмите "Далее".
   4. Выберите "принципиальное сходство" как метод идентификации и нажмите кнопку "Далее".
   5. Выберите "Максимальная сходство» как метод скоринга. Введите соответствующие пороговые значения и минимальные значения разности для каждого параметра, а затем нажмите "Далее".
   6. После того, как расчеты завершены, появляется окно идентификации. В «Результаты» панели, члены базе данных, которая наилучшим образом соответствуют неизвестное перечислены.
   7. Сохранить в определение проекта и проверки идентификации, используя команду "Перекрестная проверка анализа" в "Идентификация проекта" панели.
2. Потенциал метод биомаркеров на основе
   1. Определить пиковые классы. В окне "Матрица Mining", выбрать группы пиков, имеющих общие характеристики и определить эти пики как SPECIFIC пик классы (потенциальные биомаркеры) с использованием "Spectra> Управление типами пик класса ..." в окне "Сравнение".
   2. Здесь определяют пиковые классы, специфичные для каждого изолята для всех 15 изолятов.
   3. Выбор масс-спектры неизвестных и соответствуют вершины этих спектров с определенными классами пик, как описано выше.

Результаты

Базы данных, построенные в этой демонстрации было четыре уровня, от самого высокого до самого низкого уровня, в том числе "всех уровнях", "вид", "биологическом репликации" и "Технические репликации", соответственно (рис 1А). "Технические реплику" уровень ?...

Обсуждение

Эта демонстрация показала, подробные процедуры характеризации и идентификации бактерий с использованием MALDI-TOF MS и пользовательскую базу данных. По сравнению с традиционными методами молекулярной, например, методы, отпечатков пальцев последовательности рДНК 16S, MALDI-TOF MS на основе спосо...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid	ACROS Organics	163440050	≥ 97%, CAS 28168-41-8
Bruker FlexControl software	Bruker Daltonics		version 3.0
Bruker FlexAnalysis software	Bruker Daltonics		version 3.0
Bionumerics software	Applied Maths		version 7.1