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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

This work details procedures for rapid identification of bacteria using MALDI-TOF MS. The identification procedures include spectrum acquisition, database construction, and follow up analyses. Two identification methods, similarity coefficient-based and biomarker-based methods, are presented.

Zusammenfassung

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, strain levels. Commercially available and open source software tools have been developed to facilitate identification; however, no universal/standardized data analysis pipeline has been described in the literature. Here, we provide a comprehensive and detailed demonstration of bacterial identification procedures using a MALDI-TOF mass spectrometer. Mass spectra were collected from 15 diverse bacteria isolated from Kartchner Caverns, AZ, USA, and identified by 16S rDNA sequencing. Databases were constructed in BioNumerics 7.1. Follow-up analyses of mass spectra were performed, including cluster analyses, peak matching, and statistical analyses. Identification was performed using blind-coded samples randomly selected from these 15 bacteria. Two identification methods are presented: similarity coefficient-based and biomarker-based methods. Results show that both identification methods can identify the bacteria to the species level.

Einleitung

Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus, species, and in some cases, strain levels1-4. MALDI-TOF MS ionizes biological molecules (typically proteins) that originate from cell surfaces, intracellular membranes, and ribosomes from bacterial whole cells or protein extracts1,5. The resulting peaks form characteristic patterns or “fingerprints” of the bacteria analyzed1. Identification of bacteria is based on these mass-to-charge “fingerprints”.

Two of the most commonly used identification strategies are library-based and bioinformatics-based strategies1. Library-based approaches involve comparing the mass spectra of unknowns to previously collected mass spectra of known bacteria in databases/libraries for identification. Commercially available software, such as BioNumerics, Biotyper, and SARAMIS software packages, as well as open source software tools, such as SpectraBank6, are available to facilitate the comparison and quantification of similarity between mass spectra of unknowns and reference bacteria. Bioinformatics-based approaches usually rely on fully sequenced genomes of bacteria for identification. In contrast to library-based approaches which do not involve identification of the biological nature of particular peaks, bioinformatics-based approaches involve protein identification1.

The majority of recent MALDI fingerprint-based studies have used library-based approaches to identify bacteria1. Library-based approaches require construction of databases and comparison of the similarity between mass spectra. Studies show that many experimental procedures, such as medium3,7, cultivation time8, sample preparation method3, and matrix used9, affect the mass spectra obtained. Furthermore, some closely-related species and strains generate spectra with only subtle differences. Thus, library-based approaches require rigorously standardized procedures to generate highly reproducible mass spectra between replicates. Minor variations in protocols may compromise the efficacy of identification, especially at the subspecies and strain levels1,3,10. However, neither manufacturer-provided reference databases nor reported custom databases include visually documented procedures for database construction and/or application of a data analysis pipeline. For this reason, the objective of this work was to develop, apply, and demonstrate a comprehensive and detailed procedure for library-based bacterial identification using MALDI-TOF MS.

In this demonstration, mass spectra of 15 bacteria isolated from a karstic environment (Kartchner Cavern, AZ, USA) were collected and imported into software to construct a model database. Data processing and the analysis pipeline were detailed using the model database. Finally, mass spectra of blind-coded bacteria which were randomly selected from these 15 bacteria were collected again and compared to the reference spectra in the model database for identification. Results show that bacteria can be correctly identified either based on similarity coefficients or potential biomarkers/peak classes.

Protokoll

Achtung: Nicht identifizierte Bakterien aus jeder Umgebung kann pathogen sein und müssen mit Vorsicht mit geeigneten Biosicherheit Protokolle behandelt werden. Arbeit mit lebenden Kulturen müssen in einer Klasse II Biosicherheitswerkbank mit biologischen Sicherheitsstufe 2 (BSL-2) Verfahren durchgeführt werden. Mehr Informationen über BSL-2 Verfahren ist im CDC / NIH-Handbuch mit dem Titel "Biosicherheit in Mikrobiologischen und Biomedizinischen Laboratorien", Seiten 33 bis 38 zur Verfügung. Das Dokument ist im Internet unter http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf . Geeignete Schutzausrüstung (PSA), einschließlich Laborkittel / Kleider, Schutzbrille und Nitril oder Latex-Handschuhe, zu tragen. Standard mikrobiologische Verfahren und Vorsichtsmaßnahmen sind zu beachten, und biologischer Abfälle müssen fachgerecht entsorgt werden.

Bakterien in dieser Demonstration verwendet wurden Kartchner Caverns isoliert,AZ, USA, aus vier Umgebungen, einschließlich Trockenhöhlensinter, Flussstein, feuchten Höhlensinter und Stalaktiten Tropf (Tabelle 1). Alle Isolate wurden von 16S rDNA identifiziert und bei -80 ° C in 25% Glycerin-R 2 B-Medium gehalten. Alle Experimente wurden bei RT abgeschlossen.

Hinweis: Wir empfehlen mit dem gleichen Probenvorbereitungsmethode auf Massenspektren für die Datenbankerstellung und Massenspektren der Unbekannten zu erwerben. Probenvorbereitungsverfahren wurde zuvor auf Spektrum Qualität und Reproduzierbarkeit 3 beeinflussen gezeigt. Die Verwendung eines anderen Probenvorbereitung kann falsche Identifizierung der Unbekannten, vor allem bei höheren taxonomischen Auflösung (zB, auf Stammebene) führen gewünscht wird.

1. Die Ablagerung auf der MALDI-Target

Achtung: Mehrere Protokolle zu erhalten Proteinextrakte erfordern die Verwendung von Säuren und organischen Lösungsmitteln, die in Übereinstimmung mit GUID verwendet werden müssenelines und Informationen in ihren jeweiligen Materialsicherheitsdatenblätter (MSDS) enthalten. Geeignete PSA müssen getragen werden kann und von Art und Menge der verwendeten Chemikalien variieren (zB Laborkittel / Kleider, Handschuhe, Schutzbrille und Atemschutz muss bei der Arbeit mit erheblichen Mengen an toxischen, brennbaren Lösungsmitteln, wie Acetonitril verwendet werden, und korrosiven Säuren, wie Ameisensäure und Trifluoressigsäure).

  1. Kaution 1 ul Proteinextrakt, die keine lebensfähigen Zellen auf eine Edelstahlplatte MALDI-Target und trocknen lassen (unter Verwendung von geeigneten, zuvor beschriebenen Protokolle 11-13 erhalten). Überlagern der getrockneten Protein-Extrakt mit 1 ul Matrixlösung (α-cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure Lösung) und trocknen lassen.
  2. Für jede biologische Replikation, vor Ort eine entsprechende Anzahl von technischen Wiederholungen (5-20 technische Replikate). Hier, vor Ort 10 technische Wiederholungen für jede biologische Replikation und 3 biologischen Replikaten were vorbereitet.
    Hinweis: Wir empfehlen, mit einem polierten Stahl MALDI Zieltafel bei der Verwendung der Proteinextraktion Probenvorbereitung. Mit geschliffenem Stahl Zieltafeln kann zu verbreiten und unabsichtlichen Vermischung der verschiedenen Proben außerhalb der einzelnen Probenvertiefungen.
  3. Kaution 1 ul Eichsubstanz Standard auf die Zielplatte und lassen Sie ihn trocknen. Overlay mit 1 ul Matrixlösung und lassen Sie ihn trocknen.
  4. Deposit 2 ul Matrixlösung auf die Zielplatte als negative Kontrolle.

2. Massenspektren Acquisition

  1. Verwenden Sie ein MALDI-TOF-Massenspektrometer mit einem Stickstofflaser (λ = 337 nm) ausgestattet und mit Bruker Flexcontrol-Software betrieben.
  2. Sammeln jedes Massenspektrum in positive linearen Modus durch die Ansammlung von 500 Laserschüsse in 100 Schuss-Schritten. Stellen Sie den Spannungsionenquelle 1 bis 20 kV; Ionenquelle 2 Spannung auf 18,15 kV; und der Linsenspannung auf 9,05 kV. Beachten Sie, dass diese Parameter Instrument spezifischenFIC und könnten Anpassung auf andere Instrumente benötigen, um optimale Ergebnisse zu erzielen.
  3. Setze die Masse-Ladungs-Bereich für die automatische Spektrenauswertung 2-20 kDa pro Ladung. Verwenden Sie die Schwerpunktspitzenerkennungsalgorithmus. Stellen Sie die Mindestauflösung Schwelle bei 100 Da. Stellen Sie das Signal-Rausch-Verhältnis (S: N) Schwelle bei 2. Stellen Sie die minimale Intensitätsschwelle bei 100.

3. Aufbau von Datenbanken

  1. Datenbankdesign
    1. Erstellen Sie eine neue Datenbank in BioNumerics 7.1 mit dem "Neue Datenbank-Assistent".
    2. Erstellen Sie ein Spektrum Experiment Art, zB Maldi, mit Befehlen in der "Experiment Typen" Panel.
    3. Erstellen Sie die Ebenen mit dem "Datenbank-Design-Panel". Fügen Sie eine neue Ebene mit dem "Ebene> Neue Ebene ..." Befehl im Menü "Datenbank". Hier erstellen "Species" Ebene "Biologische replizieren" Niveau "und" Technische replizieren "Ebene JEWEILIGENely.
  2. Importieren und Vorverarbeitung von rohen Massenspektren
    1. Exportieren Sie die rohen Massenspektren als .txt-Dateien mit FlexAnalysis indem Sie im Menü "Datei" die "Export> Massenspektrum" -Befehl.
    2. Importieren Sie die rohen Massenspektren (.txt-Dateien) in die Datenbank in der Ebene der technischen Replikaten.
    3. Vorverarbeitung der rohen Massenspektren.
      1. Import und resample (unter Verwendung einer quadratischen Anpassungsalgorithmus).
      2. Führen Sie eine Basis Subtraktion (mit einer Walz Scheibe mit einer Größe von 50 Punkten).
      3. Berechne Lärm [Continuous Wavelet-Transformation (CWT)], glatt (Kaiser-Fenster mit einer Fenstergröße von 20 Punkten und beta von 10 Punkten), und führen Sie eine zweite Basisliniensubtraktion (Rollscheibe mit einer Größe von 200 Punkten).
      4. Detektieren Peaks [CWT mit einer minimalen Signal-Rausch-Verhältnis (S: N) von 10].
    4. Nach Vorverarbeitung, speichern charakteristische Muster jedes Massenspektrum, wie zum Beispiel Peaklisten Peak,Größen Spitzenintensitäten, S: N, usw., die in der Datenbank.
  3. Erstellen von Verbundmassenspektren
    1. Erstellen Sie zusammengesetzte Spektrum von vorverarbeiteten Spektren mit Hilfe des "Fassen Sie ..." Befehl im Menü "Analyse". Wählen Sie die "biologische Replikation" als Zielniveau.
    2. Hier kombinieren Massenspektren von 10 technische Replikate der gleichen Kolonie, ein Verbundmassenspektrum für die Kolonie zu erhalten, was zu drei Verbundmassenspektren für diesen Isolat an der "Biologische replizieren" Ebene.
    3. Hier eine Zusammenfassung der drei zusammengesetzten Spektren zu einem Verbundspektrum für die in der "Species" Ebene zu isolieren erstellen.
      Hinweis: Der zusammengesetzte Spektrum ist die Punkt-für-Punkt-Mittelwert der technische Replikate. Repliziert mit Ähnlichkeit (Pearson-Korrelation) auf den Mittelwert von weniger als 95% (Standardeinstellung) aus dem Verbund ausgeschlossen. Peaks auf der zusammengesetzten Spektren sind nur aufgerufen, wenn sie vorhanden sind, in 75% (Default-Einstellung) der enthaltenen Wiederholungen. Für die biologischen Replikate wurden diese Einstellungen 90 und 60% betragen.

4. Massenspektrum Data Analysis

  1. Wählen Sie die Einträge in der Datenbank, und erstellen Sie einen Vergleich, indem Sie in der "Vergleiche" Feld den Befehl "Neue Vergleich".
  2. Hier verwenden Sie den Massenspektren an der "Technischen replizieren" und / oder "Biologische replizieren" Ebenen, um Vergleiche und Analysen zeigen.
  3. Similarity-Cluster-Analyse und mehrdimensionale Skalierung (MDS)
    1. Erstellen von Gruppen mit Farben. Wählen Sie die drei biologischen Verbundmassenspektren und klicken Sie auf "Neue Gruppe erstellen aus Auswahl" Befehl im Menü "Gruppen", um eine Gruppe für die entsprechende Isolat erstellen. Bestimmen Sie automatisch eine Farbe für diese drei Massenspektren verwendet.
    2. Alternativ definieren Feld Staaten mit entsprechenden Farben mit den Befehlen in der "Datenbankeinträge "Panel, so dass jede Gruppierung auf der Grundlage dieser definierten Feld verwendet die gleiche Farbe für diese Gruppe definiert.
    3. Führen Sie die Clusteranalyse. Klicken Sie auf den "Berechnen Clusteranalyse" Befehl im Menü "Clustering". Auf der Vergleich Einstellungen Seite 1, wählen Sie die "Pearson-Korrelation" und lassen Sie andere Parameter als Standard. Auf Seite 2 wählen Sie "UPGMA". Klicken Sie dann auf "Fertig stellen".
    4. Erhalten MDS Grundstück mit dem "Multi-dimensionale Skalierung ..." Befehl im Menü "Statistik".
  4. Peak-Matching
    1. Klicken Sie auf das Spektrum Typ "Maldi" in der "Experimente" Panel. Wählen Sie dann "Layout> Bild anzeigen". Spectra als Gelbanden angezeigt.
    2. Führen Spitzenanpassung mit dem "Do Spitzen Matching" Befehl im Menü "Spectra".
  5. Ermittlung von Spitzenklassen
    1. Führen Sie die Hauptkomponentenanalyse (PCA). Markieren Sie die "Maldi "Experiment Typ in der" Experimental "Platte und verwenden Sie die" Hauptkomponentenanalyse ... "Befehl im Menü" Statistische "PCA durchzuführen.
    2. Führen bidirektionale Clustering. Klicken Sie auf die "Statistik> Matrix Mining" ... im Fenster "Vergleich". Die Intensität der Peaks zu den Spitzenklassen abgestimmt ist vertreten mit verschiedenen Farben (Heatmap).

5. Bakterien Identifikation mit einer Kundendatenbank

  1. Ähnlichkeit Koeffizient-basierte Verfahren
    1. Erstellen Sie einen Vergleich und erzeugen ein Dendrogramm auf Basis von Massenspektren an der "Technischen replizieren" Niveau wie in Schritt 4.3.3 beschrieben. Speichern Sie die Dendrogramm zum Vergleich der Ähnlichkeit.
    2. Wählen Sie eine unbekannte Massenspektrum, und klicken Sie auf "Analysis> Identifizieren Sie ausgewählte Einträge". Das Dialogfeld Identifikation erscheint.
    3. Wählen Sie den "Vergleich auf der Basis" Sichter des Typs (oder ein gespeichertes classifier) und klicken Sie auf "Weiter". Auf der nächsten Seite wählen Sie die gespeicherte Dendrogramm als Referenz Vergleich und klicken Sie dann auf "Weiter".
    4. Wählen Sie die "Grund Ähnlichkeit" als Kennzeichnungsmethode und klicken Sie dann auf "Weiter".
    5. Wählen Sie die "maximale Ähnlichkeit" als Bewertungsmethode. Geben Sie in den entsprechenden Schwellenwerten und Minimaldifferenzwerte für jeden Parameter und klicken Sie auf "Weiter".
    6. Wenn die Berechnungen abgeschlossen sind, wird das Identifikationsfenster. In der "Ergebnisse" Panel werden die Mitglieder der Datenbank, die am besten die unbekannt aufgeführt.
    7. Speichern Sie die Projektidentifikation und Validierung der Identifizierung mit dem "Kreuzvalidierung Analyse" -Befehl in der "Identifikation Projekt" Panel.
  2. Potenzielle Biomarker-basierte Verfahren
    1. Definieren Spitzenklassen. Im Fenster "Matrix Mining", wählen Sie Gruppen von Gipfeln, die gemeinsame Eigenschaften und definieren Sie diese Spitzen als Spezific Spitzenklassen (potentielle Biomarker) mit "Spectra> Verwalten Spitzenklassentypen ..." im "Vergleichsfenster".
    2. Hier definieren spezifisch für jedes Isolat für alle 15 Isolate Spitzenklassen.
    3. Wählen Sie die Massenspektren der Unbekannten und passen die Spitzen dieser Spektren zu den definierten Spitzenklassen wie zuvor beschrieben.

Ergebnisse

Die in dieser Demonstration gebaut Datenbanken hatte vier Ebenen, vom höchsten zum niedrigsten Ebene, einschließlich "Alle Ebenen", "Species", "Biologische replizieren" und "Technische Replikation" bezeichnet (Abbildung 1A). Die "Technische replizieren" Ebene enthalten alle vorverarbeiteten Spektren technische Replikate. Die "biologische Replikation" und "Species" Ebenen enthielt die Verbund (Zusammenfassung) Spektren. "Alle Eb...

Diskussion

Diese Demonstration zeigt detaillierte Verfahren der Charakterisierung und Identifizierung von Bakterien mittels MALDI-TOF MS und eine benutzerdefinierte Datenbank. Im Vergleich zu herkömmlichen molekularbiologischen Methoden, beispielsweise der 16S rDNA, MALDI-TOF MS-basierten Fingerabdruckverfahren erleichtern schnelleren Identifizierung der verschiedenen Bakterien. Wegen seiner Robustheit, wird diese Technik häufig verwendet, um Bakterien, Viren, Pilzen und Hefe, die aus der Umgebung und im klinischen Umfeld 1...

Offenlegungen

Authors Vranckx and Janssens are employees of Applied Maths NV, the manufacturer of data analysis software used in this video. Applied Maths NV provided select software modules highlighted in this video as well as a portion of the publication costs associated with this video.

Danksagungen

This work was supported by the New College of Interdisciplinary Arts and Sciences at Arizona State University, Applied Maths NV, and by the National Science Foundation (ROA Supplement to Award No. MCB0604300). Any opinions, findings, and conclusions or recommendations expressed in this material are those of the author(s) and do not necessarily reflect the views of the National Science Foundation.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acidACROS Organics163440050≥ 97%, CAS 28168-41-8
Bruker FlexControl softwareBruker Daltonicsversion 3.0
Bruker FlexAnalysis softwareBruker Daltonicsversion 3.0
Bionumerics softwareApplied Mathsversion 7.1

Referenzen

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  2. Siegrist, T. J., et al. Discrimination and characterization of environmental strains of Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). J Microbiol Meth. 68 (3), 554-562 (2007).
  3. Goldstein, J. E., Zhang, L., Borror, C. M., Rago, J. V., Sandrin, T. R. Culture conditions and sample preparation methods affect spectrum quality and reproducibility during profiling of Staphylococcus aureus with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Lett Appl Microbiol. 57 (2), 144-150 (2013).
  4. Benagli, C., et al. A rapid MALDI-TOF MS identification database at genospecies level for clinical and environmental Aeromonas strains. Plos One. 7 (10), (2012).
  5. Sauer, S., Kliem, M. Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 74-82 (2010).
  6. Bohme, K., et al. SpectraBank: An open access tool for rapid microbial identification by MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 33 (14), 2138-2142 (2012).
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  9. Sedo, O., Sedlacek, I., Zdrahal, Z. Sample Preparation Methods for Maldi-MS Profiling of Bacteria. Mass Spectrom Rev. 30 (3), 417-434 (2011).
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  18. Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J ClinMicrobiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).

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