Procédure pour saphènes humaines veines<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusion et renforcement externe

Résumé

Les mécanismes conduisant au développement de l'hyperplasie intimale (IH) et la veine échec de la greffe sont encore mal compris. Cette étude décrit un système ex vivo pour perfuser les veines humaines sous écoulement et pression contrôlée. En outre, l'efficacité de renforcement de maille externe pour limiter le développement d'IH a été évaluée.

Résumé

Le pilier de thérapies contemporaines pour une maladie étendue artérielle occlusive est pontage veineux. Cependant, sa durée de vie est menacé par une hyperplasie de l'intima (IH) qui mène éventuellement à une occlusion des vaisseaux et échec de la greffe. Les forces mécaniques, en particulier à faible contrainte de cisaillement et haute tension de la paroi, sont pensés pour initier et de soutenir ces changements cellulaires et moléculaires, mais leur contribution exacte reste à démêler. Pour évaluer de façon sélective le rôle de la pression et la contrainte de cisaillement sur ​​la biologie de IH, un ex vivo système de perfusion (EVP) a été créé pour perfuser les segments de veines saphènes humaines sous régime artérielle (stress de cisaillement élevé et haute pression). D'autres innovations techniques ont permis à la perfusion simultanée de deux segments de la même veine, on renforcé avec un maillage externe. Les veines ont été récoltées en utilisant une technique sans contact et immédiatement transférés au laboratoire pour le montage dans la EVP. Un segment de la isol fraîchementATED veine n'a pas été perfusé (contrôle, jour 0). Les deux autres segments ont été perfusés pendant jusqu'à 7 jours, un être complètement à l'abri avec un 4 mm (diamètre) maillage externe. La pression, la vitesse d'écoulement, et la fréquence du pouls ont été contrôlés en permanence et adaptés à reproduire les conditions hémodynamiques régnant dans l'artère fémorale. A la fin de la perfusion, les veines ont été démontées et utilisées pour l'analyse histologique et moléculaire. Sous conditions ex vivo, la perfusion à haute pression (artérielle, moyenne = 100 mm Hg) est suffisante pour générer IH et le remodelage des veines humaines. Ces altérations sont réduits en présence d'un filet de polyester externe.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de morbidité et de mortalité dans les pays occidentaux ^1. Malgré les progrès réalisés dans les traitements endovasculaires, la chirurgie de pontage reste le pilier de thérapies contemporaines, ainsi plus d'un demi-million de greffes veineuses sont effectuées chaque année aux États-Unis. Cependant, malgré des décennies de recherche, 30-60% de la baisse des greffes extrémité de la veine échouent dans les premières années en raison de l'hyperplasie intimale (IH) ^2. Les forces mécaniques, en particulier à faible contrainte de cisaillement (SS) et haute tension de la paroi, jouent un rôle essentiel dans l'initiation et le développement de cette réponse hyperplasique ^3,4. Pour résoudre ce problème, un ex vivo veines système de perfusion (EVP) a été généré pour étudier, dans des conditions strictement contrôlées hémodynamiques (pression et la contrainte de cisaillement), le comportement des veines saphènes humaines. Dans cette étude, après insertion dans la circulation artérielle analogue, l'hypertension (moyenne = 100 mm Hg) a été suffisant pour stimuler prolifration et la migration des cellules musculaires lisses dans l'intima (IH) ^5.

Études sur les mammifères ont suggéré l'utilisation du renforcement externe comme une méthode efficace pour soutenir la "veine artérialisée" et contrecarrer l'hémodynamique aigu change la veine faces une fois implanté dans un milieu artérielle. Le maillage empêché surdistension, des contraintes de cisaillement, et de réduire la tension de la paroi et par conséquent IH ^6-10. Cependant, les mécanismes sous-jacents et son applicabilité aux veines humaines dans l'amélioration de dérivation perméabilité n'ont pas été entièrement caractérisé. Nos EVP ont été utilisées pour comparer, dans un état imitant les modifications une veine visages fois inséré dans un régime artérielle (stress et de pression à cisaillement élevé), le comportement des veines saphènes humaines dans l'absence et la présence d'un macroporeuse maille polyester tubulaire externe. En empêchant le remodelage pathologique et IH, le maillage a fourni la preuve de son efficacité clinique potentielle ¹¹ .

Cette étude 1) présente un modèle ex vivo de veines saphènes humaines perfusion sous pression contrôlée et la contrainte de cisaillement 2) démontre que maille polyester macro-poreuse externe réduit IH et fournit des informations cruciales pour son application clinique potentielle.

Protocole

Le comité d'éthique de l'Université de Lausanne a approuvé les expériences, qui sont en conformité avec les principes énoncés dans la Déclaration d'Helsinki de 1975, tel que révisé en 1983 pour l'utilisation de tissus humains.

1. Human grande veine saphène récolte

1. Obtenir des segments de surplus de veines saphènes humaines non variqueuses de patients subissant une chirurgie de dérivation membre inférieur de l'ischémie. Dans la salle d'opération, de désinfecter l'ensemble de la jambe avec une solution d'iode et le drapé du patient pour exposer la jambe de l'aine au pied.
2. Faire une incision médiane de l'aine au genou (en laissant la partie interrompue de la peau).
3. Récolter la grande veine saphène avec un pédicule de ses environs (technique sans contact) de tissu. Sécurisés branches latérales des veines avec 4-0 cravates en soie. Stocker immédiatement d'au moins 9 cm de segments de surplus de temps de la plus grande veine saphène, avec un diamètre externe de 2,5 à 4 mm à 4 ° C dans un milieu RPMI-1640 Glutamax milieu, additionné de 12,5% de sérum de veau foetal et l'amener au laboratoire.

2 EVP Conception

1. Assembler l'équipement général de la figure 1. Autoclave tous les équipements et garder tous les composants dans des conditions stériles. En outre, s'assurer que le système est étanche et ne fuit pas de produits chimiques dans le milieu. Utilisez le polyméthacrylate de méthyle (PMMA-GS) pour la couverture. Acier (X5 Cr Ni 18 10) et de polyoxyméthylène en plastique (POM) et le support de la veine.
2. Conception de la chambre de perfusion à la géométrie souhaitée pour permettre le placement de la veine et de sa connexion. Assurez-vous que la profondeur (ou le rayon si vous utilisez construction cylindrique) est d'au moins 2,5 cm de sorte qu'il permet une flexion minimale et dilatation du vaisseau ainsi que la couverture constante par les milieux de culture (Figure 1). L'étanchéité est un problème majeur et c'est la raison rectangulaire construction PMMA-GS est utilisé.
3. Concevoir le soutien de la veine à la geometr souhaitéey. Afin d'éviter le vrillage de la veine ou plus de distension, permettre le réglage de la longueur de poussée ou de traction (vis ne peut être utilisé à cet effet, que la veine soit tordu le long de la vis).
   REMARQUE: Une tige en acier plein relié par 2 pièces coulissantes en forme de L qui prennent en charge les deux cylindres de la veine (5 mm de diamètre pour s'adapter à la cuve) et la veine (figure 1B et figure 2) est utilisé ici.
4. Conception de la colonne de pression, de telle sorte que la "pression de repos» appliquée au système est la suivante: p = 0-10 = hx ρ xg, où p = pression (N / m ^2, Pa) h = hauteur de la colonne de fluide (m) ρ = masse volumique du liquide (kg / m ^3), et g = l'accélération de la pesanteur (9,81 m / s ^2). Conception quatre conduits de raccordement, de haut en bas: à appliquer une pression, pour la sortie (de la veine), l'entrée (à la veine) et de permettre changement de milieu.
5. Préparer le milieu. Basé sur des études antérieures ^5,11-14, choisissez RPMI-1640, complétée par Glutamax, 12,5% De sérum de veau foetal, et une solution d'antibiotique-antimycotique à 1% (10 000 U / ml de pénicilline G, ainsi que 10 mg / ml de sulfate de streptomycine, plus 25 mg / ml d'amphotéricine B, plus 0,5 ug / ml de gentamycine):. La contrainte de cisaillement (SS) est donnée par SS = 4 μQ / π * r ³ Q représente le débit (ml / sec), r le rayon (cm) du segment de veine, et μ est la viscosité du milieu de perfusion.
   1. Moduler SS en ajustant la viscosité par addition de 70 kDa dextran. Mesure de la viscosité avec un viscosimètre. Ici, ajouter 8% de dextran 70 kDa pour définir SS à 9-15 dyn / cm ^2.
6. Mettre la pompe à engrenage pour induire un signal cardioïde pulsatile de 60 impulsions / min et amplitude constante à générer un flux unidirectionnel de 150 ± 15 ml / min, indépendante de la pression appliquée dans le système et commandé par un ordinateur. Assurez-vous que le logiciel de pilotage intègre l'acquisition constante et la surveillance des pressions, vitesse d'écoulement, la fréquence du pouls, et le signal. Si vous le souhaitez, utiliser une deuxième pompe (non synchronisationhronized) pour produire un non-laminaire, l'écoulement turbulent.

3. Assemblée EVP (Figure 1)

1. Avant de commencer, assurez-vous que tout le matériel est stérile. Effectuez toutes les étapes suivantes sous asepsie dans une hotte à flux laminaire.
2. Placez la veine dans une boîte de Pétri remplie avec le milieu. Utilisez une lame chirurgicale et diviser la veine en 3 segments égaux.
3. Rincer immédiatement un segment dans du PBS. Diviser le segment en 3 parties, fixer un dans le formol pour la morphométrie. Congeler les deux autres pour la transcription quantitative (RT-PCR) et de protéines (western blot) analyse. Tenez compte de ces segments en tant que témoin, non veine perfusée.
4. Utiliser les deux segments restants de la perfusion.
   1. Injecter très doucement moyen dans la veine et déterminer le sens d'écoulement normale; en présence de la veine soupapes est inversée.
   2. Sceller les veines est d'une importance capitale pour le succès expérimental. Vérifier les fuites à travers collatéraux. Fixez les fuites avec 6-0 points de suture de soie.
   3. Connectez le segment de veine entre les deux cylindres métalliques, une extrémité à la fois (2.3, Figure 1). Fixer les cylindres avec Ethibon 3-0 autour des indentations (figure 1A et B).
      1. Placer le segment veineux ensemble dans la chambre de perfusion préalablement remplie avec un milieu. Répétez la même procédure pour le deuxième segment.
         REMARQUE: une panne de bien sceller la veine de la bouteille sera une source de la fuite, nécessite une réintervention, et augmenter de façon significative le risque d'infection et d'insuffisance expérimentale.
   4. Pour renforcer (mesh) du deuxième segment, de libérer les deux cylindres avec la veine (ci-joint) des pièces en forme de L (2.3 et figure 1).
      1. Soyez doux et ne pas toucher la veine avec des instruments. Faites glisser la maille d'abord sur le cylindre puis sur la veine. Une bousculade push / pull obtiendra le maillage sur la veine.
      2. Une fois que le maillage couvre toute la surface de la veine assurer la jveine acketed aux cylindres avec Ethibon 3-0.
      3. Réassembler le composé veine / cylindre sur le support en forme de L et le transférer à la chambre de perfusion, préalablement remplie avec un milieu.
   5. Connecter chaque cylindre métallique (et en sortie) à un séparateur en Y en utilisant un tube de silicone traitée avec du peroxyde d'un diamètre intérieur de 3,2 mm.
   6. Raccorder la sortie à un deuxième séparateur séparateur en Y à l'aide du même type de tube. De ce répartiteur en Y, utiliser un tube pour mesurer la pression de perfusion à travers les deux navires. Connectez l'autre à la colonne pour former un système en boucle fermée (Figure 2).
   7. A l'intérieur de l'incubateur, utiliser un long (d'un mètre de longueur) pour connecter le tube de la colonne de pression à la tête de la pompe.
   8. Remplissez le mettre en place en reliant la tête de la pompe à l'entrée Y-splitter avec un autre tube de grande longueur (Figure 1).

   4 veines perfusion

   1. Après l'assemblée EVP a été completed, remplir la colonne avec le milieu (rester en dessous de la veine conduit d'évacuation pour permettre le remplissage). Ajouter plus moyen dans la colonne jusqu'à ce que le système est plein. Déplacer tout le système dans l'incubateur maintenu à 37 ± 0,1 ° C avec un pH maintenu constant à 7,40 ± 0,01 (en utilisant un algorithme de CO ₂ / pH sur la base de l'équation de Henderson-Hasselbach).
   2. Apportez la tête de pompe à engrenage extérieur de l'incubateur et le connecter à l'entraînement de la pompe à engrenages. Visser les tiges pour fixer l'ensemble.
   3. Mettez la puissance de la pompe, assurez-vous qu'il est activé sur le logiciel de pilotage et permet 5 min à moyen et à répartir de façon égale dans tous les compartiments.
   4. Pour contrôler la pression, utilisez un contrôle de la ligne artérielle. Raccorder la sortie de pression d'EVP (il correspond à cathéter artériel) pour le transducteur de pression relié à l'ordinateur.
      1. Assurez-vous que le tube est entièrement remplie de fluide et ne contient pas de bulles. De-bulles, le système de culture à travers le "li artérielne "tube (Figure 2). Faites attention à l'écran et de regarder pour un signal cardioïde pulsatile de 60 impulsions / min d'amplitude constante. A ce stade, la pression moyenne est comprise entre 0 à 10 mm Hg. Si la pression est <0 et la colonne vide progressivement rechercher une fuite (veine collatérale ou joint insuffisant entre la veine et le tube).
   5. Régler la pression minimale de 6 mm Hg pour un test veineuse ou à 90 mm Hg pour un test artérielle. Dans ces conditions, un injecteur d'air applique la pression nécessaire à la colonne et le système.
   6. Changer le milieu tous les 2 jours en utilisant le tube relié à la colonne de pression. Pour éviter d'endommager le changement de pression, ouvrir le bouchon de la première colonne.

   5. achèvement de la perfusion

   1. Après 3 ou 7 jours de perfusion: prendre les EVP sur l'incubateur et démonter les veines. Jeter le 5 mm proximale et distale veine extrémités fixées à l'équipement. Couper, un rin 5 mm d'épaisseur centralegs du segment restant et fixer dans du formol (morphométrie). Geler les fragments restants et réduire en poudre pour d'autres analyses moléculaires.

Résultats

L'EVP est un outil précieux pour évaluer de manière indépendante les forces hémodynamiques sur la veine saphène humaine greffe remodelage et IH.

La figure 1 montre la chambre de perfusion et le support de la veine. Dans les figures 1A et B, le soutien de la veine avant (figure 1A) et après (figure 1B) assemblage, respectivement, sont représentés. Il se compose (de haut en bas) de 1 brut tube en ...

Discussion

Cette étude révèle une ex vivo système veine de perfusion (EVP) d'effectuer des études approfondies hémodynamiques dans les veines humaines. Ce système permet de veines saphènes sous perfusion des paramètres hémodynamiques déterminées en l'absence de facteurs aggravants inflammatoires et de la croissance libérés par les cellules circulantes in vivo. Ainsi, il permet une meilleure compréhension des voies sous-jacents impliqués dans le contrôle de IH dans les veines humaines gref...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 - Glutamax	Life Technologies	61870-010
Penicilline/Streptomycine/Fungizone	Bioconcept	4-02F00-H
Dextran from Leuconostoc spp. 500 g	Sigma-Aldrich	31390
Tampon PBS CHUV pH 7.1-7.3 1 L	Laboratorium und Grosse Apotheke Dr. G. Bichsel AG	100 0 324 00
Cryosectionning embedding medium - Tissue-Tek OCT Compound	Fisher Scientific	14-373-65
Silicon Tubing (Peroxide) L/S 16 (96400-16 ) - 7.5 m	Idex Health & Science GMBH	MF0037ST
Y-splitter	Idex Health & Science GMBH	Y-connector
35 mm Culture dish	Sigma-Aldrich	CLS430165-100EA
15 ml Falcon tube	BD Bioscence	352096
50 ml Falcon tube	BD Bioscence	352098
Gearing pump - Reglo-Z	Idex Health & Science GMBH	SM 895	App-Nr 03736-00194
Pump Head	Idex Health & Science GMBH	MI0008
Monitoring Kit TRANSPAC IV	icumedical	011-0J736-01
20 ml Syringes	B. Braun Medical SA	4612041-02
Etibon 3-0 FS-2	Ethicon- Johnson&Johnson	EH7346H
Mesh ProVena 6-8mm	B. Braun Medical SA	1105012-14
NaCl: Sodium chloride solution perfusion 0.9% (100 ml)	B. Braun Medical SA	534534
Masterflex L/S Standard Drive	Cole-Parmer Instrument Co	7521-10
Acquisition card	National Instruments	PCI-6024 E
Flowmeter module	Transonic Systems Inc.	TS410 and T402
Stopcock with 3-ways	BD Connexta Luerlock	394600
Millex Filter	Milian	SE2M229I04