Verfahren für Menschen V. saphena<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Perfusion und Außen Verstärkung

Zusammenfassung

Die Mechanismen, die zur Entwicklung von Intimahyperplasie (IH) und Vene Transplantatversagen sind immer noch wenig verstanden. Diese Studie beschreibt eine Ex-vivo-System für die menschliche Venen unter kontrollierten Durchfluss und Druck durchströmen. Darüber hinaus die Effizienz der externen Mattenbewehrung zur Begrenzung der Entwicklung der IH bewertet.

Zusammenfassung

Die Hauptstütze der modernen Therapien für umfangreiche arterielle Verschlusskrankheit ist venösen Bypass. Allerdings ist seine Haltbarkeit durch Intimahyperplasie (IH), die schließlich führt zu Gefäßverschluss und Transplantatversagen bedroht. Mechanische Kräfte, besonders niedrige Schubspannung und hohe Wandspannung, sind Gedanken zu initiieren und diese zellulären und molekularen Veränderungen zu erhalten, aber ihre genaue Beitrag bleibt entwirrt werden. Um wahlweise die Rolle von Druck und Scherbelastung auf die Biologie der IH zu bewerten, wurde eine Ex-vivo-Perfusion System (EVPS) geschaffen, um Segmente der menschlichen Stammvenen unter arterieller Therapie (hohe Schubspannung und Hochdruck) durchströmen. Weitere technische Innovationen erlaubt den gleichzeitigen Durchblutung der beiden Segmente aus der gleichen Ader, eine mit einem externen Netz verstärkt. Venen wurden mit einem No-Touch-Technik geerntet und sofort in das Labor für die Montage in der EVPS übertragen. Ein Segment des frisch isolATED Vene wurde nicht durchblutet (Kontrolle, Tag 0). Die beiden anderen Segmente wurden für bis zu 7 Tagen durchströmt, wobei ein vollständig mit einer 4 mm (Durchmesser) äußere Maschen geschützt. Der Druck, die Strömungsgeschwindigkeit und Pulsrate wurden kontinuierlich überwacht und eingestellt, um die in die Oberschenkelarterie vorherrschenden hämodynamischen Bedingungen nachzuahmen. Nach Beendigung der Perfusion wurden die Venen abmontiert und zur histologischen und molekularen Analyse verwendet. Unter Ex-vivo-Bedingungen, Hochdruck-Perfusion (arteriell, Mittelwert = 100 mm Hg) ist ausreichend, IH und Umbau der menschlichen Adern zu erzeugen. Diese Änderungen sind in der Gegenwart eines externen Polyesternetz reduziert.

Einleitung

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die häufigste Ursache von Morbidität und Mortalität in den westlichen Ländern ^1. Trotz der Fortschritte in der endovaskulären Behandlungen gemacht, bleibt Bypass-Operation die Hauptstütze der modernen Therapien, also über eine halbe Million Venentransplantate werden jährlich in den Vereinigten Staaten durchgeführt. Trotz jahrzehntelanger Forschung, 30-60% der unteren Extremität Venentransplantate nicht jedoch innerhalb der ersten Jahre durch Intimahyperplasie (IH) ^2. Mechanische Kräfte, besonders niedrige Schubspannung (SS) und hohe Wandspannung, sind ausschlaggebend für die Initiierung und Entwicklung dieser hyperplastische Reaktion ^3,4. Um dieses Problem zu lösen, wurde eine Ex-vivo-Perfusion Venen-System (EVPS) erzeugt werden, um unter streng kontrollierten hämodynamischen Bedingungen (Druck und Scherbeanspruchung), das Verhalten des menschlichen Stammvenen untersuchen. In dieser Studie, nach dem Einsetzen in die arterielle Zirkulation artigen Hochdruck (Mittelwert = 100 mm Hg) war ausreichend, um prolif stimulierenZusammenarbeit und Migration glatter Muskelzellen in der Intima-Schicht (IH) ^5.

Säugetierstudien haben die Verwendung von externen Verstärkung als eine effiziente Methode, um die "arterialisierten Vene" unterstützt und wirken der akuten hämodynamischen Veränderungen der Vene Flächen einmal in einem arteriellen Milieu implantiert vorgeschlagen. Die Maschenüberdehnung verhindert, erhöhte Scherspannung und reduzierte Wandspannung und damit IH ^6-10. Allerdings sind die zugrunde liegenden Mechanismen und ihre Anwendbarkeit auf die menschliche Venen in die Verbesserung der Durchgängigkeit Bypass noch nicht vollständig charakterisiert. Unsere EVPS wurde verwendet, um zu vergleichen, in der Bedingung imitiert die Änderungen eine Vene Gesichter einmal in einem arteriellen Therapie eingesetzt (hohe Scherbeanspruchung und Druck), die das Verhalten des menschlichen Stammvenen in Abwesenheit und Anwesenheit eines externen makroporöse Polyester Netzschlauch. Durch die Verhinderung der pathologischen Umbau-und IH, das Netz bereitgestellt Beweise für ihre mögliche klinische Effizienz ¹¹ .

Diese Studie 1) stellt ein Modell der ex vivo Perfusion menschlichen Stammvenen unter kontrolliertem Druck und Scherspannung 2) zeigt, dass externe makroporöse Polyester-Mesh reduziert IH und liefert wichtige Informationen für die mögliche klinische Anwendung.

Protokoll

Die Ethikkommission der Universität Lausanne hat den Experimenten, die in Übereinstimmung mit den in der Deklaration von Helsinki 1975 dargelegten Prinzipien sind, wie im Jahr 1983 für die Verwendung von menschlichen Geweben überarbeitet.

1. Menschen Vena saphena magna Ernte

1. Erhalten Überschuss Segmente von nicht-menschlichen Krampfadern Stammvenen von Patienten, die sich einer Bypass-Operation der unteren Extremitäten für Ischämie. Im Operationssaal, desinfizieren Sie die gesamte Bein mit einer Jod-Lösung und drapieren Sie den Patienten an das Bein von der Leiste bis zum Fuß aussetzen.
2. Machen Sie eine Medianschnitt von der Leiste bis zum Knie (Verlassen der Hautteil unterbrochen).
3. Ernten Sie die Vena saphena magna mit einem Stiel des umliegenden Gewebes (no-touch-Technik). Sichere Seitenäste der Venen mit 4-0 Seidenkrawatten. Mindestens 9 cm lang Überschuss Segment der Vena saphena magna, mit einem Außendurchmesser von 2,5-4 mm sofort bei 4 ° C in einem RPMI-1640-Glutamax Medium mit 12,5% fötalem Kälberserum und bringen sie zum Labor.

2. EVPS Design-

1. Bauen Sie die in Abbildung 1 dargestellten allgemeinen Ausrüstung. Autoklav alle Geräte und halten alle Komponenten unter sterilen Bedingungen. Darüber hinaus muss das System ist wasserdicht und hat keine Chemikalien in das Medium austritt. Verwenden Polymethacrylat- Methyl (PMMA-GS) für die Abdeckung. Stahl (X5 Cr Ni 18 10) und Polyoxymethylen Kunststoff (POM), wie die Vene Unterstützung.
2. Entwerfen der Perfusionskammer der gewünschten Geometrie, um die Platzierung der Vene und der Verbindung zu ermöglichen. Sicherstellen, dass die Tiefe (oder Radius bei Verwendung von zylindrischen Aufbau) mindestens 2,5 cm, damit es ermöglicht minimale Biegung und Dilatation des Gefäßes mit konstanter Abdeckung durch das Kulturmedium (1). Dicht ist ein wichtiges Thema und ist der Grund, rechteckige PMMA-GS Bau verwendet wird.
3. Gestalten Sie das Venenstütze in die gewünschte geometry. Um Venen Knicken oder über Blähungen zu vermeiden, lassen Längenverstellung durch Drücken oder Ziehen (Schraube nicht zu diesem Zweck verwendet werden, da die Vene würde zusammen mit der Schraube gedreht werden).
   HINWEIS: Eine vollständige Stahlstange durch 2 verbunden Schiebe L-förmigen Stücke, die die Vene 2 Zylinder unterstützen (5 mm Durchmesser, das Schiff passen) und die Vene (Abbildung 1B und 2) wird hier verwendet.
4. Entwerfen der Drucksäule, so daß die "Ruhedruck" an das System angelegt ist: p = 0-10 = hx ρ · g, wobei p = Druck (N / m ² Pa) h = Höhe der Flüssigkeitssäule (m) ρ = Dichte der Flüssigkeit (kg / m ³⁾ und g = Gravitationskonstante (9,81 m / s ^2). Design vier Verbindungskanäle, von oben nach unten: Druck ausüben, für den Austritt (aus der Vene), den Zufluss (auf die Vene) und Mediumwechsel zu ermöglichen.
5. Bereiten Sie das Medium. Basierend auf früheren Studien ^5,11-14, wählen Sie RPMI-1640, mit Glutamax ergänzt, 12,5% Fötales Kälberserum und 1% Antibiotikum-Antimykotikum-Lösung (10.000 U / ml Penicillin G, plus 10 mg / ml Streptomycinsulfat, und 25 mg / ml Amphotericin B, plus 0,5 ug / ml: Gentamycin). Scherspannung (SS) ist durch SS = 4 μQ / π * r ³ Q angegeben ist die Flussrate (ml / s), R der Radius (cm) des Venensegments, und μ ist die Viskosität der Perfusionsmedium.
   1. SS modulieren, indem die Viskosität durch Zugabe von 70 kDa Dextran. Messung der Viskosität mit einem Viskosimeter. Hier, addieren 8% 70 kDa Dextran SS 9-15 eingestellt dyn / cm ^2.
6. Stellen Sie die Getriebepumpe, eine pulsatile Nierensignal von 60 Pulsen / min, und eine konstante Amplitude Erzeugen eines unidirektionalen Fluss von 150 ± 15 ml / min, unabhängig von dem Druck in dem System von einem Computer angelegt und kontrolliert zu induzieren. Sicherzustellen, dass die Antriebs Software integriert konstanten Erfassung und Überwachung von Druck, Strömungsgeschwindigkeit, Pulsrate und Signal. Wenn Sie möchten, können eine zweite Pumpe (nicht synchronized), um eine nicht-laminare, turbulente Strömung zu erzeugen.

3. EVPS Versammlung (Abbildung 1)

1. Bevor Sie beginnen, stellen Sie sicher, alle Geräte steril ist. Führen Sie alle folgenden Schritte im Keimfreiheit in einer Steril.
2. Legen Sie die Vene in einer Petrischale mit Medium gefüllt. Verwenden Sie ein Skalpell und teilen Sie die Vene in 3 gleich große Segmente.
3. Ein Segment in PBS sofort ausspülen. Teilen Sie das Segment in 3 Teile, fix ein in Formalin für Morphometrie. Frieren die beiden anderen für die quantitative Transkript (RT-PCR) und Protein (Western-Blot) Analyse. Diese Segmente als Kontrolle, nicht-durchblutete Vene.
4. Verwenden Sie die 2 verbleibenden Segmente für die Perfusion.
   1. Sehr leicht zu injizieren Medium in die Vene und bestimmen die normale Strömungsrichtung; in Gegenwart von Ventilen die Vene wird umgekehrt.
   2. Abdichten der Venen ist von größter Bedeutung für experimentelle Erfolg. Auf Dichtheit prüfen durch Sicherheiten. Sichern Sie alle Lecks mit 6-0 Seidenfäden.
   3. Verbinden der Venenabschnitt zwischen den beiden metallischen Zylinder, dessen eines Ende zu einer Zeit (2.3, 1). Sichern Sie sich die Zylinder mit Ethibon 3-0 um die Vertiefungen (Abbildung 1A und B).
      1. Legen Sie die gesamte venöse Segment in der Perfusionskammer zuvor mit Medium gefüllt ist. Wiederholen Sie den Vorgang für das zweite Segment.
         HINWEIS: Eine fehlerhafte Abdichtung der Venen auf den Zylinder wird eine Quelle der Leck zu können, benötigen Reintervention, und das Risiko einer Infektion und experimentellen Ausfall deutlich zu erhöhen.
   4. Zur Verstärkung (Mesh) das zweite Segment, lassen Sie die beiden Zylinder (mit der Vene angebracht) von den L-förmigen Stücke (2.3 und Abbildung 1).
      1. Seien Sie sanft und die Vene nicht berühren mit allen Instrumenten. Schieben Sie die erste Masche auf dem Zylinder dann auf die Vene. Ein Push / Pull-Gedränge wird das Netz auf der Vene zu bekommen.
      2. Sobald das Gitter auf der gesamten Oberfläche der Vene sichern jacketed Vene zu den Zylindern mit Ethibon 3-0.
      3. Bauen Sie die Vene / Zylinder-Verbindung an die L-förmigen Träger und überträgt es auf die Perfusion Kammer, die zuvor mit Medium gefüllt ist.
   5. Verbinden jedes Metallzylinder (in-und Abfluss) zu einem Y-Verteiler mit Peroxid behandelten Silikonschlauch mit einem Innendurchmesser von 3,2 mm.
   6. Verbinden der Ausflussteiler mit einem zweiten Y-Verteiler mit der gleichen Art von Schläuchen. Von diesem Y-Splitter, verwenden Sie ein Rohr, um den Druck durch Perfusion beider Schiffe zu messen. Das andere ein in die Kolonne, um einen geschlossenen Schleifensystem (Figur 2) zu bilden.
   7. Im Inkubator, verwenden Sie eine lange (ein Meter Länge) Rohr, um die Drucksäule mit dem Pumpenkopf zu verbinden.
   8. Füllen Sie das durch den Anschluss des Pumpenkopfes mit dem Zulauf Y-Splitter mit einem anderen großen Länge Schlauch-Set (Abbildung 1).

   4. Veins Perfusion

   1. Nach der Montage ist EVPS Completed, füllen Sie die Spalte mit Medium (Aufenthalt unter der Vene Ablaufkanal, damit Nachfüllen). Noch ein Medium in die Spalte, bis das System voll ist. Bewegen ganze System in den Inkubator bei 37 ± 0,1 ° C bei einem pH-Wert gehalten wird konstant bei 7,40 ± 0,01 (unter Verwendung eines CO ₂ / pH-Algorithmus auf der Grundlage der Henderson-Hasselbach-Gleichung).
   2. Bringen Sie die Zahnradpumpe Kopf außerhalb des Inkubators und verbinden Sie es mit der Zahnradpumpe Laufwerk. Schrauben Sie die Stäbe, um die Montage zu sichern.
   3. Schalten Sie die Pumpleistung, stellen Sie sicher, dass es auf der Driving-Software aktiviert und erhalten Sie 5 min für das Medium, das gleichermaßen in jedem Abteil verteilt werden.
   4. Um den Druck zu überwachen, verwenden Sie einen arteriellen Leitungsüberwachung. Verbinden der EVPS Druckausgang (es den arteriellen Katheter entspricht), um den Druckwandler mit dem Computer verbunden ist.
      1. Sicherstellen, dass das Rohr vollständig mit Medium gefüllt ist und keine Luftblasen enthalten. De-Blase das Kultursystem durch die "arterielle line "Röhre (Abbildung 2). Achten Sie auf die Anzeige und suchen Sie nach einer pulsierenden Niere Signal von 60 Imp / min mit konstanter Amplitude. An diesem Punkt ist der durchschnittliche Druck zwischen 0-10 mm Hg. Wenn der Druck <0, und die Säule schrittweise leert suchen Sie nach einem Leck (Vene Sicherheiten oder unzureichende Abdichtung zwischen der Vene und der Röhre).
   5. Stellen Sie den minimalen Druck bis 6 mm Hg für eine Venentest oder bei 90 mm Hg für eine arterielle Test. Unter diesen Bedingungen gilt für eine Lufteinspritzvorrichtung den erforderlichen Druck auf die Säule und System.
   6. Ändern das Medium alle 2 Tage durch die Verwendung des Rohres an der Drucksäule verbunden ist. Um Schäden zu vermeiden Druckänderung, öffnen Sie die Spalte Stecker ersten.

   5. Abschluss der Perfusion

   1. Nach 3 oder 7 Tage der Perfusion: Nehmen Sie die EVPS aus dem Inkubator und demontieren die Venen. Entsorgen Sie die 5 mm proximalen und distalen Venenenden am Gerät angebrachten. Schneiden Sie eine zentrale, 5 mm dick rings von der verbleibenden Segment und fixieren in Formalin (Morphometrie). Frieren Sie die verbleibenden Fragmente und zu Pulver für weitere molekulare Analysen zu reduzieren.

Ergebnisse

Die EVPS bietet ein wertvolles Werkzeug, um eine unabhängige Beurteilung der hämodynamischen Kräfte auf die menschliche Vena saphena-Transplantate Umbau-und IH.

Abbildung 1 zeigt die Perfusionskammer und die Vene Unterstützung. In den 1A und B, die Vene Träger vor (1A) und nach (Abbildung 1B) Anordnung bzw. abgebildet ist. Es ist zusammengesetzt (von oben nach unten) der Ebene 1 Edelstahlrohr Mess 9 cm,...

Diskussion

Diese Studie deckt eine Ex-vivo-Perfusion Venensystem (EVPS) zu umfangreichen hämodynamischen Studien in menschlichen Adern durchzuführen. Dieses System ermöglicht Saphenavenen Perfusion unter definierten hämodynamischen Parameter in Abwesenheit erschwerender entzündlichen und Wachstumsfaktoren von zirkulierenden Zellen, die in vivo freigesetzt wird. Somit stellt es ein besseres Verständnis der zugrundeliegenden Bahnen in der Steuerung der IH in menschlichen Venentransplantate ^5,11,12,15

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 - Glutamax	Life Technologies	61870-010
Penicilline/Streptomycine/Fungizone	Bioconcept	4-02F00-H
Dextran from Leuconostoc spp. 500 g	Sigma-Aldrich	31390
Tampon PBS CHUV pH 7.1-7.3 1 L	Laboratorium und Grosse Apotheke Dr. G. Bichsel AG	100 0 324 00
Cryosectionning embedding medium - Tissue-Tek OCT Compound	Fisher Scientific	14-373-65
Silicon Tubing (Peroxide) L/S 16 (96400-16 ) - 7.5 m	Idex Health & Science GMBH	MF0037ST
Y-splitter	Idex Health & Science GMBH	Y-connector
35 mm Culture dish	Sigma-Aldrich	CLS430165-100EA
15 ml Falcon tube	BD Bioscence	352096
50 ml Falcon tube	BD Bioscence	352098
Gearing pump - Reglo-Z	Idex Health & Science GMBH	SM 895	App-Nr 03736-00194
Pump Head	Idex Health & Science GMBH	MI0008
Monitoring Kit TRANSPAC IV	icumedical	011-0J736-01
20 ml Syringes	B. Braun Medical SA	4612041-02
Etibon 3-0 FS-2	Ethicon- Johnson&Johnson	EH7346H
Mesh ProVena 6-8mm	B. Braun Medical SA	1105012-14
NaCl: Sodium chloride solution perfusion 0.9% (100 ml)	B. Braun Medical SA	534534
Masterflex L/S Standard Drive	Cole-Parmer Instrument Co	7521-10
Acquisition card	National Instruments	PCI-6024 E
Flowmeter module	Transonic Systems Inc.	TS410 and T402
Stopcock with 3-ways	BD Connexta Luerlock	394600
Millex Filter	Milian	SE2M229I04