인간 복재 정맥 절차<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 관류 및 외부 보강

요약

내막 증식증 (IH) 및 정맥 이식 실패의 개발로 이어지는 메커니즘은 아직 제대로 이해하고 있습니다. 이 연구는 제어 흐름과 압력 하에서 인간의 혈관을 관류하는 생체 시스템을 설명합니다. 또한 외부 메쉬 보강 효율 IH의 개발 평가 하였다 제한한다.

초록

광범위한 폐색 성 동맥 질환에 대한 현대적인 치료의 주류는 정맥 우회술이다. 그러나, 내구성은 결국 혈관 폐색 이식 실패에 이르게 내막 증식증 (IH)에 의해 위협됩니다. 기계의 힘, 특히 낮은 전단 응력과 높은 벽 장력은, 시작하고 이러한 세포 및 분자 변화를 유지하는 것으로 생각되지만, 자신의 정확한 기여를 풀어 일이다. 선택적 IH의 생물학에 대한 압력과 전단 응력의 ​​역할을 평가하기 위해, 생체 외 관류 시스템 (EVPS)는 동맥 요법에서 인간 복재 정맥 (높은 전단 응력 및 고압)의 세그먼트를 관류하기 위해 만들어졌습니다. 또한, 기술 혁신은 같은 맥락, 외부 메쉬 철근이 하나의 세그먼트를 동시에 관류시켰다. 정맥 노 터치 기술을 사용하여 수확하고 즉시 EVPS에 조립 실험실로 옮겼다. 갓 ISOL의 한 세그먼트나타나는데 정맥 (제어, 일 영)을 관류되지 않았습니다. 다른 두 세그먼트가 최대 칠일 관류하고, 하나는 완전히 4mm (직경) 외부 메쉬 숨겨된다. 압력, 유속 및 맥박수를 연속적으로 모니터링하고 대퇴 동맥에 지배적 혈역학 조건을 모방하도록 조정 하였다. 재관류 완료되면, 정맥 분리하고, 조직 학적 및 분자 분석을 사용 하였다. 생체 외 조건, 고압 하에서 관류 (동맥, = 100 mmHg로 평균) IH 인간 혈관의 리모델링을 생성하기에 충분하다. 이러한 변화들은 외부 메쉬 폴리 에스테르의 존재하에 감소된다.

서문

심장 혈관 질환은 서구 국가 ^하나의 이환율과 사망률의 주요 원인입니다. 혈관 내 치료에 만든 발전에도 불구하고, 바이 패스 수술을 따라서 만 절반 이상 정맥 이식은 미국에서 매년 수행, 현대 치​​료의 의지가 남아있다. 그러나 수십 년간의 연구에도 불구하고, 하체의 정맥 이식의 30~60% 인해 내막 증식증 (IH) ^2에 첫번째 년 안에 실패한다. 기계의 힘, 특히 낮은 전단 응력 (SS) 및 높은 벽 장력이 증식 응답 ^3,4의 시작과 발전에 중추적입니다. 이 문제를 해결하기 위해, 생체 혈관의 관류 시스템 (EVPS)을 엄격하게 통제 혈역학 적 상태 (압력, 전단 응력), 인간 복재 정맥의 동작에 따라, 공부 생성되었습니다. 이 연구에서, 동맥 순환 형으로 삽입 다음, 고압 prolif을 자극하기에 충분 하였다 (= 100 mmHg로 의미)eration과 내막 층 (IH) ^{(5) 내로} 평활근 세포의 이주.

포유 동물의 연구는 "동맥 화 정맥"지원 급성 혈역학이 한번 정맥 동맥에 주입을 향하는 적 환경 변화에 대처하는 효율적인 방법으로서 외부 보강의 사용을 제안했다. 메시는, 과잉 팽창이 방지 증가 전단 응력 및 벽 장력 결과적 IH ^{6-10 줄였다.} 그러나 기본 메커니즘과 바이 패스 개통을 개선 인간의 혈관에 그것의 적용이 완전히 특징되지 않았다. 우리 EVPS는 정맥 번 동맥 섭생에 삽입 대향 변화 (고 전단 응력 및 압력), 외부 거대 다공성 폴리 관형 메쉬의 부재 및 존재하에 인간 복재 정맥의 행동을 모방하는 조건에서 비교하기 위해 사용되었다. 병적 리모델링 및 IH 방지함으로써, 메시는 잠재적 임상 효율 ^(11)의 증거를 제공 .

본 연구 1)는 외부 매크로 다공성 폴리 에스테르 메쉬 IH을 줄이고 잠재적 인 임상 응용 프로그램에 대한 중요한 정보를 제공한다는 것을 보여줍니다 제어 압력과 전단 응력 2)에서 생체 인간 복재 정맥 혈류의 모델을 소개합니다.

프로토콜

로잔 대학의 윤리위원회는 인체 조직의 사용을 1983 년 개정, 1975 년 헬싱키 선언에 명시된 원칙에 따라 아르 실험을 승인했다.

1 인간 대 복재 정맥 수확

1. 허혈 하체 바이 패스 수술을받은 환자에서 비 정맥류 인간 복재 정맥의 잉여 세그먼트를 얻습니다. 수술실에서, 요오드 용액과 다리 전체를 소독하고 발에 사타구니에서 다리를 노출하는 환자를 내리면.
2. 무릎에 사타구니에서 중간 절개를 (중단 피부 부분을 떠나).
3. 조직 (노 터치 기술을) 주변의 척추 경에 큰 복재 정맥을 수확. 4-0 실크 넥타이와 혈관의 보안 측면 분기합니다. 즉시 RPMI-1640 G에서 4 ° C에서 9cm 2.5-4 mm의 외부 직경이 큰 복재 정맥의 긴 잉여 세그먼트의 최소 저장lutamax 매체는, 12.5 % 태아 혈청으로 보충하고 실험실로 가져옵니다.

2 EVPS 디자인

1. . 그림 1에 나와있는 일반적인 장비를 조립 모든 장비를 오토 클레이브 멸균 조건에서 모든 구성 요소를 유지합니다. 또한, 시스템은 방수 및 배지에 화학 물질이 누출되지 않도록. 표지 폴리 메타 크릴 메틸 (PMMA-GS)를 사용합니다. 스틸 (X5 크롬 니켈 18 10) 및 정맥 지지체로서 폴리 옥시 메틸렌 수지 (POM).
2. 정맥과 연결의 배치를 허용하도록 원하는 형상으로 관류 챔버를 설계한다. 이 배양 배지 (그림 1)에 의해 일정한 범위와 함께 선박의 최소 굴곡과 팽창을 할 수 있도록 (원통형 구조를 사용하는 경우 또는 반경) 최소 2.5 cm 있는지 깊이를 확인합니다. 밀봉은 중요한 문제이며, 직사각형 PMMA-GS 건설이 사용되는 이유입니다.
3. 원하는 geometr에 정맥 지원 디자인y를 입력합니다. 정맥 또는 꼬임 위에 팽만을 피하기 위해, (정맥이 나사와 함께 꼬아 것처럼 스크류, 그 목적으로 사용될 수 없다) 밀거나 당기는 길이 조정을 허용한다.
   참고 : L 모양 (선박에 맞게 5mm 직경)이 정맥 실린더를 지원하는 조각 및 정맥 (그림 1B와 그림 2) 슬라이드 2에 연결하는 강재의로드 여기에 사용됩니다.
4. P = 0-10 = HX ρ XG, 여기서 P = 압력 (N / m ^2, PA) 유체 열 (m)의 H = 높이 ρ : 압력 열, 같은 시스템에 적용 "휴식 압력"이라고 디자인 = 액체 (kg / m ^3), g = 중력 상수 (9.81 m / 초 ^2)의 밀도. 위에서 아래로 디자인 넷 연결 덕트 : (정맥) 유출에 대한 (정맥) 유입 압력을 적용하고 매체 변경을 허용 할 수 있습니다.
5. 매체를 준비합니다. 이전의 연구 ^5,11-14을 바탕으로, 12.5 Glutamax 보충, RPMI-1640을 선택% 소 태아 혈청, 1 %의 항생제 항진균제 용액 (10,000 U / ㎖ 페니실린 G, 플러스 10 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신 황산염, 플러스 25 ㎎ / ㎖ 암포 테리 신 B, 플러스 0.5 ㎍ / ㎖의 : 겐타 마이신). 전단 응력 (SS)가 SS = 4 μQ / π의 * r을 ³ Q 주어진다하면 유속 (㎖ / 초), 정맥 세그먼트의 반경 (cm)을 r에, 그리고 μ는 관류 매질의 점도이다.
   1. 70 kDa의 덱스 트란을 첨가하여 점도를 조정 SS를 변조. 점도계와 점도를 측정한다. 여기에, DYN / cm ² 9-15에 SS를 설정 8퍼센트 70 kDa의 덱스 트란을 추가합니다.
6. 60 펄스 / 분 정 진폭이 컴퓨터 시스템에인가되고 제어 압력 독립적 150 ± 15 ㎖ / 분의 단방향 흐름을 생성 박동성 카디오이드 신호를 유도하는 기어 펌프를 설정한다. 구동 소프트웨어가 지속적인 수집 및 압력 모니터링, 유속, 펄스 속도, 신호를 통합 있는지 확인합니다. 원하는 경우, 제 2 펌프를 사용하여 (비 동기화hronized) 비 층류, 난류를 생성한다.

3 EVPS 조립 (그림 1)

1. 시작하기 전에 모든 장비는 멸균 있는지 확인합니다. 층류 후드에서 무균 아래의 모든 다음 단계를 수행합니다.
2. 배지로 가득 배양 접시에있는 정맥을 놓습니다. 수술 블레이드를 사용하여 3 동일한 세그먼트로 정맥을 나눕니다.
3. 즉시 PBS에서 하나의 세그먼트를 씻어. , 세 부분으로 세그먼트를 분할 형태 계측을 위해 포르말린을 수정합니다. 양적 성적 증명서 (RT-PCR)와 단백질 (서양 얼룩) 분석을위한 다른 두 동결. 제어되지 않은 혈관 관류 이들 세그먼트를 고려한다.
4. 관류이 나머지 부분을 사용합니다.
   1. 아주 부드럽게 정맥 ​​매체를 주입하고 정상 유동 방향을 결정하고; 밸브의 존재 정맥이 반전됩니다.
   2. 혈관 씰링 실험 성공에 가장 중요합니다. 담보를 통해 누출을 점검한다. 6-0 실크 봉합과 누출을 고정합니다.
   3. 시간 (2.3, 그림 1)에서 정맥 두 개의 금속 실린더 사이의 세그먼트, 한 끝을 연결합니다. 들여 쓰기 (그림 1A 및 B)의 주위에 Ethibon 3-0로 실린더를 고정합니다.
      1. 이전에 매체 가득 관류 챔버로 전체 정맥 세그먼트를 배치합니다. 제 2 세그먼트에 대한 동일한 절차를 반복한다.
         제대로 실린더에 정맥을 밀봉하지 않으면이 누수의 원인이 될 것입니다 재 시술이 필요하며, 크게 감염과 실험 실패의 위험을 증가 : 주.
   4. 두 번째 세그먼트를 강화 (메쉬)하기 위해, L 모양의 조각 (2.3 및 그림 1)에서 (첨부 된 정맥 포함)이 실린더를 놓습니다.
      1. 온화하고 악기 정맥을 만지지 마십시오. 정맥에 다음 실린더에 먼저 메쉬를 밀어 넣습니다. 푸시 / 풀 흔들림과는 정맥에 메쉬를 얻을 것이다.
      2. 메쉬 커버 일단 정맥의 전체 표면은 J 확보Ethibon 3-0으로 실린더에 acketed 정맥.
      3. L 모양의 지원에 정맥 / 실린더 화합물을 재 조립 이전에 매체 가득 관류 챔버로 전송합니다.
   5. 3.2 mm의 내부 직경을 가진 과산화물 처리 된 실리콘 튜브를 이용하여 Y-스플리터 각 금속 실린더 (인 및 유출)을 연결한다.
   6. 튜브의 동일한 유형을 사용하여 초 Y-스플리터 유출 분배기를 연결한다. 이 Y-스플리터에서 모두 혈관을 통해 관류 압력을 측정하는 하나의 튜브를 사용한다. 폐쇄 루프 시스템 (그림 2)을 형성하기 위해 다시 열로 다른 하나를 연결합니다.
   7. 인큐베이터 내부 펌프 헤드에 압력 열을 연결하는 긴 (한-m 길이) 튜브를 사용합니다.
   8. 긴 다른 길이의 튜브 유입 Y-스플리터 펌프 헤드를 연결하여 설정 (도 1)를 완료한다.

   (4) 혈관 관류

   1. EVPS 조립체 공동 후에mpleted이 매체와 열을 채우기 (재충전 할 수 있도록 정맥 유출 덕트 미만을 유지). 시스템이 가득 찰 때까지 열에 더 많은 매체를 추가합니다. pH가 37 ± 0.1 ° C로 유지 인큐베이터에 모든 시스템을 이동은 (헨더슨 - Hasselbach 방정식을 기반으로 CO ₂ / 산도 알고리즘을 사용하여) 7.40 ± 0.01로 일정하게 유지.
   2. 인큐베이터 외부 기어 펌프 헤드를 가져오고 기어 펌프 드라이브에 연결합니다. 어셈블리를 고정하는 봉 나사.
   3. 펌프 전원 스위치,이 구동 소프트웨어에서 활성화되어 있는지 확인하고, 매체가 동등하게 모든 구획에 분산 될 때까지 5 분을 할 수 있습니다.
   4. 압력을 모니터하기 위해 동맥 라인 모니터링을 사용합니다. 컴퓨터에 연결된 압력 변환기에 EVPS 압 출력 (이 동맥 카테터에 대응)에 연결.
      1. 튜브가 완전히 매체로 가득하고 거품이 포함되어 있는지 확인합니다. "동맥 리를 통해 드 거품 배양 시스템을네브라스카 "튜브 (그림 2). 디스플레이에 주목하고 60 펄스 / 일정한 진폭의 분의 박동 지향성 신호를 찾습니다. 이 시점에서, 평균 압력은 0~10mm 수은 사이이다. 압력이 <0이고, 열이 점진적으로 (정맥 튜브 사이의 정맥 담보하거나 불충분 한 인) 누수를 찾아 비워합니다.
   5. 정맥 테스트 또는 동맥 테스트를위한 90mm 수은에 6mm 수은에 최소한의 압력을 설정합니다. 이러한 조건에서, 공기 분사기는 열 및 시스템에 필요한 압력을 적용한다.
   6. 압력 컬럼에 연결된 튜브를 사용하여 모든 이일 매체를 변경합니다. , 압력 변화의 손상을 방지 첫번째 열 플러그를 엽니 다.

   관류의 5 완료

   1. 관류의 3 ~ 7 일 후 : 인큐베이터 밖으로 EVPS을 가지고 정맥을 분리. 5mm의 근위부를 버리고 말초 정맥은 장비에 부착 종료합니다. 중앙, 5mm 두께 린을 잘라나머지 부문에서 GS와 포르말린 (형태 학적)에 고정한다. 나머지 조각을 동결하고 더 분자 분석을위한 분말로 줄일 수 있습니다.

결과

EVPS 인간 복재 정맥 리모델링하고 IH를 접목에 독립적으로 혈역학 적 힘을 평가하는 유용한 도구를 제공합니다.

그림 1은 관류 챔버와 정맥 지원을 보여줍니다. 도 1A 및도 B에서, 이전에 정맥 지지체 (도 1a) 및 후 (도 1B) 조립체는 각각 묘사된다. 그것은 쉽게 (왼쪽에서 오른쪽으로) 밀어 수 2 L 형상 조각 용 지지체로서 기능 9cm...

토론

이 연구는 인간의 혈관에 광범위한 혈역학 적 연구를 수행 할 수있는 생체 정맥 관류 시스템 (EVPS)을 알게되어. 이 시스템은 생체 내에서 세포를 순환시켜 출시 악화 염증과 성장 요인의 부재에서 정의 혈역학에서 복재 정맥 관류 할 수 있습니다. 따라서, 인간의 혈관 이식 ^5,11,12,15 IH에서의 제어에 관여하는 기본 경로의 더 나은 이해를 제공한다.

재현성?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 - Glutamax	Life Technologies	61870-010
Penicilline/Streptomycine/Fungizone	Bioconcept	4-02F00-H
Dextran from Leuconostoc spp. 500 g	Sigma-Aldrich	31390
Tampon PBS CHUV pH 7.1-7.3 1 L	Laboratorium und Grosse Apotheke Dr. G. Bichsel AG	100 0 324 00
Cryosectionning embedding medium - Tissue-Tek OCT Compound	Fisher Scientific	14-373-65
Silicon Tubing (Peroxide) L/S 16 (96400-16 ) - 7.5 m	Idex Health & Science GMBH	MF0037ST
Y-splitter	Idex Health & Science GMBH	Y-connector
35 mm Culture dish	Sigma-Aldrich	CLS430165-100EA
15 ml Falcon tube	BD Bioscence	352096
50 ml Falcon tube	BD Bioscence	352098
Gearing pump - Reglo-Z	Idex Health & Science GMBH	SM 895	App-Nr 03736-00194
Pump Head	Idex Health & Science GMBH	MI0008
Monitoring Kit TRANSPAC IV	icumedical	011-0J736-01
20 ml Syringes	B. Braun Medical SA	4612041-02
Etibon 3-0 FS-2	Ethicon- Johnson&Johnson	EH7346H
Mesh ProVena 6-8mm	B. Braun Medical SA	1105012-14
NaCl: Sodium chloride solution perfusion 0.9% (100 ml)	B. Braun Medical SA	534534
Masterflex L/S Standard Drive	Cole-Parmer Instrument Co	7521-10
Acquisition card	National Instruments	PCI-6024 E
Flowmeter module	Transonic Systems Inc.	TS410 and T402
Stopcock with 3-ways	BD Connexta Luerlock	394600
Millex Filter	Milian	SE2M229I04