Порядок человека подкожных вен<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Перфузии и внешнего подкрепления

Резюме

Механизмы, ведущие к развитию гиперплазии интимы (Ih) и вены отторжения трансплантата до сих пор мало изучены. Это исследование описывает экс естественных систему заливать человека вены в контролируемых расхода и давления. Кроме того, эффективность внешней арматуры сетки, чтобы ограничить развитие IH оценивали.

Аннотация

Основой современных методов лечения для широкого окклюзионной артерий является венозная шунтирование. Тем не менее, его долговечность угрожает гиперплазии интимы (IH), что в конечном итоге приводит к окклюзии сосудов и отторжения трансплантата. Механические силы, особенно с низким напряжение сдвига и высокой напряженности стены, как полагают, чтобы инициировать и поддерживать эти клеточные и молекулярные изменения, но их точное вклад еще предстоит разгадать. Чтобы выборочно оценить роль давления и напряжения сдвига на биологии IH, экс естественных перфузии система (ЦПС) была создана, чтобы заливать сегменты подкожных вен человека при артериальной режима (стресс при высокой скорости сдвига и высокого давления). Дальнейшие технические новшества позволили одновременное перфузии двух отрезков от том же ключе, один армированной внешней сетки. Вены собирали с помощью метода нет касание и сразу переданы в лабораторию для сборки в ЦПС. Один сегмент свежемолотым Isolованные вены не перфузировали (контроль, день 0). Два других сегментов перфузировали на срок до 7 дней, один из которых полностью защищенных с 4 мм (диаметр) внешнего сетки. Давление, скорость потока, и пульс были Постоянный мониторинг и корректировка, чтобы имитировать гемодинамики условия, существующие в бедренную артерию. По окончании перфузии, вены были демонтированы и использованы для гистологического и молекулярного анализа. Под бывших естественных условиях, перфузии высокого давления (артериальной, среднее = 100 мм рт.ст.) достаточно для генерации IH и реконструкцию человека вен. Эти изменения сводятся в присутствии внешнего полиэфирной сетки.

Введение

Сердечно-сосудистые заболевания являются ведущей причиной заболеваемости и смертности в западных странах ^1. Несмотря на достигнутые сдвиги в эндоваскулярного лечения, шунтирование остается основой современных методов лечения, таким образом более полумиллиона венозных шунтов ежегодно производится в США. Тем не менее, несмотря на десятилетия исследований, 30-60% нижних конечностей венозных шунтов терпит неудачу в течение первых лет в связи с гиперплазией интимы (IH) ^2. Механические силы, особенно с низким напряжение сдвига (SS) и высокая стена напряженность, являются ключевыми в инициации и развитии этого гиперплазированной ответ ^3,4. Для решения этого вопроса, экс естественных условиях вены перфузии система (ЦПС) был создан для изучения, в строго контролируемых условиях гемодинамики (давление и напряжение сдвига), поведения человека подкожных вен. В этом исследовании, после введения в артериальной-обращении, как, высокое давление (среднее = 100 мм рт.ст.) было достаточно, чтобы стимулировать prolifие и миграции гладкомышечных клеток интимы в слое (Ih) ^5.

Млекопитающих исследования показали, использование внешнего армирования в качестве эффективного метода для поддержки "arterialized вену" и противодействовать острый гемодинамические изменения вены лица после имплантации в артериальной среде. Сетка предотвратили более-живота, увеличение напряжения сдвига, и снижается напряжение стенок и, следовательно IH ^6-10. Тем не менее, основные механизмы и его применимость к человеческим венам в улучшении обходной проходимость не были полностью характеризуется. Наши ЦПС был использован для сравнения, в состоянии, имитирующих изменения вены лица один раз, вставленные в артериальной режима (стресс при высокой скорости сдвига и давления), поведение подкожных вен человека в отсутствие и в присутствии внешнего макропористом полиэстер трубчатой ​​сетки. По предотвращения патологического ремоделирования и IH, сетка представил доказательства своей потенциальной клинической эффективности ¹¹ .

Это исследование 1) вводит модель экс естественных человека подкожных вен перфузии под регулируемым давлением и напряжением сдвига 2) показывает, что внешняя макро-пористых полиэфирной сетки уменьшает IH и предоставляет важную информацию для ее потенциального клинического применения.

протокол

Этический комитет Университета Лозанны утвердил эксперименты, которые в соответствии с принципами, изложенными в Хельсинкской декларации 1975 года, в редакции 1983 для использования тканей человека.

1 человека большой подкожной вены Harvest

1. Получить излишки сегменты без варикозных человека подкожных вен у пациентов, перенесших нижний обводной конечностей хирургии для ишемии. В операционной, дезинфицировать всю ногу с раствором йода и драп пациента, чтобы выставить ногу от паха до стопы.
2. Сделайте средний надрез от паха до колена (выезд прерванный часть кожи).
3. Урожай большой подкожной вены с плодоножкой окружающих (технику не-сенсорный) ткани. Безопасные боковые ветви вен с 4-0 шелковых галстуков. Сразу хранения минимум 9 см в длину избыток сегмента большой подкожной вены, с внешним диаметром 2,5-4 мм при 4 ° С в среде RPMI-1640 Glutamax среднего, с добавлением 12,5% эмбриональной телячьей сыворотки и привести его в лабораторию.

2 ЦПС Дизайн

1. Соберите общее оборудование, показанное на рисунке 1. Автоклав все оборудование и держать все компоненты в стерильных условиях. Кроме того, убедитесь, что система является водонепроницаемым и не протекает химических веществ в среде. Используйте Полиметакрилат метил (PMMA-GS) для обложки. Сталь (X5 Cr Ni 18 10) и полиоксиметилен пластик (ПОМ) в качестве носителя вены.
2. Конструкция перфузии камеры до желаемой геометрии, чтобы позволить размещение в вену и ее связи. Убедитесь, что глубина (или радиус при использовании цилиндрическую конструкцию), по крайней мере 2,5 см, так что позволяет минимальное сгибание и дилатацию сосуда вместе с постоянной охвата культуральной среде (рисунок 1). Уплотнение является серьезной проблемой и является причиной прямоугольная конструкция PMMA-GS используется.
3. Дизайн поддержку вены в нужное геометру. Чтобы избежать вены перегибов или более растяжение, позволяют регулировать длину на толкать или тянуть (винт не могут быть использованы для этой цели, так как вены бы быть скручены вместе с винтом).
   ПРИМЕЧАНИЕ: полный стальной стержень соединены 2 раздвижных Г-образные части, которые поддерживают вены цилиндров 2 (диаметр 5 мм, чтобы соответствовать судно) и в вену (рисунок 1b и Рисунок 2) здесь используется.
4. Дизайн столбец давления, такой, что "отдыхает давление" применяется к системе является: P = 0-10 = HX ρ XG, где р = давление (Н / м ^2, Па) ч = высота столба жидкости (м) ρ = плотность жидкости (кг / м ³⁾ и г = гравитационной постоянной (9,81 м / с ^2). Дизайн четыре протоки подключения, сверху вниз: для оказания давления, для оттока (из вены), приток (в вену) и позволить среднего изменения.
5. Подготовьте среду. Основываясь на предыдущих исследованиях ^5,11-14, выбрать RPMI-1640, дополненной Glutamax, 12.5% Фетальной телячьей сыворотки и 1% антибиотиков противогрибковое раствор (10000 ед / мл пенициллина G, плюс 10 мг / мл стрептомицина сульфата, а также 25 мг / мл амфотерицина В, плюс 0,5 мкг / мл): гентамицин. Напряжение сдвига (SS) задается SS = 4 μQ / π * R ³ Q является расход (мл / сек), г радиус (см) сегмента вены, и μ является вязкость перфузии среды.
   1. Модулируйте SS посредством регулирования вязкости добавлением через 70 кДа декстрана. Измерьте вязкость с помощью вискозиметра. Здесь, добавить 8% 70 кДа декстран установить SS в 9-15 дин / см ^2.
6. Установка зубчатой ​​передачи насос, чтобы вызвать пульсацию кардиоидной сигнал 60 импульсов / мин и постоянной амплитуды генерации однонаправленный поток 150 ± 15 мл / мин, независимое от давления, приложенного в контролируемой системе, и с помощью компьютера. Убедитесь, что движущей программное обеспечение включает постоянное приобретение и мониторинг давления и скорости потока, частота пульса и сигнала. При желании, использовать второй насос (не синхронизацияhronized), чтобы получить нон-ламинарный, турбулентный поток.

3 ЦПС Ассамблея (Рисунок 1)

1. Перед началом, убедитесь, что все оборудование является стерильным. Выполнять все описанные ниже шаги в рамках асептики в ламинаре.
2. Поместите вену в чашку Петри со средой. Используйте хирургического лезвия и разделить вену на 3 равные части.
3. Немедленно промойте один сегмент в PBS. Разделите сегмент в 3 частях, исправить один в формалине для морфометрии. Замораживание два других для количественного стенограмма (RT-PCR) и белка (вестерн-блот) анализа. Рассмотрим эти сегменты как контроль, нераспространение-перфузии вены.
4. Используйте 2 оставшихся сегментов для перфузии.
   1. Очень осторожно вводят среду в вену и определения нормальной направление потока; в наличии клапанов вен восстанавливается.
   2. Уплотнение вены имеет первостепенное значение для экспериментальной успеха. Убедитесь в отсутствии утечек через залогов. Зафиксируйте все течи 6-0 шелковыми швами.
   3. Подключите вен сегмент между двумя металлическими цилиндрами, один конец за один раз (2,3, рис 1). Закрепите цилиндры с Ethibon 3-0 вокруг углубления (Рисунок 1А и В).
      1. Поместите всю венозную сегмент в перфузии камеры ранее заполненной среде. Повторите ту же процедуру для второго сегмента.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Неправильное запечатать вену в цилиндр будет источником утечки, требуют повторных операций, и значительно увеличить риск инфекции и экспериментальной неудачи.
   4. Для усиления (сетка) второй сегмент, выпустить два цилиндра (с вены прилагается) от Г-образных фигур (2,3 и рис 1).
      1. Будьте нежны и не прикасайтесь к вену с любыми инструментами. Авто сетку сначала на цилиндр затем на вены. Тяни / Толкай толкотня получите сетку на вены.
      2. После того, как сетка покрывает всю поверхность вены обеспечить Jacketed вены в цилиндры с Ethibon 3-0.
      3. Соберите вены / цилиндра соединение с L-образный поддержку и передать его на камеры перфузии, ранее заполненной среде.
   5. Подключите каждый металлический цилиндр (в-и оттока) в Y-разветвитель с помощью перекиси обращению силиконовые трубки с внутренним диаметром 3,2 мм.
   6. Подключение разветвитель оттока на второй Y-разветвитель, используя тот же тип трубы. С этой Y-разветвитель, использовать одну трубку для измерения давления перфузии через обоих судов. Подключите другой его обратно в колонну, чтобы образуют замкнутую систему цикла (Рисунок 2).
   7. Внутри инкубатора, использовать длинный (один метр длины) трубки для подключения колонки давления к головке насоса.
   8. Завершения настройки при подключении насоса голову к притока Y-разветвитель на другой большой длины трубы (рисунок 1).

   4 Вены перфузии

   1. После сборки ЦПС был совместноmpleted, заполнить колонку со средой (оставаться ниже оттока вены канала, чтобы позволить заправки). Добавить больше среду в колонну, пока система не будет заполнен. Перемещение всю систему в инкубаторе при температуре 37 ± 0,1 ° С с рН поддерживали на постоянном уровне 7,40 ± 0,01 (с использованием алгоритма СО ₂ / рН, основанный на уравнении Хендерсон-Хассельбаха).
   2. Принесите голову передач насоса вне инкубатора и подключить его к приводу передач насоса. Винтовые стержни чтобы закрепить.
   3. Перейти от мощности накачки, убедитесь, что он активируется на программное обеспечение вождения и позволяют 5 мин, чтобы среда равномерно распределяется в каждом отсеке.
   4. Чтобы контролировать давление, использовать мониторинг артериального строки. Подключите выход давления ЦПС (это соответствует артериального катетера) к датчику давления, связанного с компьютером.
      1. Убедитесь, что трубка полностью заполнена средой и не содержит никаких пузырей. Де-пузырь систему культуры через "артериальной Liпе "трубка (Рисунок 2). Обратите внимание на дисплее и отыскать пульсирующим кардиоидной сигнала 60 импульсов / мин с постоянной амплитудой. В этот момент, среднее давление находится в диапазоне от 0-10 мм рт. Если давление <0 и столбец постепенно впадает искать утечки (вен залога или ненадлежащее уплотнения между веной и трубки).
   5. Установите минимальное давление на 6 мм рт.ст. для венозной теста или на 90 мм рт.ст. для артериальной теста. В этих условиях, воздушного инжектора применяется требуемое давление в колонне и системы.
   6. Изменение среды каждые 2 дня, используя трубку, подключенный к колонке давления. Для предотвращения ущерба от изменения давления, откройте пробку столбца первой.

   5 Завершение перфузии

   1. После 3 или 7 дней перфузии: принять ЦПС из инкубатора и демонтировать вены. Откажитесь от 5 мм ближней и дальней вены концы прикреплены к оборудованию. Вырезать центральную, толщина 5 мм РинGS от оставшегося сегмента и исправить в формалина (морфометрии). Заморозьте оставшиеся фрагменты и уменьшить в порошок для дальнейших молекулярных анализов.

Результаты

ЦПС предоставляет ценный инструмент самостоятельно оценить гемодинамические силы на подкожная вена человек прививает ремоделирования и IH.

На рисунке 1 показана перфузии камеры и поддержку вену. На рисунках 1А и В, поддержка вены до (1А)

Обсуждение

Это исследование раскрывает экс естественных условиях вены перфузии системы (ЦПС) на выполнение работ по гемодинамики исследования в человека вен. Эта система позволяет подкожных вен перфузии при определенных параметров гемодинамики при отсутствии отягчающих воспалительных и ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 - Glutamax	Life Technologies	61870-010
Penicilline/Streptomycine/Fungizone	Bioconcept	4-02F00-H
Dextran from Leuconostoc spp. 500 g	Sigma-Aldrich	31390
Tampon PBS CHUV pH 7.1-7.3 1 L	Laboratorium und Grosse Apotheke Dr. G. Bichsel AG	100 0 324 00
Cryosectionning embedding medium - Tissue-Tek OCT Compound	Fisher Scientific	14-373-65
Silicon Tubing (Peroxide) L/S 16 (96400-16 ) - 7.5 m	Idex Health & Science GMBH	MF0037ST
Y-splitter	Idex Health & Science GMBH	Y-connector
35 mm Culture dish	Sigma-Aldrich	CLS430165-100EA
15 ml Falcon tube	BD Bioscence	352096
50 ml Falcon tube	BD Bioscence	352098
Gearing pump - Reglo-Z	Idex Health & Science GMBH	SM 895	App-Nr 03736-00194
Pump Head	Idex Health & Science GMBH	MI0008
Monitoring Kit TRANSPAC IV	icumedical	011-0J736-01
20 ml Syringes	B. Braun Medical SA	4612041-02
Etibon 3-0 FS-2	Ethicon- Johnson&Johnson	EH7346H
Mesh ProVena 6-8mm	B. Braun Medical SA	1105012-14
NaCl: Sodium chloride solution perfusion 0.9% (100 ml)	B. Braun Medical SA	534534
Masterflex L/S Standard Drive	Cole-Parmer Instrument Co	7521-10
Acquisition card	National Instruments	PCI-6024 E
Flowmeter module	Transonic Systems Inc.	TS410 and T402
Stopcock with 3-ways	BD Connexta Luerlock	394600
Millex Filter	Milian	SE2M229I04