Procedimiento para safena humana Venas<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusión y refuerzo externo

Resumen

Los mecanismos que conducen al desarrollo de hiperplasia de la íntima (IH) y la insuficiencia injerto de vena son aún poco conocidos. Este estudio describe un sistema ex vivo para perfundir venas humanos bajo flujo y presión controladas. Además, la eficiencia de refuerzo de malla externa para limitar el desarrollo de la IH se evaluó.

Resumen

El apoyo principal de las terapias contemporáneas para la enfermedad arterial oclusiva extensa es puente venoso. Sin embargo, su durabilidad se ve amenazada por la hiperplasia de la íntima (IH) que a la larga conduce a la oclusión del vaso y el fracaso del injerto. Las fuerzas mecánicas, esfuerzo de corte particularmente baja y alta tensión de la pared, se cree que para iniciar y sostener estos cambios celulares y moleculares, pero su contribución exacta aún no se ha desenredado. Para evaluar selectivamente el papel de la presión y la tensión de corte sobre la biología de IH, un sistema de perfusión ex vivo (EVPS) fue creado para perfundir segmentos de venas safena humanos bajo el régimen arterial (tensión alta cizalladura y alta presión). Otras innovaciones técnicas permitieron la perfusión simultánea de dos segmentos de la misma línea, uno reforzado con una malla externa. Las venas se recogieron usando una técnica de no tocar y transferidas inmediatamente al laboratorio para su montaje en el EVPS. Un segmento del aislador del reciénvena ATED no fue perfundido (control, día 0). Los otros dos segmentos fueron perfundidos durante un máximo de 7 días, uno está completamente cubierta con una malla externa 4 mm (diámetro). La presión, velocidad de flujo, y el pulso fueron controlados y ajustados para imitar las condiciones hemodinámicas que prevalecen en la arteria femoral de forma continua. Al término de la perfusión, las venas se desmontaron y se usaron para análisis histológico y molecular. En condiciones ex vivo, la perfusión de alta presión (arterial, = 100 mm Hg media) es suficiente para generar IH y remodelación de las venas humanas. Estas alteraciones se reducen en la presencia de una malla de poliéster externa.

Introducción

Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de morbilidad y mortalidad en los países occidentales ^1. A pesar de los avances en los tratamientos endovasculares, cirugía de bypass sigue siendo el pilar de las terapias actuales, por lo tanto más de medio millón de injertos de vena se realizan anualmente en los Estados Unidos. Sin embargo, a pesar de décadas de investigación, el 30-60% de los injertos de vena de la extremidad inferior fracasan en los primeros años, debido a la hiperplasia de la íntima (IH) ^2. Las fuerzas mecánicas, estrés particularmente baja cizalladura (SS) y la tensión alta de la pared, son clave en el inicio y desarrollo de esta respuesta hiperplásica ^3,4. Para abordar esta cuestión, un sistema de perfusión in vivo venas ex (EVPS) se generó a estudiar, en condiciones estrictamente controladas hemodinámicas (presión y el estrés de cizalla), el comportamiento de las venas safena humanos. En este estudio, después de la inserción en la circulación arterial-como, de alta presión (media = 100 mm Hg) era suficiente para estimular la proliferación y la migración de células musculares lisas en la capa intimal (IH) ^5.

Estudios de mamíferos han sugerido el uso de refuerzo externo como un método eficiente para apoyar la "vena arterializada" y contrarrestar la hemodinámica aguda cambia la vena se enfrenta una vez implantado en un entorno arterial. La malla impedido el exceso de distensión, aumento de la tensión de cizallamiento, y redujo tensión de la pared y, en consecuencia IH ^6-10. Sin embargo, los mecanismos subyacentes y su aplicabilidad a las venas humanas en la mejora de la permeabilidad de derivación no se han caracterizado completamente. Nuestros EVPS se utilizó para comparar, en condiciones que imitan las alteraciones de una vena caras Una vez insertado en un régimen arterial (estrés de alto cizallamiento y presión), el comportamiento de las venas safenas humanos en la ausencia y presencia de una malla tubular de poliéster macroporoso externo. Al prevenir la remodelación patológica y IH, la malla proporciona evidencia de su potencial eficacia clínica ¹¹ .

Este estudio 1) presenta un modelo ex vivo de las venas safena humanos perfusión bajo presión controlada y tensión de corte 2) demuestra que la malla de poliéster-macro porosa externa reduce IH y proporciona información crucial para su potencial aplicación clínica.

Protocolo

El Comité Ético de la Universidad de Lausana aprobó los experimentos, que están en conformidad con los principios establecidos en la Declaración de Helsinki de 1975, revisada en 1983 para el uso de tejidos humanos.

1. humano vena safena Harvest

1. Obtener segmentos excedentes de las venas safena humanos no varicosas de los pacientes sometidos a cirugía de bypass extremidad inferior por isquemia. En la sala de operaciones, desinfección de la pierna entera con una solución de yodo y la caída del paciente para exponer la pierna desde la ingle hasta el pie.
2. Hacer una incisión media desde la ingle hasta la rodilla (dejando la porción interrumpida de la piel).
3. Cosecha de la vena safena interna con un pedículo de los alrededores (técnica de no tocar) el tejido. Ramas laterales seguros de las venas con 4-0 corbatas de seda. Inmediatamente almacenar un mínimo de 9 cm de largo excedente de segmento de la vena safena mayor, con un diámetro externo de 2,5-4 mm a 4 ° C en un medio RPMI-1640 Tmedio lutamax, complementado con un 12,5% de suero bovino fetal y llevarla al laboratorio.

2. EVPS Diseño

1. Se monta el equipo general que se muestra en la Figura 1. Autoclave todos los equipos y mantener todos los componentes en condiciones estériles. Además, asegúrese de que el sistema es resistente al agua y no se escape de productos químicos en el medio. Utilice polimetacrilato de metilo (PMMA-GS) para la cubierta. Acero (X5 Cr Ni 18 10) y el plástico de polioximetileno (POM) como el soporte vena.
2. Diseño de la cámara de perfusión a la geometría deseada para permitir la colocación de la vena y su conexión. Asegúrese de que la profundidad (o radio si se utiliza la construcción cilíndrica) es al menos 2,5 cm por lo que permite la flexión mínima y la dilatación del recipiente junto con la cobertura constante por los medios de cultivo (Figura 1). El sellado es un tema importante y es la razón se utiliza rectangular construcción PMMA-GS.
3. Diseñar el apoyo vena para la geometr deseaday. Para evitar torceduras vena o más de distensión, permitir el ajuste de longitud empujando o tirando (tornillo no puede ser utilizado para ese propósito, como la vena se retorció junto con el tornillo).
   NOTA: Una barra de acero llena conectados por 2 piezas deslizantes en forma de L que soportan los cilindros vena 2 (5 mm de diámetro para adaptarse a la embarcación) y la vena (Figura 1B y Figura 2) se utiliza aquí.
4. Diseño de la columna de presión, de manera que la "presión de reposo" aplicada al sistema es: p = 0-10 hx = ρ xg, donde p = presión (N / m ^2, Pa) h = altura de la columna de fluido (m) ρ = densidad del líquido (kg / m ³⁾ y g = la constante gravitacional (9,81 m / s ^2). Diseño de cuatro conductos de conexión, de arriba a abajo: para aplicar presión, para la salida (de la vena), la entrada (en la vena) y para permitir el cambio medio.
5. Preparar el medio. Sobre la base de estudios previos ^5,11-14, elija RPMI-1640 suplementado con Glutamax, 12.5% De suero de ternera fetal, y la solución de antibiótico-antimicótico al 1% (10.000 U / ml de penicilina G, más 10 mg / ml de sulfato de estreptomicina, además de 25 mg / ml de anfotericina B, además de 0,5 g / ml: gentamicina). Tensión de cizallamiento (SS) está dada por SS = 4 μQ / π r * ³ Q es el caudal (ml / seg), r el radio (cm) del segmento de la vena, y μ es la viscosidad del medio de perfusión.
   1. SS modular mediante el ajuste de la viscosidad mediante la adición de 70 kDa de dextrano. Medir la viscosidad con un viscosímetro. Aquí, agregar 8% 70 kDa dextrano para establecer SS a 9-15 dyn / cm ^2.
6. Establecer la bomba de engranajes para inducir una señal cardioide pulsátil de 60 impulsos / min y amplitud constante generar un flujo unidireccional de 150 ± 15 ml / min, independientemente de la presión aplicada en el sistema y controlado por un ordenador. Asegúrese de que el software de conducción integra adquisición constante y el seguimiento de las presiones, la velocidad del flujo, frecuencia del pulso, y la señal. Si lo desea, utilice una segunda bomba (no synchronized) para producir un no laminar, flujo turbulento.

3. Asamblea EVPS (Figura 1)

1. Antes de empezar, asegúrese de que todo el equipo es estéril. Realice todos los siguientes pasos en la asepsia en una campana de flujo laminar.
2. Coloque la vena en una placa de Petri llena de medio. Use una hoja de bisturí y dividir la vena en 3 segmentos iguales.
3. Lavar inmediatamente un segmento en PBS. Dividir el segmento en 3 partes, fijar uno en formol para morfometría. Congelar los otros dos para la transcripción cuantitativa (RT-PCR) y proteínas (Western blot) análisis. Considere estos segmentos como control, la vena no perfundido.
4. Utilice los 2 segmentos restantes para la perfusión.
   1. Muy suavemente inyectar medio en la vena y determinar la dirección del flujo normal; en presencia de válvulas se invierte la vena.
   2. Sellado de las venas es de suma importancia para el éxito experimental. Compruebe si hay fugas a través de colaterales. Asegure todas las fugas con 6-0 suturas de seda.
   3. Conectar el segmento de vena entre los dos cilindros metálicos, uno de los extremos a la vez (2.3, Figura 1). Asegure los cilindros con Ethibon 3-0 alrededor de las muescas (Figura 1A y B).
      1. Coloque el segmento venoso entero en la cámara de perfusión previamente llenado con medio. Repita el mismo procedimiento para el segundo segmento.
         NOTA: Si no se sella correctamente la vena para el cilindro será una fuente de la fuga, requiere reintervención, y aumentar significativamente el riesgo de infección y fracaso experimental.
   4. Para reforzar (malla) el segundo segmento, liberar los dos cilindros (con la vena adjunto) a partir de las piezas en forma de L (2.3 y Figura 1).
      1. Sea amable y no toque la vena con cualquier instrumento. Deslizar la malla primero en el cilindro a continuación, en la vena. A empujones empuje / tirón conseguirá la malla en la vena.
      2. Una vez que la malla cubre toda la superficie de la vena a asegurar la jvena acketed a los cilindros con Ethibon 3-0.
      3. Volver a montar el compuesto vena / cilindro para el apoyo en forma de L y transferirla a la cámara de perfusión, previamente llenado con el medio.
   5. Conectar cada cilindro metálico (en-y salida) a un Y-separador utilizando tubo de silicona tratado con peróxido con un diámetro interno de 3,2 mm.
   6. Conectar el divisor de flujo de salida a un segundo divisor de Y-utilizando el mismo tipo de tubo. De este Y-separador, utilizar un tubo para medir la presión de perfusión a través de ambos vasos. Conectar el otro de nuevo a la columna para formar un sistema de bucle cerrado (Figura 2).
   7. Dentro de la incubadora, utilizar un tubo largo (de un metro de longitud) para conectar la columna de la presión a la cabeza de la bomba.
   8. Completar la puesta en marcha mediante la conexión de la cabeza de la bomba a la entrada Y-splitter con otro tubo de gran longitud (Figura 1).

   4. Venas Perfusión

   1. Después de la asamblea EVPS ha sido completed, llenar la columna con medio (permanecer por debajo del conducto de salida de la vena para permitir la recarga). Añadir más a medio en la columna hasta que el sistema esté lleno. Mover todo el sistema en la incubadora mantenida a 37 ± 0,1 ° C con un pH mantuvo constante a 7,40 ± 0,01 (utilizando un algoritmo de CO ₂ / pH basado en la ecuación de Henderson-Hasselbach).
   2. Llevar el cabezal de la bomba de engranajes fuera de la incubadora y conéctelo a la unidad de bomba de engranajes. Atornille las varillas para fijar el conjunto.
   3. Encienda la alimentación de la bomba, asegúrese de que esté activado en el software de manejo y permite 5 min para el medio a ser distribuido por igual en todos los compartimentos.
   4. Para controlar la presión, utilizar un monitoreo vía arterial. Conectar la salida de presión EVPS (que corresponde al catéter arterial) al transductor de presión vinculada a la computadora.
      1. Asegúrese de que el tubo está completamente lleno de medio y no contiene burbujas. De-burbuja el sistema de cultivo a través de la "li arterialtubo ne "(Figura 2). Preste atención a la pantalla y buscar una señal cardioide pulsátil de 60 impulsos / min de amplitud constante. En este punto, la presión media es de entre 0-10 mm Hg. Si la presión es <0 y la columna se vacía progresivamente busque una fuga (vena colateral insuficiente o sello entre la vena y el tubo).
   5. Ajuste la presión mínima a 6 mm Hg para una prueba venosa o en 90 mm Hg durante una prueba arterial. En estas condiciones, un inyector de aire se aplica la presión requerida para la columna y el sistema.
   6. Cambiar el medio cada 2 días utilizando el tubo conectado a la columna de presión. Para evitar daños en el cambio de presión, abrir el tapón de la primera columna.

   5. La finalización de la perfusión

   1. Después de 3 o 7 días de la perfusión: tomar las EVPS fuera de la incubadora y desmontar las venas. Desechar el 5 mm proximal y distal de la vena termina adjunta al equipo. Cortar una, rin 5 mm de grosor central degs del segmento restante y fijar en formol (morfometría). Congele los fragmentos restantes y reducir a polvo para otros análisis moleculares.

Resultados

El EVPS proporciona una valiosa herramienta para evaluar de forma independiente las fuerzas hemodinámicas en la vena safena humana injertos remodelación y IH.

La figura 1 muestra la cámara de perfusión y el apoyo vena. En las figuras 1A y B, el apoyo vena antes (Figura 1 A) y después (Figura 1B) de montaje, respectivamente, se representa. Está compuesto (desde la parte superior a la parte inferior) de ...

Discusión

Este estudio revela un vivo sistema de perfusión venosa ex (EVPS) para llevar a cabo extensos estudios hemodinámicos en las venas humanas. Este sistema permite que las venas safenas de perfusión bajo parámetros hemodinámicos definidos en la ausencia de factores de crecimiento y agravantes inflamatorias liberadas por las células circulantes in vivo. Por lo tanto, proporciona una mejor comprensión de las vías subyacentes implicados en el control de IH en venas humanos injertos ^5,11,...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 - Glutamax	Life Technologies	61870-010
Penicilline/Streptomycine/Fungizone	Bioconcept	4-02F00-H
Dextran from Leuconostoc spp. 500 g	Sigma-Aldrich	31390
Tampon PBS CHUV pH 7.1-7.3 1 L	Laboratorium und Grosse Apotheke Dr. G. Bichsel AG	100 0 324 00
Cryosectionning embedding medium - Tissue-Tek OCT Compound	Fisher Scientific	14-373-65
Silicon Tubing (Peroxide) L/S 16 (96400-16 ) - 7.5 m	Idex Health & Science GMBH	MF0037ST
Y-splitter	Idex Health & Science GMBH	Y-connector
35 mm Culture dish	Sigma-Aldrich	CLS430165-100EA
15 ml Falcon tube	BD Bioscence	352096
50 ml Falcon tube	BD Bioscence	352098
Gearing pump - Reglo-Z	Idex Health & Science GMBH	SM 895	App-Nr 03736-00194
Pump Head	Idex Health & Science GMBH	MI0008
Monitoring Kit TRANSPAC IV	icumedical	011-0J736-01
20 ml Syringes	B. Braun Medical SA	4612041-02
Etibon 3-0 FS-2	Ethicon- Johnson&Johnson	EH7346H
Mesh ProVena 6-8mm	B. Braun Medical SA	1105012-14
NaCl: Sodium chloride solution perfusion 0.9% (100 ml)	B. Braun Medical SA	534534
Masterflex L/S Standard Drive	Cole-Parmer Instrument Co	7521-10
Acquisition card	National Instruments	PCI-6024 E
Flowmeter module	Transonic Systems Inc.	TS410 and T402
Stopcock with 3-ways	BD Connexta Luerlock	394600
Millex Filter	Milian	SE2M229I04