人間の伏在静脈のための手順<em&gt;生体外</em&gt;灌流および外部補強

要約

内膜過形成（IH）及び静脈グラフト不全の発症を導くメカニズムはまだよく理解されていない。本研究では、制御された流れと圧力の下で、人間の静脈を灌流するためにex vivoでシステムが記載されている。さらにIHの開発を制限する外部メッシュ補強の効率を評価した。

要約

大規模な閉塞性動脈疾患のための現代的な治療の主力は、静脈バイパス移植である。しかし、その耐久性は、最終的には血管閉塞及び移植の失敗につながる内膜肥厚（IH）の脅威にさらされている。機械的な力、特に低せん断応力と高い壁の張力は、開始するために、これらの細胞および分子の変化を維持すると考えられているが、それらの正確な寄与は解明されていない。選択的にIHの生物学上の圧力とせん断応力の役割を評価するために、ex vivoで灌流システム（EVPS）は、動脈レジメン（高せん断応力および高圧）の下で人間の伏在静脈のセグメントを灌流するために作成されました。さらなる技術革新は、同じ静脈、外部メッシュで補強された1から2のセグメントの同時灌流を可能にした。静脈は、非接触技術を使用して採取し、直ちにEVPSアセンブリ実験室に移した。たてISOLの一つのセグメントated静脈（コントロール、0日目）に灌流されていませんでした。他の二つのセグメントが最大7日間灌流し、1は完全に4ミリメートル（直径）外部メッシュで保護されている。圧力、流速、および脈拍数を連続的にモニターし、大腿動脈内で優勢な血行力学的条件を模倣するように調整した。潅流が完了すると、静脈がディスマウントされ、組織学的および分子分析のために使用される。 エキソビボ条件下では、高圧灌流（動脈、平均値= 100 mmHgで）がIHおよびヒト静脈のリモデリングを生成するのに十分である。これらの変化は、外部ポリエステルメッシュの存在下で還元されている。

概要

心血管疾患は、欧米諸国¹における罹患率および死亡率の主要な原因である。血管内治療の進歩にもかかわらず、バイパス手術は、このように万人以上の静脈グラフトは、米国で毎年行われている、現代的な治療法の柱のまま。しかし、研究の数十年にもかかわらず、下肢静脈グラフト30〜60％が内膜肥厚^（IH）2による第一年以内に失敗する。機械的な力、特に低せん断応力（SS）と高い壁張力が、この過形成応答^3,4の開始と発展に極めて重要である。この問題に対処するために、ex vivoで静脈灌流システム（EVPS）は厳密に制御され、血行動態条件（圧力およびせん断応力）、ヒト伏在静脈の行動の下で、研究し作成した。本研究では、動脈のような循環への挿入に続いて、高圧（= 100mmHgの平均）prolifを刺激するのに十分であったや機能の内膜層^（IH）5への平滑筋細胞の遊走。

哺乳類の研究は、「動脈血静脈」をサポートし、急性の血行動態は静脈が一度動脈環境に移植の顔に変化に対抗するための効率的な方法として、外部の補強を使用することを示唆している。過膨張を防止メッシュは、せん断応力が増加し、壁張力、その結果、IH ^6-10を減少させた。しかし、根底にある機序およびバイパス開通性を向上させる上で、人間の静脈への適用は十分に特徴付けられていない。私たちのEVPS静脈を一旦動脈レジメン（高いせん断応力および圧力）、外部マクロ多孔質ポリエステル管状メッシュの非存在下および存在下でのヒト伏在静脈の挙動に挿入面する変化を模倣する条件において、比較した。病理学的リモデリングおよびIHを防止することにより、メッシュは、その潜在的な臨床効率¹¹の証拠を提供。

この研究は1）は、外部マクロ多孔質ポリエステルメッシュはIHを減少させ、その潜在的な臨床応用するために重要な情報を提供することを実証制御された圧力とせん断応力の2）の下でex vivoでのヒト伏在静脈灌流のモデルを紹介します。

プロトコル

ローザンヌ大学の倫理委員会は、ヒト組織の使用のために1983年に改訂され、1975年のヘルシンキ宣言で概説した原理に従っている実験を、承認した。

1人間の大伏在静脈の収穫

1. 虚血下肢バイパス手術を受けた患者から非静脈瘤人間伏在静脈の余剰部分を取得します。手術室では、ヨウ素溶液で脚全体を消毒し、足に脚の付け根から足を露出するために患者をドレープ。
2. 膝への鼠径部から正中切開を行います（中断された皮膚の部分を残して）。
3. 周囲の組織（ノータッチ技術）の椎弓と大伏在静脈を収穫。 4-0シルクネクタイと静脈のセキュアな側枝。すぐにRPMI-1640、G、4℃で9センチメートル2.5〜4ミリメートルの外径と大伏在静脈の長い余剰セグメントの最小値を格納するlutamax培地、12.5％ウシ胎児血清を補充した、実験室に持ってきて。

2 EVPSデザイン

1. 図1に示されている一般的な機器を組み立てます。すべての機器をオートクレーブ滅菌条件下ですべてのコンポーネントを保つ。また、システムは、防水であり、培地中に化学物質を漏洩しないことを確認してください。表紙にポリメチルメタクリレート（PMMA-GS）を使用します。スチール（X5クロムニッケル18 10）と静脈のサポートなどポリオキシメチレンプラスチック（POM）。
2. 静脈との接続の配置を可能にするために所望の形状に灌流チャンバーを設計します。 （円筒構造を使用している場合、または半径）の深さを確認してください、それが培養培地により一定報道（ 図1）と一緒に容器の最小限の屈曲および拡張を可能にするように少なくとも2.5 cmです。シールは、主要な問題であり、長方形のPMMA-GS建設が使用されている理由である。
3. 希望geometrに静脈のサポートをデザインyを。静脈よじれや膨満の上を回避するには、（静脈がねじで一緒にねじられるようねじは、その目的のために使用することはできません）押したり引っ張って長さ調節が可能です。
   NOTE：L字型（血管に適合するように直径5mm）2静脈シリンダをサポートピース及び静脈（ 図1Bおよび図2）スライド2によって接続されたフルスチールロッドは、ここで使用されている。
4. のp流体柱の= 0-10 = hxをρ×gではp =圧力（N / m ²であり、ペンシルベニア州）は、h =高さ（m）ρ：システムに適用される「静止圧」であることなど、低圧塔を設計する=液体の密度（㎏/ m ^3）であり、g =重力定数（9.81メートル/秒^2）。上から下へのデザイン4つの接続ダクト、：（静脈へ）、（静脈）からの流出のために、流入圧力を加えると培地交換を可能にするために。
5. メディアを準備します。これまでの研究^5,11-14に基づき、12.5グルタマックスを補充した、RPMI-1640]を選択します％ウシ胎児血清および1％抗生物質 - 抗真菌溶液（10,000 U / mlのペニシリンG、プラス10 mg / mlの硫酸ストレプトマイシンを加えた25 mg / mlのアムホテリシンB、プラス0.5 / mlの：ゲンタマイシン）。剪断応力（SS）は³ Qは流速（ml /秒）であるSS = 4μQ/π* rで与えられる、静脈セグメントの半径（cm）のrは、μは灌流媒体の粘度である。
   1. 70kDaのデキストランを添加して粘度を調整することでSSを調節する。粘度計粘度を測定します。ここでは、9〜15ダイン/ cm ²とSSを設定するために、8％の70kDaデキストランを追加します。
6. 60パルス/分、圧力システムに適用され、コンピュータによって制御から独立した150±15ml /分の一方向の流れを生成する一定振幅の拍カージオイド信号を誘導するために歯車ポンプを設定する。運転ソフトウェアは一定の取得と監視圧力、流速、脈​​拍数、及び信号を積分いることを確認してください。必要に応じて、第二のポンプを使用します（非同期hronized）非層流、乱流を生成する。

3 EVPSアセンブリ（図1）

1. 開始する前に、すべての機器が滅菌されていることを確認してください。層流フード内で無菌状態の下で、以下のすべての手順を実行します。
2. 媒質で満たされたペトリ皿に静脈を置きます。外科用メスを使用して、3等分静脈を分割。
3. すぐに、PBS中の1セグメントをすすぐ。 3部にセグメントを分割し、形態計測のためにホルマリンに1を修正。定量的な転写産物（RT-PCR）とタンパク質（ウェスタンブロット）分析のために他の二つをフリーズします。コントロールとして、これらのセグメントを考慮して、非灌流静脈。
4. 灌流2残りのセグメントを使用してください。
   1. 非常に穏やかに静脈内に媒体を注入し、通常の流れ方向を決定する;弁の存在下で、静脈が反転される。
   2. 静脈をシーリング実験成功に最も重要である。担保を通して漏れがないか確認してください。 6-0絹縫合糸を持つ任意のリークを固定します。
   3. 時間（2.3、 図1）での静脈2つの金属シリンダー間のセグメント、一方の端を接続します。くぼみの周りEthibon 3-0（ 図1AおよびB）でシリンダーを固定します。
      1. 以前媒質で満たされた灌流チャンバー内に全体を静脈セグメントを配置します。第二のセグメントに対して同じ手順を繰り返します。
         注記：正しくシリンダに静脈をシールしないと、漏れの原因となる再介入を必要とし、大幅に感染し、実験失敗のリスクが増加します。
   4. （メッシュ）第二のセグメントを強化するには、L字型のピース（2.3及び図1）から（添付静脈で）2シリンダーを離します。
      1. やわらかに、任意の楽器と静脈を触れないでください。静脈へのその後のシリンダの最初のメッシュをスライドさせます。プッシュ/プル押し合いは、静脈上のメッシュを取得します。
      2. メッシュはJを確保静脈の全面を覆うたらEthibon 3-0とシリンダにacketed静脈。
      3. L字型の支持体に静脈/シリンダ化合物を再構成し、以前媒質で満たされた灌流チャンバーに移す。
   5. 3.2ミリメートルの内径過酸化物で処理したシリコンチューブを使用して、Yスプリッタにそれぞれ金属製の円筒（インおよびアウトフロー）を接続します。
   6. チューブの同じタイプを使用して第2のYスプリッタに流出スプリッタを接続します。このYスプリッタからは、両方の血管を通る灌流圧を測定するために一本のチューブを使用しています。閉ループ系（ 図2）を形成するために戻って列に、もう一方を接続します。
   7. インキュベーターの内部では、ポンプヘッドに低圧塔を接続するために長い（1メートルの長さ）のチューブを使用しています。
   8. 他の長尺管を流入Yスプリッタにポンプヘッドを接続することにより設定します（ 図1）完了します。

   4。静脈灌流

   1. EVPSアセンブリは、同時された後mpleted、（補充できるように、静脈流出ダクトの下に留まる）培地でカラムを埋める。システムが一杯になるまでカラムに多くの媒体を追加します。 pHが37±0.1℃に維持インキュベーターにすべてのシステムを移動（ヘンダーソン·ハッセルバッハ式に基づいてCO ₂ / pHのアルゴリズムを使用して）7.40±0.01で一定に保った。
   2. インキュベーターの外歯車ポンプヘッドを持参し、ギアポンプドライブに接続します。アセンブリを固定する棒をねじ込み。
   3. ポンプパワーのスイッチを入れ、それが駆動ソフトウェア上で起動しても同様に、すべての区画内に分配される媒体5分を許可していることを確認してください。
   4. 圧力を監視するには、動脈ラインの監視を使用しています。コンピュータにリンクされた圧力変換器にEVPS圧力出力を（それが動脈カテーテルに相当）を接続します。
      1. チューブが完全に媒体で充填され、任意の気泡を含んでいないことを確認してください。 「動脈リチウムを通じて脱泡培養システムね"チューブ（ 図2）。ディスプレイに注意を払い、60パルス/一定の振幅の分の拍動カーディオイド信号を探します。この時点で、平均圧力0〜10 mmHgでの間である。圧力が<0で、列には、漸進的に（静脈とチューブとの間の静脈担保または不十分なシール）漏れを探して空になります。
   5. 静脈試験用または動脈試験のための90ミリメートルHgで6ミリメートルHgのに最小限の圧力を設定してください。これらの条件下で、空気インジェクタ、カラムおよびシステムに必要な圧力を加える。
   6. 高圧塔に接続されたチューブを使用して、2日ごとに培地を変更します。圧力変化の損傷を防止するために、最初の列プラグを開く。

   灌流の5。完了

   1. 灌流の3または7日後：インキュベーターからEVPSを取ると静脈をディスマウント。捨てる5mmの近位および遠位静脈が機器に付着し終了します。中央、厚さ5mm厘をカット残りのセグメントからのGSとホルマリンに（形態計測）を固定。残りのフラグメントを凍​​結し、さらなる分子解析のための粉末に減らす。

結果

EVPSは、人間の伏在静脈の再構築およびIHをグラフト上で独立して血流力を評価するための貴重なツールを提供します。

図1は、灌流チャンバーと静脈のサポートを示しています。 図1AおよびBにおいて、前静脈サポート（ 図1A）および後（ 図1B）アセンブリは、それぞれ描かれている。これは、簡単に（左か...

ディスカッション

この研究は、ヒトの静脈に広範囲血行動態の研究を実行するためのex vivoで静脈灌流システム（EVPS）をuncovers。このシステムは、 生体内で細胞を循環させることによって放出された炎症性悪化や成長因子の非存在下で定義された血行動態パラメータの下に伏在静脈灌流を可能にします。このように、人間の静脈グラフト^5,11,12,15におけるIHの制御に関与根底にある経路のよ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 - Glutamax	Life Technologies	61870-010
Penicilline/Streptomycine/Fungizone	Bioconcept	4-02F00-H
Dextran from Leuconostoc spp. 500 g	Sigma-Aldrich	31390
Tampon PBS CHUV pH 7.1-7.3 1 L	Laboratorium und Grosse Apotheke Dr. G. Bichsel AG	100 0 324 00
Cryosectionning embedding medium - Tissue-Tek OCT Compound	Fisher Scientific	14-373-65
Silicon Tubing (Peroxide) L/S 16 (96400-16 ) - 7.5 m	Idex Health & Science GMBH	MF0037ST
Y-splitter	Idex Health & Science GMBH	Y-connector
35 mm Culture dish	Sigma-Aldrich	CLS430165-100EA
15 ml Falcon tube	BD Bioscence	352096
50 ml Falcon tube	BD Bioscence	352098
Gearing pump - Reglo-Z	Idex Health & Science GMBH	SM 895	App-Nr 03736-00194
Pump Head	Idex Health & Science GMBH	MI0008
Monitoring Kit TRANSPAC IV	icumedical	011-0J736-01
20 ml Syringes	B. Braun Medical SA	4612041-02
Etibon 3-0 FS-2	Ethicon- Johnson&Johnson	EH7346H
Mesh ProVena 6-8mm	B. Braun Medical SA	1105012-14
NaCl: Sodium chloride solution perfusion 0.9% (100 ml)	B. Braun Medical SA	534534
Masterflex L/S Standard Drive	Cole-Parmer Instrument Co	7521-10
Acquisition card	National Instruments	PCI-6024 E
Flowmeter module	Transonic Systems Inc.	TS410 and T402
Stopcock with 3-ways	BD Connexta Luerlock	394600
Millex Filter	Milian	SE2M229I04