İnsan Safen Ven Prosedürü<em&gt; Ex vivo</em&gt; Perfüzyon ve Dış Takviye

Özet

Intimal hiperplazi (İH) ve ven greft yetmezliği gelişimine yol açan mekanizmalar hala tam olarak anlaşılamamıştır. Bu çalışma kontrollü akış ve basınç altında, insan damarları serpmek için bir ex vivo sistemini anlatmaktadır. Ayrıca dış hasırlı verimliliği fıtığın gelişimi değerlendirildi sınırlamak için.

Özet

Geniş tıkayıcı arter hastalığı için çağdaş tedavilerin dayanak venöz bypass greft. Ancak, dayanıklılık sonunda damar tıkanıklığı ve greft yetmezliğine yol açar intimal hiperplazi (IH) tarafından tehdit edilmektedir. Mekanik kuvvetler, özellikle düşük ve yüksek kesilme baskısı duvar gerilimi başlatmak için ve bu hücresel ve moleküler değişiklik sürdürmek için düşünülmektedir, bununla birlikte bunların tam katkı ortaya çıkarılmak üzere kalır. Seçici fıtığın biyolojisi üzerinde baskı ve kayma gerilmesi rolünü değerlendirmek için, bir ex vivo perfüzyon sistemi (Evps) arter rejimi altında insan safen venlerin (yüksek kayma gerilmesi ve yüksek basınç) segmentleri serpmek için oluşturuldu. Ayrıca teknik yenilikler Aynı şekilde, harici bir ağ ile güçlendirilmiş bir iki segment eşzamanlı perfüzyon izin verdi. Damarlar no-touch tekniği kullanılarak hasat ve hemen Evps montaj için laboratuara transfer edildi. Taze isol bir kademeliated ven (kontrol, gün 0) perfüze değildi. Diğer iki segment kadar 7 gün boyunca sıvandılar, biri tamamen bir 4 mm (çap) dış mesh ile korunaklı ediliyor. Basınç, akış hızı ve nabız hızı sürekli ve femoral arter içinde hakim olan hemodinamik koşulları taklit edecek şekilde ayarlanmıştır. Perfüzyon tamamlanmasından sonra, damarlar, demonte edilmiş ve histolojik ve moleküler analizi için kullanılmıştır. Ex vivo koşullar, yüksek basınç altında perfüzyon (arteryel, = 100 mm Hg ortalama) ve insan IH damarların yeniden modellenmesinin oluşturmak için yeterlidir. Bu değişiklikler harici bir poliester örgü mevcudiyetinde azaltılır.

Giriş

Kardiyovasküler hastalıklar Batı ülkelerinde ¹ morbidite ve mortalite nedenidir. Endovasküler tedavilerde kaydedilen ilerlemelere rağmen, bypass cerrahisi böylece yarım milyondan fazla ven greft Amerika Birleşik Devletleri'nde yılda yapılır, çağdaş tedavilerin ayağıdır. Ancak, araştırma yıllardır rağmen, alt ekstremite ven greft% 30-60 bağlı intimal hiperplazi (H) ² ilk yıl içinde başarısız. Mekanik kuvvetler, özellikle düşük kayma gerilmesi (SS) ve yüksek duvar gerilimi, bu hiperplastik yanıt ^3,4 başlamasında ve gelişmesinde hayati önem taşıyor. Bu sorunu gidermek için, bir ex vivo damarları perfüzyon sistemi (Evps) sıkı kontrol hemodinamik koşulları (basınç ve kayma gerilmesi), insan safen venlerin davranışın altında incelemek için oluşturuldu. Bu çalışmada, arter gibi dolaşıma sokulmak sonra, yüksek basınçlı Prolif teşvik etmek için yeterli olduğu (= 100 mm Hg ortalama)işleyişi ve intimal katmana (İH), ⁵ düz kas hücrelerinin göç.

Memeli çalışmalar "arteriyelize ven" desteklemek ve akut hemodinamik ven bir kez arteriyel ortamı içine implante yüzleri değişiklikleri dengelemek için etkili bir yöntem olarak dış donatı kullanımı önerilmektedir. Örgü, aşırı gerilmenin önlenir artan kesme stresi, ve duvar ve buna bağlı olarak gerginlik İH ^6-10 azalır. Ancak, altta yatan mekanizmalar ve baypas açıklığını geliştirerek insan damarlarına uygulanabilirliği tam olarak karakterize edilmemiştir. Bizim Evps damar kez bir atardamar rejimine karşı karşıya yerleştirilmiş değişiklikleri (yüksek kesme stresi ve basınç) bir dış poliester gözenekli boru şekilli örgü varlığında ve yokluğunda insan safenus damarları davranışını taklit durumda, karşılaştırmak için kullanıldı. Patolojik biçimlenme ve IH önleyerek, örgü potansiyel klinik etkinlik ¹¹ kanıt sağladı .

Bu çalışma 1) dış makro-gözenekli polyester örgü IH azaltır ve potansiyel klinik uygulama için önemli bilgiler sağladığını göstermektedir kontrollü basınç ve kayma gerilmesi 2) altında ex vivo olarak insan safen damarlar perfüzyon modeli tanıttı.

Protokol

Lozan Üniversitesi Etik Komitesi, insan dokularının kullanımı için 1983 yılında revize edilen 1975 Helsinki Bildirgesi'nde belirtilen ilkelere uygun olan deneyleri, onayladı.

1. İnsan Büyük Safen Ven Hasat

1. Iskemi için alt ekstremite bypass cerrahisi uygulanan hastalarda non-variköz insan safen venlerin arta kalan kısmında. Ameliyathanede, bir iyot çözeltisi ile tüm bacak dezenfekte ve ayak kasık bacak maruz hastayı asmak.
2. Diz kasıktan bir medyan kesi yapmak (kesintiye cilt kısmını bırakarak).
3. Doku (no-touch tekniği) çevreleyen bir sap ile büyük safen ven hasat. 4-0 ipek kravatlar ile venlerin Güvenli yan dalları. Derhal bir RPMI-1640 G'de 4 ° C'de 9 cm 2.5-4 mm'lik bir çapa sahip büyük safen ven uzun fazla segmenti, en az depolamaklutamax ortamı,% 12.5 fetal dana serumu ile takviye edilmiş ve laboratuara getirin.

2. Evps Tasarım

1. . Şekil 1'de gösterildiği genel ekipman monte tüm ekipman Otoklav ve steril koşullar altında tüm bileşenleri tutmak. Buna ek olarak, sistem, su geçirimsizdir ve ortama kimyasal sızıntı olmamasını sağlamak. Kapak için polimetakrilat'lı metil (PMMA-GS) kullanın. Çelik (X5 Cr Ni 18 10) ve damar destek olarak polioksimetilenhomo plastik (POM).
2. Ven ve bağlantı yerleşimini sağlamak için istenen geometriye perfüzyon odasına tasarlayın. Bu kültür ortamı (Şekil 1) ile sabit kapsamıyla birlikte kabın en az fleksiyon dilatasyon sağlar kadar (silindirik ya da eğer yapı ile yarıçapı) en az 2.5 cm olmalıdır derinliği olun. Sızdırmazlık önemli bir konudur ve dikdörtgen PMMA-GS inşaat kullanılan nedeni budur.
3. İstediğiniz Geometr için ven destek tasarlayınY. Ven bükülmeden veya şişliği üzerinde önlemek için, (ven vida ile birlikte bükülmüş olacak gibi vida, bu amaçla kullanılan olamaz) iterek ya da çekerek uzunluğu ayarlaması sağlar.
   Not: L-şeklindedir (damara uymak için 5 mm çaplı) 2 damar silindirleri destek parçaları ve ven (Şekil 1B ve Şekil 2) 2 sürme ile bağlanmış olan bir tam çelik çubuk burada kullanılmıştır.
4. P = 0-10 = hx ρ xg, burada p = basıncı (N / m ^2, Pa) akışkan sütunu (m) h = yükseklik ρ: basınç sütun, bu sisteme uygulanan "istirahat basıncı" olduğunu Tasarım = sıvı (kg / m ³⁾ ve g = yerçekimi sabiti (9.81 m / san ²⁾ bir yoğunluğa sahiptir. Yukarıdan aşağıya tasarım dört bağlantı kanalları,:, (damardan) çıkış için, (ven) girişini baskı uygulamak ve orta değişikliğe izin vermek.
5. Ortamı hazırlayın. Daha önceki çalışmalarda ^5,11-14 göre, 12.5 Glutamax ile takviye edilmiş RPMI-1640 tercih% Fetal dana serumu ve% 1 antibiyotik-antimisotik çözelti (10.000 U / ml penisilin G, artı 10 mg / ml streptomisin sülfat, artı 25 mg / ml amfoterisin B, artı 0.5 mg / ml: gentamisin). Kesme gerilmesi (SS), SS = 4 μQ / π * ^R3, Q ile verilir akış hızı (ml / sn), damar segmentinin uzunluğu (cm) r, ve μ, perfüzyon ortamına viskozitesidir.
   1. 70 kDa dekstran ilave edilmesi viskozitesini ayarlayarak SS modüle. Bir viskometre ile viskozitesi ölçülür. Burada, din / cm ² 9-15 üzere SS ayarlamak için 8% 70 kDa dekstran ekleyin.
6. 60 darbe / dakika, sabit genlikte, bir bilgisayar tarafından sisteminde uygulanan ve kontrol basıncından bağımsız 150 ± 15 ml / dak bir tek yönlü akışı üreten bir pulsatil kardioid sinyalini indüklediği dişli pompa ayarlayın. Sürüş yazılım sabit toplama ve baskıların izleme, akış hızı, nabız ve sinyal entegre emin olun. İstenirse ikinci bir pompa kullanmak (sigara senkronhronized) olmayan bir laminar, türbülanslı bir akış oluşturmak için.

3. Evps Meclisi (Şekil 1)

1. Başlamadan önce, tüm ekipman steril olduğundan emin olun. Laminar akış asepsi altında şu adımları uygulayın.
2. Ortam ile doldurulmuş bir Petri kabındaki ven yerleştirin. Cerrahi bıçak kullanın ve 3 eşit parçaya içine ven bölmek.
3. Hemen PBS içinde bir segment yıkayın. , 3 parça kesimi bölün morfometre için formalin sabitleyin. Nicel transkripti (RT-PCR) ve protein (Batı leke) analizi için diğer iki dondurun. Bir kontrol, perfüze olmayan ven olarak bu segmentleri düşünün.
4. Perfüzyon için kalan 2 segmentleri kullanın.
   1. Çok yavaşça damara madde enjekte ve normal akış yönünü belirler; valf mevcudiyetinde damar tersine çevrilir.
   2. Damarları Sızdırmazlık deneysel başarısı için büyük önem taşımaktadır. Teminat ile sızıntıları kontrol edin. 6-0 ipek dikişlerle sızıntıları sabitleyin.
   3. Bir seferde (bir 2.3, Şekil 1) damar iki metal silindir arasında bir bölümü, bir ucunu. Çentikler (Şekil 1A ve B) etrafında Ethibon 3-0 silindirleri sabitleyin.
      1. Daha önce ortam ile doldurulur perfüzyon odasına tüm venöz parçayı. Ikinci segment için aynı işlemi tekrarlayın.
         Düzgün silindire ven mühürlemek için başarısızlık sızıntı kaynağı olacaktır tekrar girişim gerektiren, ve önemli ölçüde enfeksiyon ve deneysel başarısızlık riskini artırır: NOT.
   4. Ikinci segmenti pekiştirmek (mesh) için L-şekilli parçalar (2.3 ve Şekil 1) den (ekli ven) ile iki silindir bırakın.
      1. Nazik olun ve herhangi aletleri ile damar dokunmayın. Ven üzerine daha sonra silindir ilk örgü kaydırın. Bir itme / çekme Jostling ven örgü alacak.
      2. Örgü kapsayan kez venin tüm yüzeyi j sabitlemekEthibon 3-0 silindirlere acketed damar.
      3. L-şekilli destek ven / silindir bileşiği yeniden birleştirmek ve daha önce ortam ile doldurulur perfüzyon odasına transfer.
   5. 3.2 mm'lik bir iç çapa sahip peroksit ile muamele edilmiş silikon tüp kullanılarak Y-ayırıcıya her bir metal silindir (in ve çıkış) bağlanır.
   6. Hortumun aynı türünü kullanarak ikinci bir Y-splitter için çıkış splitter bağlayın. Bu Y-splitter, hem damarları aracılığıyla perfüzyon basıncını ölçmek için bir tüp kullanın. Kapalı devre sistemi (Şekil 2) oluşturulması için tekrar sütuna diğer birini kullanabilirsiniz.
   7. Inkübatör içinde, pompa kafasına basınçlı sütun bağlamak için bir uzun (bir metre uzunluğunda) boruyu kullanır.
   8. Başka bir uzun boyu tüp ile giriş Y-splitter için pompa kafasını bağlayarak kurmak (Şekil 1) tamamlayın.

   4. Damarlar Perfüzyon

   1. Evps montaj ko olmuştur sonrampleted, orta sütunu dolduran (dolumu izin ven çıkış kanalı altında kalmak). Sistem tam kadar sütuna daha orta ekleyin. Bir pH 37 ± 0.1 ° C sıcaklıkta muhafaza inkübatör içine tüm sistemi hareket (Henderson-Hasselbach denkleme dayalı _CO2 / pH algoritmasını kullanarak) 7.40 ± 0.01 'de sabit tutulur.
   2. Inkübatör dışında dişli pompa kafasını getirin ve dişli pompa sürücüye takın. Düzeneğini sabitlemek için çubuklar vida.
   3. Pompa gücü açın, bu sürüş yazılımında aktif olduğundan emin olun ve orta derecede her kompartımanda dağıtılmak üzere 5 dk bekleyin.
   4. Basıncını izlemek için, bir arteriyel hat izleme kullanın. Bilgisayara bağlı basınç transdüktörüne Evps basınç çıkışı (bu arteriyel kateter karşılık gelir) takın.
      1. Tüp tamamen ortam ile doldurulur ve kabarcıkları içermeyen emin olun. "Arteriyel li yoluyla De-kabarcık kültür sistemine "tüp (Şekil 2). Ekrana dikkat edin ve 60 darbe / sabit genlikli dk pulsatil Kardioit sinyali arayın. Bu noktada, ortalama basınç, 0-10 mm Hg arasındadır. Basıncı <0 ve sütun kademeli (ven ve tüp arasındaki ven teminat veya yetersiz mühür) bir sızıntı bakmak boşaltır edin.
   5. Venöz testi ya da bir atardamar test için 90 mm Hg'de 6 mm Hg için en az bir baskı ayarlayın. Bu koşullar altında, bir hava enjektörü, kolon ve sistem için gerekli basıncı uygular.
   6. Basınç kolonuna bağlanır tüp kullanarak her 2 günde bir ortam değiştirme. , Basınç değişimi zarar görmesini önlemek İlk sütun fişi açmak için.

   Perfüzyonunun 5. Tamamlama

   1. Perfüzyon 3 veya 7 gün sonra: kuluçka Evps almak ve damarları kaldırılıyor. 5 mm yakınma atın ve distal damar ekipmanlara bağlı uçları. Merkezi, 5 mm kalınlığında rin KesmeKalan segmentinden gs ve formalin (morfometrisi) düzeltmek. Kalan parçaları dondurun ve daha fazla moleküler analizler için toz haline azaltır.

Sonuçlar

Evps insan safen ven biçimlenme ve IH greftler üzerinde bağımsız hemodinamik güçleri değerlendirmek için değerli bir araç sağlar.

Şekil 1, perfüzyon odasına ve damar desteğini göstermektedir. Şekil 1A ve B, önce ven destek (Şekil 1A) ve sonrası (Şekil 1B) montaj, sırasıyla, resmedilmiştir. Kolayca (soldan sağa) kayabileceği 2 L şeklinde parçaları için bir destek olarak hizmet 9...

Tartışmalar

Bu çalışma, insan damarlarında yoğun hemodinamik çalışmalar gerçekleştirmek için bir ex vivo ven perfüzyon sistemi (Evps) ortaya çıkarır. Bu sistem, in vivo hücreleri tarafından serbest dolaşan ağırlaştırıcı iltihaplı ve büyüme faktörlerinin yokluğunda tanımlanmış hemodinamik parametreleri altında, safenöz ven perfüzyon sağlar. Bu nedenle, insan damar greftleri ^5,11,12,15 içinde IH kontrolü ile ilgili temel yolakların daha iyi anlaşılmasını sağlar....

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 - Glutamax	Life Technologies	61870-010
Penicilline/Streptomycine/Fungizone	Bioconcept	4-02F00-H
Dextran from Leuconostoc spp. 500 g	Sigma-Aldrich	31390
Tampon PBS CHUV pH 7.1-7.3 1 L	Laboratorium und Grosse Apotheke Dr. G. Bichsel AG	100 0 324 00
Cryosectionning embedding medium - Tissue-Tek OCT Compound	Fisher Scientific	14-373-65
Silicon Tubing (Peroxide) L/S 16 (96400-16 ) - 7.5 m	Idex Health & Science GMBH	MF0037ST
Y-splitter	Idex Health & Science GMBH	Y-connector
35 mm Culture dish	Sigma-Aldrich	CLS430165-100EA
15 ml Falcon tube	BD Bioscence	352096
50 ml Falcon tube	BD Bioscence	352098
Gearing pump - Reglo-Z	Idex Health & Science GMBH	SM 895	App-Nr 03736-00194
Pump Head	Idex Health & Science GMBH	MI0008
Monitoring Kit TRANSPAC IV	icumedical	011-0J736-01
20 ml Syringes	B. Braun Medical SA	4612041-02
Etibon 3-0 FS-2	Ethicon- Johnson&Johnson	EH7346H
Mesh ProVena 6-8mm	B. Braun Medical SA	1105012-14
NaCl: Sodium chloride solution perfusion 0.9% (100 ml)	B. Braun Medical SA	534534
Masterflex L/S Standard Drive	Cole-Parmer Instrument Co	7521-10
Acquisition card	National Instruments	PCI-6024 E
Flowmeter module	Transonic Systems Inc.	TS410 and T402
Stopcock with 3-ways	BD Connexta Luerlock	394600
Millex Filter	Milian	SE2M229I04